מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03NS131908) ומשרד ההגנה באמצעות תוכנית המחקר לטרשת נפוצה תחת פרס מס 'W81XWH-22-1-0517. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחבר ואינן בהכרח מאושרות על ידי משרד ההגנה. מחקר זה נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת מזרח קרוליינה.

כל ההליכים המערבים עכברים בוצעו בהתאם להנחיות הניסוי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (IACUC). במחקר זה נעשה שימוש בנקבות עכברי Wildtype C57BL/6J בגילאי 8-10 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). EAE הושרה בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 12,13,14.
1. קולקציית סרום
<ol><li>הרדימו את עכבר הניסוי על ידי חנקCO2 או מנת יתר של איזופלורן בנקודת הזמן הנדרשת (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) לאחר השראת EAE באמצעות חיסון MOG35-55. הערה: המספר הכולל של עכברים ונקודות זמן לאיסוף נסיוב יכול להשתנות בהתאם לניסוי הספציפי.</li>
	<li>לאחר היעדר סימנים חיוניים הוא אישר על ידי צביטת הבוהן או הזנב, מניחים את העכבר במצב שכיבה גבי על מגש דיסקציה ומדביקים את הגפיים במקומו עם סיכות או קלטת. כוון את גוף העכבר למקור אור LED (ראה טבלת חומרים) כדי להאיר את בית החזה של החיה.</li>
	<li>רססו את פרוות העכבר באתנול 70% ובצעו חתך בקו האמצע של 3-4 ס"מ לאורך הבטן מהאגן ועד לקסיפואיד באמצעות מספריים לכריתה, תוך הקפדה להימנע מכל איברים וכלי דם עיקריים (איור 1A-C). כדי להקל על ההליך, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את העור על תהליך xiphoid.</li>
	<li>חתכו דרך הסרעפת לרוחב ואז חתכו את כלוב הצלעות קדמית בשני הקצוות הרוחביים באמצעות מספריים קפיציים, ועצרו לפני שתגיעו לעצם החזה בקו האמצע (איור 1D). קפלו את דש הצלעות שנוצר מעל ראש העכבר כדי לחשוף את הלב (איור 1E). הערה: יש להימנע מחיתוך עצם החזה מכיוון שהדבר יפגע בעורקי החזה הראשיים הסמוכים לעצם ויקטין את נפח הדם שניתן לאסוף.</li>
	<li>הכניסו מחט של 25 גרם שמחוברת למזרק של 1 מ"ל לחדר השמאלי ואספו את הדם על-ידי משיכה עדינה לאחור של הבוכנה (איור 1F). כדי להקל על ניקוב המחט, סד בעדינות את הלב נגד זוג מלקחיים. הערה: אם הדם אינו מופיע מיד לתוך המזרק, המחט צריכה להיות מסובבת לאט, זווית אחרת יש לבדוק. עם זאת, יש לעשות מאמצים למקם את המחט כראוי בניסיון הראשון כדי למנוע יצירת חורים מיותרים בלב שבהם הדם יכול לדלוף החוצה.</li>
	<li>מעבירים את הדם לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל ומאפשרים לו להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הקריש על ידי צנטריפוגה ב 2000 × גרם למשך 20 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנטנט, המייצג את מקטע הסרום, ואחסנו אליציטוטים חד-פעמיים בצינורות קריוגניים בטמפרטורה של -80°C לבדיקות עתידיות.</li>
</ol>2. בדיקת אליסה
<ol><li>יש להשהות מחדש את הפפטיד MOG35-55 שעבר ליופיליזציה (ראו טבלת חומרים) במים כדי לקבל מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. לפני תחילת הניסוי, יש לדלל את הציר ל-10 מיקרוגרם/מ"ל בחיץ ציפוי (ראו טבלת חומרים) ופיפטה 100 מיקרוליטר/באר של התמיסה הסופית לצלחת בת 96 בארות. אטמו את הצלחת בסרט הדבקה כדי למנוע אידוי ודגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. הערה: יש לחשב לפחות 2 בארות עבור כל מדגם ולכלול גם 2 בארות נוספות עבור בקרה ריקה.</li>
	<li>במקביל, צפו את אותו מספר בארות ב-100 מיקרוליטר/באר של אלבומין בסרום בקר (BSA) המומס בחיץ ציפוי בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל. בארות נוספות אלה ישמשו כבקרות רקע. הערה: מומלץ לצפות עם BSA את בארות הבקרה מכיוון שלמאגרי הציפוי והחסימה יש הרכבים שונים. שים לב כי פפטידים אנצפליטוגניים אחרים (כגון PLP139-151 או MBP84-104) יכולים לשמש כאנטיגנים לא רלוונטיים כחלופה ל- BSA.</li>
	<li>ביום שאחרי, שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של מלח חיץ פוספט בתוספת 0.05% Tween 20 (PBS-T). לאחר מכן, יש להוסיף 100 μL/well של תמיסת חסימה העשויה מ-3% BSA ב-PBS (ללא Tween 20) ולדגור על הצלחת אטומה למשך שעה אחת ב-37°C בתנור הכלאה.</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. יש לדלל כל דגימת סרום ביחס 1:100 בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL/well הן לבארות מצופות MOG35-55 והן לבארות מצופות BSA. הוסף את אותו נפח של פתרון חסימה לבארות המיועדות ריקות. דוגרים על הצלחת אטומה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. לדלל את הנוגדן המשני המצומד HRP (1:2000, ראה טבלת חומרים) בתמיסה העשויה 0.2% BSA ב- PBS-T ולהוסיף 100 μL / באר לכל הבארות. יש לדגור על הצלחת אטומה למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).</li>
	<li>שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. הוסף 100 μL / באר של מצע 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB) (ראה טבלת חומרים) לכל הבארות ודגר בחושך במשך 1-5 דקות, מעקב אחר התפתחות של צבע כחול.<ol><li>עצור את התגובה על ידי הוספת 100 μL/well של תמיסת עצירה (ראה טבלת חומרים) ומדידת הצפיפות האופטית (OD) בכל באר באמצעות קורא לוחות המוגדר באורך גל של 450 ננומטר. הערה: מצע TMB צריך להיות מאוזן בטמפרטורת החדר במשך 30-60 דקות לפני הוספתו לבארות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>אכלס גיליון אלקטרוני של Excel בערכי OD שנקראו מהצלחת. ממוצע ערכי OD המתקבלים מבארות כפולות (הן MOG35-55 והן BSA מצופה) עבור כל דגימה.</li>
	<li>עבור כל דגימה, הפחת את הערך הממוצע של הבארות מצופות BSA מזה של בארות מצופות MOG35-55. ערכי הרקע המתוקנים שיתקבלו יהיו פרופורציונליים לריכוז נוגדנים נגד MOG35-55 בדגימות הסרום השונות. הערה: בארות ריקות אמורות לגרום לערכים מתוקנים סביב 0.</li>
	<li>החל מבחן סטטיסטי לא פרמטרי כגון מבחן Mann-Whitney U כדי להשוות את ערכי OD ממוצעים בין שני תנאי ניסוי. כלול לפחות 3 דגימות בלתי תלויות עבור כל מצב.</li>
</ol>

חקירת תגובה הומורלית בדמיאלינציה אוטואימונית

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

כאן, דווח על פרוטוקול פשוט ויעיל מבוסס ELISA כדי לכמת במדויק את התגובה ההומורלית במודל חייתי רלוונטי של פתולוגיה של טרשת נפוצה. שיטה זו שימשה לאחרונה לתיאור התפקיד החדש של חלבון אטקסין-1 בשליטה על רמות הנוגדנים העצמיים בסרום בפרדיגמת MOG35-55/C57BL6J EAE12. בהקשר זה, יש לקחת בחשבון מספר גו?...

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה מוקדית של תאי מערכת החיסון לפרנכימה במוח, פירוק נדן המיאלין העוטף אקסונים, הפעלת גליה ואובדן עצבי1. בנוסף לתפקיד המבוסס היטב של תאי T פתוגניים, קווי ראיות רבים הדגישו את מעורבותם של תאי B בתיווך התגובה האוטואימונית נגד מערכת העצבים המרכזית. תאי B עוברים התרחבות שבטית במוח הטרשת הנפוצה ונוגדנים כנגד מרכיבי המיאלין התגלו בתוך נגעים מיוצרים 2,3. ההפעלה הסלקטיבית של תאי B היקפיים עם תחילת המחלה תועדה לאחרונה, דבר המצביע על תפקיד משוער לתא חיסוני זה גם בהתחלת מחלה4. ההצלחה של טיפולים מדללי תאי B כגון נוגדנים חד-שבטיים נגד CD20 מאששת עוד יותר את הקשר המכניסטי בין תפקוד חריג של תאי B לבין דמיאלינציה אוטואימונית 5,6. מנקודת מבט מולקולרית, תאי B יכולים לתרום למחלה באמצעות הצגת אנטיגן עצמי, הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים וייצור נוגדנים אוטו-ריאקטיביים.
מודלים רבים של בעלי חיים פותחו כדי לשחזר תכונות ספציפיות של פנוטיפ הטרשת הנפוצה המורכב. ביניהם, אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא פרדיגמת in vivo הנפוצה ביותר ומסתמכת על חיסון של חיות ניסוי עם פפטידים קצרים הנגזרים מחלבוני מיאלין כגון גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים במיאלין (MOG) וחלבון בסיסי מיאלין (MBP)7. בעלי חיים מחוסנים של EAE מפתחים פתולוגיה דה-מיאלינציה הדומה לטרשת נפוצה בהיבטים רבים, כולל תגובה הומורלית חזקה נגד הפפטיד אנצפליטוגני8. מסיבה זו, מחקרי EAE סייעו לנתח את תפקודם של תאי B ונוגדנים עצמיים בהקשר של מחלה. לדוגמה, הוכח כי נוגדנים ספציפיים ל-MOG שבודדו מחולי טרשת נפוצה יכולים להחמיר את המהלך הקליני במודלים9 של EAE. יש לציין כי שאריות הפרולין במיקום 42 ב-MOG האנושי הוכחו כקריטיות לקביעת פתוגניות הנוגדנים העצמיים10. לאחרונה, נוגדנים עצמיים ספציפיים ל-MOG נמצאו כמקדמים מחלות לא רק על ידי תיווך אובדן מיאלין, אלא גם על ידי הגברת ההפעלה מחדש של תאי T אוטו-ריאקטיביים בתוך מערכת העצבים המרכזית11. 
בהתחשב בחשיבות של תגובות נוגדנים באוטואימוניות CNS, מאמר זה מציג פרוטוקול מבוסס ELISA למדידה יעילה של רמות הנוגדנים האוטו-תגובתיים בסרום בעכברי C57BL/6J EAE שחוסנו בפפטיד MOG35-55. בחלק הראשון של הפרוטוקול תתואר השיטה לאיסוף סרום באמצעות ניקוב תוך לבבי. לאחר מכן, יפורטו הנהלים להקמת בדיקת ELISA ורכישת הנתונים. לבסוף, יידונו ניתוח נתונים ופרשנותם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל מחלה המשחזר את ההפרעה האוטואימונית טרשת נפוצה (MS) ברמה היסטופתולוגית ומולקולרית. EAE מושרה על ידי חיסון חיות ניסוי באמצעות הזרקה תת עורית של פפטידי מיאלין קצרים יחד עם אדג'ובנטים ספציפיים כדי להגביר את התגובה החיסונית. בדומה למקבילו האנושי, עכברי EAE מפתחים נגעים דה-מיאלינטינג, חדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS), הפעלת גליה ופגיעה עצבית. גוף עקבי של ראיות תומך גם בתפקיד מכניסטי לתפקוד לקוי של תאי B באטיולוגיה של טרשת נפוצה ו- EAE. תאי B יכולים לשמש כתאים מציגי אנטיגן, כמו גם מקור עיקרי של ציטוקינים מעודדי דלקת ונוגדנים עצמיים. ב- EAE, נוגדנים נוצרים כנגד פפטידים של המיאלין ששימשו לגרימת המחלה. נוגדנים עצמיים כאלה הוכחו כמתווכים אובדן מיאלין או הפעלה מחדש של תאי T פתוגניים למערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל מבוסס ELISA לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין 35-55 (MOG35-55). השיטה המוצעת משמשת כלי רב עוצמה לחקר הספציפיות והעוצמה של התגובה ההומורלית החריגה בהקשר של דמיאלינציה אוטואימונית.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

מחבר זרקור: מחקר חדשני לחקר תגובות תאי B במחקר טרשת נפוצה

כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

כדי להדגים את החוסן של בדיקת ELISA הנוכחית, השיטה נבדקה על דגימות סרום שבודדו מעוקבה של עכברות C57BL/6J לאחר 20 יום לאחר החיסון (dpi) עם 100 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) בעקבות פרוטוקול אינדוקציה מאומת של EAE 12,13,14. החיות קיבלו גם 400...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעל חיים של טרשת נפוצה (MS), אשר חולק עם המחלה האנושית תגובה אוטואימונית הומורלית חזקה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול ELISA פשוט וגמיש לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברים מחוסנים EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

לכן המעבדה שלנו מתמקדת בהבנת הבסיס המולקולרי של טרשת נפוצה, מחלה חיסונית של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בדמיאלינציה, דלקת עצבית ופגיעה אקסונלית. כך שפרוטוקול זה מייצג אלטרנטיבה חסכונית וגמישה לערכות מסחריות. ניתן להתאים אותנו בקלות לבדיקת תגובות נוגדנים של תאי B כנגד פפטידים שונים באזור הכלכלי האירופי.המעבדה שלי מוקדשת להבנה נוספת של הקשר בין דלקת עצבית וניוון עצבי במחלות נוירולוגיות כרוניות כמו טרשת נפוצה.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 Views.  East Carolina University. לכן המעבדה שלנו מתמקדת בהבנת הבסיס המולקולרי של טרשת נפוצה, מחלה חיסונית של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בדמיאלינציה, דלקת עצבית ופגיעה אקסונלית. כך שפרוטוקול זה מייצג אלטרנטיבה חסכונית וגמישה לערכות מסחריות. ניתן להתאים אותנו בקלות לבדיקת תגובות נוגדנים של תאי B כנגד פ...

Video: מחבר זרקור: מחקר חדשני לחקר תגובות תאי B במחקר טרשת נפוצה

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

איסוף סרום באמצעות ניקוב תוך לבבי בעכברים מחוסנים ניסיוניים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE)

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.