تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R03NS131908) ووزارة الدفاع من خلال برنامج أبحاث التصلب المتعدد بموجب الجائزة رقم W81XWH-22-1-0517. الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلف ولا تقرها بالضرورة وزارة الدفاع. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل صناديق بدء التشغيل بجامعة شرق كارولينا.

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية التجريبية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة شرق كارولينا (IACUC). تم استخدام إناث الفئران Wildtype C57BL / 6J بين 8-10 أسابيع من العمر في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تحفيز EAE بعد التقارير المنشورة سابقا12،13،14.
1. جمع المصل
<ol><li>القتل الرحيم للفأر التجريبي عن طريق الاختناق CO2 أو جرعة زائدة من الأيزوفلوران في النقطة الزمنية المطلوبة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) بعد تحفيز EAE عبر التحصين MOG35-55. ملاحظة: يمكن أن يختلف العدد الإجمالي للفئران والنقاط الزمنية لجمع المصل وفقا للتجربة المحددة.</li>
	<li>بعد تأكيد عدم وجود علامات حيوية عن طريق قرصة إصبع القدم أو الذيل ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الظهري على صينية تشريح وألصق الأطراف في موضعها بدبابيس أو شريط. قم بتوجيه جسم الماوس إلى مصدر ضوء LED (انظر جدول المواد) لإلقاء الضوء على صدر.</li>
	<li>رش فرو الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بعمل شق في خط الوسط من 3-4 سم على طول البطن من الحوض إلى الخنجري باستخدام مقص التشريح ، مع الحرص على تجنب أي أعضاء وأوعية رئيسية (الشكل 1A-C). لتسهيل الإجراء ، استخدم الملقط للإمساك بالجلد فوق عملية الخنجري.</li>
	<li>قطع الحجاب الحاجز بشكل جانبي ثم قطع القفص الصدري من الأمام على كلا الحواف الجانبية باستخدام مقص الربيع ، والتوقف قبل الوصول إلى القص عند خط الوسط (الشكل 1 د). قم بطي رفرف الضلع الذي تم إنشاؤه فوق رأس الماوس لكشف القلب (الشكل 1E). ملاحظة: يجب تجنب قطع القص لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الشرايين الصدرية الرئيسية المجاورة للعظم وتقليل حجم الدم الذي يمكن جمعه.</li>
	<li>أدخل إبرة 25 G متصلة بحقنة 1 مل في البطين الأيسر واجمع الدم عن طريق سحب المكبس برفق (الشكل 1F). لتسهيل ثقب الإبرة، ثبت القلب برفق ضد زوج من الملقط. ملاحظة: إذا لم يظهر الدم على الفور في المحقنة ، فيجب تدوير الإبرة ببطء ، ويجب اختبار زاوية مختلفة. ومع ذلك ، يجب بذل الجهود لوضع الإبرة بشكل صحيح في المحاولة الأولى لتجنب إنشاء ثقوب غير ضرورية في القلب حيث يمكن أن يتسرب الدم.</li>
	<li>انقل الدم إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل واتركه يتجلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الجلطة عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، التي تمثل جزء المصل ، وقم بتخزين القسامات ذات الاستخدام الواحد في أنابيب مبردة عند -80 درجة مئوية للاختبار في المستقبل.</li>
</ol>2. مقايسة إليسا
<ol><li>أعد تعليق الببتيد MOG35-55 المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) في الماء للحصول على مخزون 10 مجم / مل. قبل البدء في التجربة ، قم بتخفيف المخزون إلى 10 ميكروغرام / مل في محلول الطلاء (انظر جدول المواد) وماصة 100 ميكرولتر / بئر من المحلول النهائي في لوحة 96 بئرا. أغلق اللوحة بغشاء لاصق لتجنب التبخر واحتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: يجب حساب بئرين على الأقل لكل عينة ويجب أيضا تضمين بئرين إضافيين للتحكم الفارغ.</li>
	<li>في موازاة ذلك ، قم بتغطية نفس العدد من الآبار ب 100 ميكرولتر / بئر من ألبومين مصل الأبقار (BSA) المذاب في محلول الطلاء بتركيز 10 ميكروغرام / مل. ستكون هذه الآبار الإضافية بمثابة عناصر تحكم في الخلفية. ملاحظة: يوصى بطلاء آبار التحكم باستخدام BSA نظرا لأن الطلاء والمخازن المؤقتة للحظر لها تركيبات مختلفة. يرجى ملاحظة أنه يمكن استخدام الببتيدات الدماغية الأخرى (مثل PLP139-151 أو MBP84-104) كمستضدات غير ذات صلة كبديل ل BSA.</li>
	<li>في اليوم التالي ، اغسل الطبق 3 مرات ب 200 ميكرولتر / بئر من محلول ملحي عازل للفوسفات مكمل ب 0.05٪ توين 20 (PBS-T). بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول مانع مصنوع من 3٪ BSA في PBS (بدون Tween 20) واحتضان اللوحة محكمة الغلق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن التهجين.</li>
	<li>اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. خفف كل عينة مصل 1: 100 في محلول مانع وأضف 100 ميكرولتر / بئر إلى كل من الآبار المطلية ب MOG35-55 و BSA. أضف نفس الحجم من محلول الحجب إلى الآبار المخصصة كفراغات. احتضان اللوحة مختومة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز مستمر (250 دورة في الدقيقة).</li>
	<li>اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP (1: 2000 ، انظر جدول المواد) في محلول مصنوع من 0.2٪ BSA في PBS-T وأضف 100 ميكرولتر / بئر إلى جميع الآبار. احتضان اللوحة مختومة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز مستمر (250 دورة في الدقيقة).</li>
	<li>اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. أضف 100 ميكرولتر / بئر من ركيزة 3,3 '، 5,5' رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) (انظر جدول المواد) إلى جميع الآبار واحتضانها في الظلام لمدة 1-5 دقائق ، ومراقبة تطور اللون الأزرق.<ol><li>أوقف التفاعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من محلول التوقف (انظر جدول المواد) وقياس الكثافة الضوئية (OD) في كل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوط بطول موجي 450 نانومتر. ملاحظة: يجب موازنة ركيزة TMB في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة قبل إضافتها إلى الآبار.</li>
	</ol></li>
</ol>3. تحليل البيانات
<ol><li>قم بتعبئة جدول بيانات Excel بقيم OD المقروءة من اللوحة. متوسط قيم OD التي تم الحصول عليها من الآبار المكررة (كل من MOG35-55 و BSA المغلفة) لكل عينة.</li>
	<li>لكل عينة ، اطرح متوسط قيمة الآبار المطلية ب BSA من قيمة الآبار المطلية MOG35-55. ستكون القيم المصححة الناتجة متناسبة مع تركيز الأجسام المضادة المضادة ل MOG35-55 في عينات المصل المختلفة. ملاحظة: يجب أن تؤدي الآبار الفارغة إلى قيم مصححة حول 0.</li>
	<li>قم بتطبيق اختبار إحصائي غير معلمي مثل اختبار Mann-Whitney U لمقارنة متوسط قيم OD بين حالتين تجريبيتين. قم بتضمين 3 عينات مستقلة على الأقل لكل حالة.</li>
</ol>

دراسة الاستجابة الخلطية في إزالة الميالين المناعية الذاتية

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وفعال قائم على ELISA لتحديد الاستجابة الخلطية بدقة في نموذج حيواني ذي صلة لأمراض التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لوصف الدور الجديد لبروتين ataxin-1 في التحكم في مستويات مصل الأجسام المضادة الذاتية في نموذج MOG35-55 / C57BL6J EAE12. في هذا ا...

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتميز بالتسلل البؤري للخلايا المناعية إلى حمة الدماغ ، وانهيار أغماد المايلين التي تغلف محاور عصبية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، وفقدان الخلايا العصبية1. بالإضافة إلى الدور الراسخ للخلايا التائية المسببة للأمراض ، سلطت خطوط متعددة من الأدلة الضوء على تورط الخلايا البائية في التوسط في استجابة المناعة الذاتية ضد الجهاز العصبي المركزي. تخضع الخلايا البائية للتوسع النسيلي في دماغ مرض التصلب العصبي المتعدد وتم اكتشاف الأجسام المضادة ضد مكونات المايلين داخل الآفات المنزوعة الميالين 2,3. تم مؤخرا توثيق التنشيط الانتقائي للخلايا البائية المحيطية في بداية المرض ، مما يشير إلى دور مفترض لحجرة الخلايا المناعية هذه في بدء المرض أيضا4. يؤكد نجاح العلاجات المستنفدة للخلايا البائية مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل CD20 العلاقة الميكانيكية بين عمل الخلايا البائية الشاذة وإزالة الميالين المناعي الذاتي 5,6. من وجهة نظر جزيئية، يمكن أن تسهم الخلايا البائية في الإصابة بالمرض عن طريق عرض مولد الضد الذاتي، وإفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات، وإنتاج الأجسام المضادة ذاتية التفاعل.
تم تطوير نماذج حيوانية متعددة لتلخيص السمات المحددة للنمط الظاهري المعقد لمرض التصلب العصبي المتعدد. من بينها ، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو الأكثر استخداما في نموذج الجسم الحي ويعتمد على تحصين التجارب بالببتيدات القصيرة المشتقة من بروتينات المايلين مثل البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) وبروتين المايلين الأساسي (MBP)7. تطور المحصنة EAE أمراضا مزيل للميالين تشبه مرض التصلب العصبي المتعدد في العديد من الجوانب ، بما في ذلك الاستجابة الخلطية القوية ضد الببتيدالدماغي 8. لهذا السبب ، كانت دراسات EAE مفيدة في تشريح وظيفة الخلايا البائية والأجسام المضادة الذاتية في سياق المرض. على سبيل المثال ، ثبت أن الأجسام المضادة الخاصة ب MOG المعزولة من مرضى التصلب العصبي المتعدد يمكن أن تؤدي إلى تفاقم المسار السريري في نماذج EAE9. والجدير بالذكر أن بقايا البرولين في الموضع 42 في MOG البشري تبين أنها حاسمة لتحديد إمراضية الأجسام المضادةالذاتية 10. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على الأجسام المضادة الذاتية الخاصة ب MOG لتعزيز المرض ليس فقط عن طريق التوسط في فقدان المايلين ولكن أيضا عن طريق تعزيز إعادة تنشيط الخلايا التائية ذاتية التفاعل داخل الجهاز العصبيالمركزي 11. 
بالنظر إلى أهمية استجابات الأجسام المضادة في المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا قائما على ELISA لقياس مستويات مصل الأجسام المضادة ذاتية التفاعل بكفاءة في الفئران C57BL / 6J EAE المحصنة بببتيد MOG35-55. في الجزء الأول من البروتوكول ، سيتم وصف طريقة جمع المصل عن طريق ثقب داخل القلب. بعد ذلك ، سيتم تفصيل إجراءات إعداد اختبار ELISA والحصول على البيانات. أخيرا ، سيتم مناقشة تحليل البيانات وتفسيرها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض يلخص اضطراب المناعة الذاتية التصلب المتعدد (MS) على المستويات النسيجية والجزيئية. يتم تحفيز EAE عن طريق تحصين التجارب عن طريق الحقن تحت الجلد من ببتيدات المايلين القصيرة مع مواد مساعدة محددة لتعزيز الاستجابة المناعية. مثل النظير البشري ، تصاب الفئران EAE بآفات مزيل للميالين ، وتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتنشيط الخلايا الدبقية وإصابة الخلايا العصبية. تدعم مجموعة متسقة من الأدلة أيضا دورا ميكانيكيا لخلل الخلايا البائية في مسببات كل من MS و EAE. يمكن أن تعمل الخلايا البائية كخلايا مقدمة لمولد الضد، وكذلك مصدرا أساسيا للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات والأجسام المضادة الذاتية. في EAE ، يتم إنشاء الأجسام المضادة ضد ببتيدات المايلين التي تم استخدامها للحث على المرض. وقد ثبت أن هذه الأجسام المضادة الذاتية تتوسط إما فقدان المايلين أو إعادة تنشيط الخلايا التائية المسببة للأمراض في الجهاز العصبي المركزي. توضح هذه المقالة بروتوكولا فعالا قائما على ELISA لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران C57BL / 6J المحصنة بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55). تعمل الطريقة المقترحة كأداة قوية للتحقيق في خصوصية وحجم الاستجابة الخلطية الشاذة في سياق إزالة الميالين المناعي الذاتي.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

تسليط الضوء على المؤلف: مقايسة جديدة لدراسة استجابات الخلايا البائية في أبحاث التصلب المتعدد

القياس الكمي للأجسام المضادة ذاتية التفاعل في الفئران عند التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

لإثبات متانة اختبار ELISA الحالي ، تم اختبار الطريقة على عينات المصل المعزولة من مجموعة من الفئران الإناث C57BL / 6J في 20 يوما بعد التحصين (dpi) مع 100 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) بعد بروتوكول تحريض EAE تم التحقق من صحته12،13،14. ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني للتصلب المتعدد (MS) ، والذي يشترك مع المرض البشري في استجابة مناعة ذاتية خلطية قوية. هنا ، نبلغ عن بروتوكول ELISA بسيط ومرن لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران المحصنة EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

لذا فإن تركيز مختبرنا هو فهم الأساس الجزيئي للتصلب المتعدد ، وهو مرض مناعي يصيب الجهاز العصبي المركزي ويتميز بإزالة الميالين والتهاب الأعصاب وإصابة المحور العصبي. لذلك يمثل هذا البروتوكول بدائل اقتصادية ومرنة للمجموعات التجارية. يمكن تعديلنا بسهولة لاختبار استجابات الأجسام المضادة للخلايا البائية ضد ببتيدات المنطقة الاقتصادية الأوروبية المختلفة.مختبري مكرس لفهم العلاقة بين الالتهاب العصبي والتنكس العصبي في الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 Views.  East Carolina University. لذا فإن تركيز مختبرنا هو فهم الأساس الجزيئي للتصلب المتعدد ، وهو مرض مناعي يصيب الجهاز العصبي المركزي ويتميز بإزالة الميالين والتهاب الأعصاب وإصابة المحور العصبي. لذلك يمثل هذا البروتوكول بدائل اقتصادية ومرنة للمجموعات التجارية. يمكن تعديلنا بسهولة لاختبار استجابات الأ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: مقايسة جديدة لدراسة استجابات الخلايا البائية في أبحاث التصلب المتعدد

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

جمع المصل عن طريق ثقب داخل القلب في الفئران المحصنة التجريبية لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE)

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.