עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130113), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204765), קרן מדעי הטבע של סצ'ואן (2022NSFSC1470), פרויקט מימון מיוחד לפוסט-דוקטורט במחוז סצ'ואן (TB2023020) והתוכנית לקידום מחקר מלגות Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (BSH2021030). קרנות אלה מספקות תמיכה במונחים של ציוד ניסיוני, חומרים ניסיוניים ודמי פרסום.

1. הכנה
<ol><li>הכנת דוגמאות<ol><li>השתמש במאזן רגישות של 1/10,000 כדי לשקול 0.25 גרם (משקל יבש) של APB בצינור מיקרוצנטריפוגה של 3 מ"ל, הוסף 2.5 מ"ל מתנול ולאחר מכן בצע סוניקציה למשך 30 דקות (הספק 240 W, תדר 40 kHz).</li>
		<li>בצע צנטריפוגה ב 1.2 x גרם במשך 5 דקות, לאסוף את supernatant, ולסנן דרך מסנן ממברנה עם גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת חומרים ניסיוניים<ol><li>הכינו את הפאזה הניידת הדו-ממדית, השתמשו באצטוניטריל כשלב B האורגני, והגדירו מים אולטרה-טהורים עם חומצה פורמית 0.1% כשלב A המימי.</li>
		<li>בצע סינון דו-פאזי (0.22 מיקרומטר) ובצע סוניזציה באמצעות מכשיר אולטרסאונד (40 קילוהרץ) למשך 15 דקות. נקה את השלב הנייד שהוחלף כדי להסיר את הבועות. בניסוי זה, עמוד C18 שימש כטור 1D, הטור ההידרופילי כטור 2D, והטור הורכב על המכשיר.</li>
	</ol></li>
	<li>התאמת יחס השאנט המתאים<ol><li>חבר את קו היציאה של מכשיר 2D-LC דרך טי לכניסת המסה ואת הקצה השני של הטי לקו שמוט. התאם את קצב הזרימה לערך מתאים כדי להבטיח שקצב הזרימה לספקטרום המסה הוא 0.3-0.5 מ"ל/דקה. הערה: מכיוון שהממד השני של 2D-LC מוגדר בדרך כלל מעל 2 מ"ל/דקה, קצב זרימה זה גדול מדי עבור MS, ולכן יש צורך לבצע פיצול.</li>
	</ol></li>
</ol>2. פעולת 2D-LC
<ol><li>לחץ פעמיים על סמל Instrument 1 Online , ותחנת העבודה הכימית תתקשר באופן אוטומטי עם 1260 LC ותכנס לתחנת העבודה.</li>
	<li>להגדרת פרמטר שיטת 2D-LC, בחר במסך שיטה והפעל בקרה מתפריט תצוגה כדי להפעיל את הממשק הרצוי, שיוזן בדרך כלל כברירת מחדל. לחץ על מודול המזרק, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שיטה, הגדר את נפח ההזרקה, קצב הזרימה ושיפוע זמן הפאזה הנייד של משאבת 1D.</li>
	<li>הזן את זמן הריצה לדוגמה תחת זמן עצירה. לחץ על התפריט הראשי מכשיר ולחץ על שיטת 2D-LC בתפריט הנפתח. בחר מקיף במצב 2D-LC. הזן 2 דקות בזמן אפנון, 1.9 דקות בזמן עצירה הדרגתית דו-ממדית. הגדר את הגדרות הזרימה ל- 2 מ"ל. ערוך מעבר צבע דו-ממדי והגדר לאורכי גל. לאחר עריכת השיטה, בחר Save Method As בתפריט Method כדי לתת שם לשיטה החדשה, ולחץ על OK. הערה: משאבת ההעברה החיצונית דורשת הגדרה ידנית של קצב הזרימה.</li>
</ol>3. פעולת טרשת נפוצה
<ol><li>הפעל את המתג של משאבת הוואקום. פתח את השסתום הראשי של גליל הארגון ואת שסתום מחלק הלחץ והתאם את הלחץ לכ- 0.3 מגפ"ס. פתח את שסתום החנקן.</li>
	<li>המתן לפחות 8 שעות כדי להבטיח ואקום מספיק לתנאי ניסוי. בדוק כי לחץ האוויר של ארגון וחנקן גבוה מספיק לפני הניתוח.</li>
	<li>כדי להפעיל את תוכנת הבקרה של MS, לחץ על מקור SEI חימום בלוח התוכנה והזן את הפרמטרים של MS, כולל טמפרטורת החימום (350 ° C), קצב זרימת הנדן (35 arb), קצב זרימת אוויר עזר (15 arb), מתח ריסוס (3.8 KV במצב חיובי, -2.5 KV במצב שלילי) וטמפרטורה נימית (275 ° C). לחץ על הלחצן החל כדי להפעיל את מקור היונים.</li>
	<li>כדי להגדיר את שיטת MS, הזן ערכים להגדרת זמן רכישה, קוטביות, טווח מסה, מספר ערך העברה, משך ערך העברה ועוד. הגדר זמן ריצה של MS (דקות): 93.00. הגדרת פרטי ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c נורמה Dep MS/MS, יון אינטנסיבי ביותר מ (1): סוג הפעלה: CID, מינימום אות נדרש: 500, רוחב בידוד: 2.00, קול' מנורמל. אנרגיה: 35.0, מצב טעינה ברירת מחדל:3, הפעלה Q: 0.250, זמן הפעלה: 93.000. כדי להגדיר הגדרות תלויות נתונים, השתמש בהגדרות קוטביות נפרדות כמושבתות, אובדן ניטרלי בחלק העליון:3, המוצר למעלה: 3. לחץ על שמור כדי להגדיר את ההגדרות כשיטת המכשיר. הערה: סוף זמן הפעולה תואם ל-2D-LC.</li>
	<li>לחץ על הלחצן Sequence Setup כדי לפתוח את טבלת הרצפים. הזן את סוג הדגימה, שם הקובץ, הנתיב, מזהה הדגימה, שיטת המכשיר, המיקום, כמות ההזרקה ומידע נוסף בטופס.</li>
	<li>לחץ על להציל כפתור כדי להקליט את רישום הרצף, ולאחר מכן לחץ על התחל ניתוח כפתור כדי להגדיר ולהתחיל רכישת MS. לחץ על Run Control במכשיר 2D-LC ובחר Run Method. במקביל, מכשיר MS גם לוחץ על כפתור הפעלה . הערה: מאחר ש-2D-LC ו-MS אינם נשלטים על-ידי אותה תוכנה בניסוי זה, יש להתקין אותם בשני המכשירים בנפרד.</li>
</ol>4. פעולת רשת מולקולרית
<ol><li>הכנת נתונים: ייצוא נתונים ספקטרליים גולמיים מסוג 2D-HPLC-MS והמרת נתונים ספקטרליים משניים לנתוני mzXML או mzML באמצעות Msconvert של ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).</li>
	<li>כדי להעלות נתונים, הורד את תוכנת WinSCP באתר הרשמי והעלה נתוני mzML לחשבון שנוצר על ידי GNPS באמצעות פרוטוקול FTP. לאחר השלמת ההתקנה, הפעל את WinSCP.</li>
	<li>התחברות לשרת FTP GNPS: בממשק WinSCP, בדף תצורת הפעלה , מלא את פרטי החיבור הבאים: פרוטוקול קובץ: בחר FTP. עבור Hostname: הזן massive.ucsd.edu., עבור מספר יציאה: שמור על 22 ברירת המחדל.</li>
	<li>הזן את מספר החשבון והסיסמה. לאחר מילוי המידע לעיל, לחץ על הלחצן Login כדי ליצור חיבור לשרת GNPS FTP.</li>
	<li>צור רשתות מולקולריות על ידי פתיחת דפדפן אינטרנט וביקור באתר האינטרנט של GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). משתמשים חדשים צריכים להירשם לחשבון ולאחר מכן להיכנס.</li>
	<li>בממשק הראשי של אתר האינטרנט של GNPS, לחץ על הכרטיסייה משימות בסרגל הניווט העליון ובחר צור משימה חדשה מהתפריט הנפתח. בדף יצירת המשימות, לחץ על הלחצן הוסף קבצים ולאחר מכן בחר והעלה את קובץ הנתונים. (למשל, פורמט mzML).</li>
	<li>בכרטיסייה פרמטרים של משימה, הגדר את הפרמטרים השונים היוצרים את MN. פרמטרים אלה כוללים אלגוריתם מיצוי שיא, ערך overtravel שיא, שיטת חישוב דמיון וכו '. בצע את הגדרות הפרמטרים המתאימות לפי הצורך. לחץ על לחצן הפעל ניתוח בתחתית הדף כדי להפעיל את המשימה.</li>
	<li>לאחר הפעלת המשימה, אתר את המשימה שנוצרה ברשימת המשימות ולחץ על שם השירות כדי להציג את תוצאות הניתוח. האתר מספק דיאגרמות MN, תחליפים, רשתות סימביוטיות ומידע קשור אחר.</li>
</ol>

ניתוח APB צמחי מרפא טיבטי באמצעות 2D-HPLC-MS עם רשת מולקולרית

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המוקד העיקרי של ניסוי זה היה אופטימיזציה של שיטה חלקית במסגרת הפרדת פאזות נוזליות דו-ממדיות. כדי להשיג זאת, אפנן דילול חדשני בעמודה שולב בצורה חלקה במערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית הדו-ממדית (2D-LC). התאמה טכנית זו הייתה בעלת חשיבות עליונה מכיוון שהיא העלתה באופן משמעותי את המיומנות בפרופיל המרכ?...

הרפואה הטיבטית היא חלק בלתי נפרד מהרפואה הסינית המסורתית, תוך דבקות בעקרונות הרפואה הטיבטית, ומשמשת למניעת מחלות ולטיפולבהן 1. עם זאת, צמחי מרפא טיבטיים מכילים מרכיבים כימיים צמחיים מורכבים המאופיינים בתנודות משמעותיות בתוכן. הבנה מוגבלת של היסודות הביו-אקטיביים הבסיסיים הפכה לצוואר בקבוק במודרניזציה של הרפואה הטיבטית2. היישום של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS), המשלבת את כוח ההפרדה החזק של הכרומטוגרפיה עם הרגישות הגבוהה של ספקטרומטריית מסות (MS), נמצא בשימוש נרחב בניתוח רפואה טבעית3. עם זאת, בשל מגבלתו של מנגנון הפרדה יחיד, רכיבים בעלי מבנים דומים מאוד נוטים להתלכד בהפרדת כרומטוגרפיה נוזלית חד-ממדית. באנליזה ספקטרומטרית מסה עוקבת, קשה לזהות את הרכיבים בעלי השפע הנמוך עקב דיכוי יונים הנגרם על ידי רכיבים בעלי שפע גבוה4.
2D-HPLC, ראשי תיבות של כרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית בעלת ביצועים גבוהים, מייצגת שיטה כרומטוגרפית חדשנית המשלבת בהרמוניה מנגנוני הפרדה שונים באמצעות זוג עמודות. זה כולל היתוך או החלפה של כרומטוגרפיה בשלב רגיל עם כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך ואינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה5. על ידי מיזוג תכונות כרומטוגרפיות משלימות אלה, מושגת יכולת ההפרדה המשופרת, הנותנת מענה יעיל לאתגרים הנגרמים על ידי מטריצות מדגם מורכבות6. יתר על כן, על ידי צימוד כרומטוגרפיה דו-ממדית עם טרשת נפוצה, ניתן לשלב באופן מלא את יכולת ההפרדה החזקה של 2D-HPLC ואת יכולת זיהוי הרגישות הגבוהה של טרשת נפוצה, ולספק תמיכה בחקר מערכות תרופות מורכבות ומרכיביהן הבסיסיים 7,8,9.
הרפואה הטיבטית כוללת בדרך כלל מערך רב פנים של רכיבים ופונקציונליות, כאשר החומרים הפעילים קיימים בדרך כלל בהרכבים מורכבים ובריכוזים מינימליים. על ידי שילוב 2D-LC כמערכת הפרדה חזקה וטרשת נפוצה כגלאי רגיש במיוחד, ניתן לטפל בצורה יעילה יותר באתגרים שמציבות דגימות מורכבות במונחים של הפרדה וזיהוי 10,11,12. מיזוג זה תורם באופן משמעותי לקידום חקר ההרכב הכימי של הרפואה הטיבטית.
לא משנה אם זה LC-MS מסורתי או 2D-LC-MS, כמות עצומה של מידע ניתן להשיג. עם זאת, חילוץ מידע מבני של רכיבי מערכת מורכבים מכמות מסיבית זו של מידע תמיד היה אתגר משמעותי. לכן, חוקרים פיתחו שיטות שונות לסינון וכריית נתוני טרשת נפוצה. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) היא פלטפורמת ארגון נתונים והדמיה של MS/MS שבה ניתן להעלות נתוני ספקטרומטריית מסה 2D-LC-MS13. כל ספקטרום נחשב כווקטור ומושווה לכל הספקטרום האחר באמצעות דמיון קוסינוס (cosine similar). כאשר הדמיון בין שני ספקטרום עולה על סף, הם מחוברים ברשת מולקולרית (MN). זה יכול לשמש לזיהוי מהיר של תרכובות ידועות וקביעת מוצרים טבעיים שונים לא ידועים14.
לרפואה הטיבטית יש בדרך כלל תפקידים מרובים, אך הרכבה המורכב והבדלי הריכוז המשמעותיים מקשים על בירור יעיל של הקשר בין תפקוד לבסיס חומרי15 . מחקר מעמיק של הרפואה הטיבטית מחייב אפיון שיטתי של כמה שיותר מרכיבים. במסגרת מחקר זה, בכוונתנו להשתמש ב-APB ברפואה הטיבטית כמושא המחקר כדי להדגים את האסטרטגיה והתהליך של לימוד שיטתי של המרכיבים הכימיים המורכבים של הרפואה הטיבטית באמצעות טכנולוגיית 2D-HPLC-MS וטכנולוגיית MN. בבניית המערכת הכרומטוגרפית הדו-ממדית, שילבנו כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה וכרומטוגרפיה נוזלית עם אינטראקציה הידרופילית עם מנגנוני הפרדה משמעותיים כדי להשיג הפרדה יעילה יותר של המרכיבים המורכבים של APB16. בנוסף, כדי להתגבר על חוסר תאימות ממס בין שני הממדים, אומץ מצב אפנון דילול בעמודה. על ידי שילוב יכולת ההפרדה רבת העוצמה של 2D-LC עם יכולת זיהוי הרגישות הגבוהה של טרשת נפוצה, המידע הספקטרלי של הרכיבים המורכבים ב- APB מתקבל בצורה יעילה ומקיפה יותר. יתר על כן, באמצעות הרשת והדמיה של מידע ספקטרלי מסיבי על ידי טכנולוגיית MN, רכיבי APB מנותחים באופן שיטתי. האסטרטגיה והתהליך שהודגמו במחקר זה צפויים להיות מיושמים בחקר תרופות טיבטיות אחרות, ולקדם את המחקר על הבסיס החומרי של הרפואה הטיבטית, שהוא בעל משמעות רבה לקידום משאבי הרפואה הטיבטית ולשיפור תקני בקרת האיכות של צמחי מרפא טיבטיים17. תהליך הניסוי הכולל מוצג באיור 1.
בניסוי המוצג כאן, אפנן דילול חדש בעמודה הוכנס למערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית הדו-ממדית האג'ילינטית (2D-LC)18. על ידי הוספת משאבת אספקה עצמאית, נתיב הזרימה של הניתוח השתנה, וכתוצאה מכך אורתוגונליות גבוהה של ניתוח 2D-LC. הצימוד והמעבר בין שני הממדים מתבצעים באמצעות שני שסתומים בעלי שש יציאות, כפי שמוצג באיור 2. כאשר לולאת דגימה אחת מתמלאת בממד הראשון, לולאת דגימה נוספת מנותחת בממד השני. משמעות הדבר היא שזמן המילוי של הלולאה ה-1D וזמן הריצה של הדו-ממד שווים. זה דורש את השיפוע המהיר שנוצר על ידי המשאבה הבינארית בממד השני. לא הולכים לאיבוד פסגות כאשר מנתחים את כל הקולחים. זה מועיל במיוחד לניתוח של דגימות לא ידועות. התוצאה היא מספר רב של כרומטוגרמות דו-ממדיות שיש לשלב לצורך ניתוח נתונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

במחקר זה נעשה שימוש בגישה מקיפה, תוך שימוש בטכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם הרשת המולקולרית כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי APB. באמצעות יישום של 2D-HPLC, הושגה הפרדה משופרת של תערובות מורכבות, המאפשרת בידוד של תרכובות בודדות לניתוח הבא. גישת הרשת המולקולרית סייעה עוד יותר בהבהרת היחסים המבניים בין תרכובות אלה, ותרמה לקביעת מולקולות ביו-אקטיביות פוטנציאליות. אסטרטגיה משולבת זו זיהתה ביעילות מגוון רחב של רכיבים כימיים הקיימים במפעל. הממצאים חשפו ספקטרום מגוון של מרכיבים כימיים בתוך APB, כולל אלקלואידים, בין היתר. מחקר זה לא רק מקדם את הבנת הפרופיל הפיטוכימי של רפואה טיבטית מסורתית זו, אלא גם מספק תובנות חשובות לגבי תכונותיה הטיפוליות הפוטנציאליות. השילוב של 2D-HPLC-MS ורשת מולקולרית מוכיח את עצמו ככלי רב עוצמה לחקירה שיטתית וזיהוי הרכבים כימיים מורכבים בתרופות צמחיות, וסולל את הדרך למחקר ופיתוח נוספים בתחום גילוי מוצרים טבעיים.

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

מחבר זרקור: שילוב 2D-HPLC-MS ורשתות מולקולריות בניתוח רפואה טבעית

טכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב רשת מולקולרית לזיהוי רכיבים ברפואה הטיבטית מטוטלת אקוניטום

In this study, we employed a comprehensive approach utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. We want to establish a more efficient method for identifying the chemical composition of natural medicines. The main challenging of the current experiments is that the mass spectrometry section is not equipped with high-resolution mass spectrometry, resulting in the detection of different components.2D-LC-MS enables more accurate identification and the quantification of the compounds. Complex mixtures based on sample separation, combined with molecular network technology, it can be better process complex data information and it improves the efficiency and the accuracy of any size. Our laboratory will focus applying existing technologies to get the separation of natural, medicinal, chemical components.

APB שימש כאורגניזם מודל כדי לאמת את ההיתכנות של טכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם שיטת MN. על ידי ייבוא הנתונים הגולמיים של MS לתוך MN עם הפרמטרים מוגדרים כברירת מחדל, MN נוצר. MN היא אסטרטגיה חישובית חזותית הממחישה את כל היונים המולקולריים שזוהו בניסוי LC-MS-MS-MS מלא ואת היחסים הכימיים בין יונים מולקולריי?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Integrating 2D-HPLC-MS and Molecular Networking in Natural Medicine Analysis at JoVE.com

מחקר זה משתמש בטכנולוגיה דו-ממדית בעלת ביצועים גבוהים של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (2D-HPLC-MS) בשילוב עם רשתות מולקולריות כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי Aconitum pendulum Busch (APB). המאמר מספק פרוטוקול מפורט לחקירה שיטתית וזיהוי של רכיבים כימיים מורכבים של תרופות צמחיות.

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

במחקר זה, השתמשנו בגישה מקיפה המשתמשת בטכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם רשתות מולקולריות כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי APB. אנחנו רוצים לבסס שיטה יעילה יותר לזיהוי ההרכב הכימי של תרופות טבעיות. האתגר העיקרי של הניסויים הנוכחיים הוא שהחלק של ספקטרומטריית המסות אינו מצויד בספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה, וכתוצאה מכך מתגלה רכיבים שונים.2D-LC-MS מאפשר זיהוי וכימות מדויקים יותר של התרכובות. תערובות מורכבות המבוססות על הפרדת דגימות, בשילוב עם טכנולוגיית רשת מולקולרית, ניתן לעבד טוב יותר מידע נתונים מורכב וזה משפר את היעילות והדיוק של כל גודל. המעבדה שלנו תתמקד ביישום טכנולוגיות קיימות כדי לקבל הפרדה של רכיבים טבעיים, רפואיים, כימיים.

2d-hplc-ms-technology-combined-with-molecular-network-for

Research

JoVE Journal

Medicine

2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

297 Views.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. במחקר זה, השתמשנו בגישה מקיפה המשתמשת בטכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם רשתות מולקולריות כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי APB. אנחנו רוצים לבסס שיטה יעילה יותר לזיהוי ההרכב הכימי של תרופות טבעיות. האתגר העיקרי של הניסויים הנוכחיים הוא שהחלק של ספקטרומטריית המס?...

Video: מחבר זרקור: שילוב 2D-HPLC-MS ורשתות מולקולריות בניתוח רפואה טבעית

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.

Sample Preparation for 2D-HPLC-MS of Aconitum pendulum

Begin sample preparation by weighing the aconitum pendulum bush, or APB. Using a one by 10, 000 sensitivity balance, weigh 0.25 grams of dry APB in a three milliliter micro centrifuge tube. Add 2.5 milliliters of methanol to it and then sonicate for 30 minutes at a power of 240 watts and a frequency of 40 kilohertz.Centrifuge the sonicated sample at 1.2G for five minutes, and collect the supernatant. Filter it through a 0.22 micron membrane filter. Next, prepare the two-dimensional mobile phase by using acetyl nitrile as the organic phase or phase B, and ultra pure water containing 0.1%formic acid as the aqueous phase or phase A.After performing two-phase filtration through the 0.22 micron filter, subject the mobile phases to ultrasonic sonication at 40 kilohertz for 15 minutes.Purge the replaced mobile phase to remove the bubbles. Select a C18 column as the 1D column and a hydrophilic column as the 2D column, and mount them to the instrument. To adjust the appropriate shunt ratio, connect the 2D-LC instrument outline through a T to the mass inlet and the other end of the T to a shunted line.Adjust the flow rate to a suitable value to ensure the appropriate flow rate for the mass spectrum.

הכנה לדוגמה עבור 2D-HPLC-MS של מטוטלת Aconitum

Implementing 2D-Liquid Chromatography on Aconitum pendulum Samples for Enhanced Compound Separation

To begin the 2D liquid chromatography, or 2DLC, double-click the instrument one online icon, and the chemical workstation will automatically communicate with the 1260LC and enter the workstation. For the 2DLC method parameter setting, click on the Injector module, right-click Method and set the injection volume, flow rate, and mobile phase time gradient of the 1D pump. Enter the sample runtime under Stop Time.Click on the main menu instrument and click 2DLC Method on the dropdown menu. Select Comprehensive in 2DLC mode. Enter two minutes at modulation time and 1.9 minutes at 2D gradient stop time.Set flow settings to two milliliters. Edit 2D gradient and set wavelengths. After editing the method, select Save Method As on the method menu to name the new method, and click OK.

יישום כרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית על דגימות מטוטלת אקוניטום להפרדת תרכובות משופרת

Mass Spectrometry Following the 2D-LC Operation on Aconitum pendulum Samples

To begin, turn on the switch of the vacuum pump. Open the argon cylinder main valve and the pressure divider valve, and adjust the pressure to about 0.3 megapascals. To set up the MS method, enter the runtime in minutes to 93.00 and enter values to configure acquisition time, polarity, mass range, transfer value number, transfer value duration, and more.Set up scan event details according to the values displayed on the screen. To set data dependent settings, use separate polarity settings as disabled. Set neutral loss within top to three, and product mass list within top to three.Save to configure the settings as the instrument method. Click the sequence setup button to open the sequence table. Enter the sample type, file name, path, sample id, instrument method, location, injection amount, and other information in the form.Save the information to record the sequence listing. Then click the start analysis button to set up and start MS acquisition.

ספקטרומטריית מסות בעקבות הפעולה הדו-ממדית-LC על דגימות מטוטלת אקוניטום

Integration of Molecular Network Operation to 2D-HPLC-MS for the Analysis of Aconitum pendulum Samples

To begin the data preparation, export 2D HPLC-MS raw mass spectral data. Next to connect to the GNPS FTP server in the WINSCP interface on the Session Configuration page, fill in the connection information. After filling in the information, click the Start button to establish a connection to the GNPS FTP server.Create molecular networks by opening a web browser and visiting the GNPS website. New users need to sign up for an account and then log in. On the main interface of the GNPS website, click Create Molecular Network under Data Analysis.On the Task Creation page, click the select Input Files button, then select and upload the data file. In the Workflow Option tabs, set the various parameters that generate the molecular network or MN.These parameters include the peak extraction algorithm, peak over travel value, similarity calculation method, and so on. After making the appropriate parameter settings as needed, click the Submit button at the bottom of the page to run the task.After the task runs, find the created tasks in the Jobs tab and click the workflow name to view the analysis results. The website provides MN diagrams, substitutes, symbiotic networks, and other related information. Four of the alkaloid components in the APB samples identified by the MN were aconitine, 14-benzoylaconine, 14-O-acetylneoline and hypaconitine.The four compounds had the same parent nucleus. Aconitine, 14-benzyl aconine, 14-benzoylaconine, and hypaconitine were similar, and only the substituents were different.