עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי KAKENHI Grants JP22K15795 (ל- T.F.), JP22K09734 (ל- N.K.), JP21K07489 (לר.י.), האוניברסיטה הרפואית של קאנאזאווה (C2022-3, D2021-4, לר.י.) וקרן נאיטו (ל- T.F).

פרוטוקול זה נערך בהתאם לעקרונות המנחים של החברה הפיזיולוגית של יפן וקיבל אישור מוועדת הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קאנאזאווה (2021-32). כל ההליכים נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE. עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 3-6 חודשים) שימשו למחקר, ובעבר אושר כי עכברים אלה הציגו את התנהגויות התעופה המתוארות בכתב ידזה 15.
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>עכברי בית קבוצתיים (3-4 לכלוב; נשמר בטמפרטורה של 23-27 מעלות צלזיוס; במחזור אור/חושך של 12 שעות; סיפק גישה למזון ומים) עד תחילת הניסויים.</li>
	<li>יש לשכן כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס (14 ס"מ × 21 ס"מ × 12 ס"מ) למשך 3 ימים לפחות לפני שיעבור את התניית הפחד השונה.</li>
</ol>2. הגדרת הכלים/ציוד
<ol><li>קופסת התניה של פחד (איור 1A)<ol><li>יש להשתמש בתא התניה לפחד (25 ס"מ × 25 ס"מ × 25 ס"מ) הסגור בקופסה מחלישת קול (67 ס"מ × 53 ס"מ × 55 ס"מ) (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>נדרשים שני הקשרים (A ו-B). בהקשר A, צרו פסים שחורים ולבנים על הקירות על ידי הצמדת קרטון פלסטיק לבן עם סרטים שחורים (3 ס"מ רוחב, 4 על לוח). השתמשו בלוח פלסטיק לבן וחלק לרצפה.</li>
		<li>נגבו את הקירות והרצפה עם הפטנול (1%) לפני כל מפגש. הערה: לא נעשה שימוש במערכת אוורור פעילה. ניקוי עם אלכוהול בסוף הפגישה מפחית את ריח הפטנול.</li>
		<li>בהקשר B, הפוך את המראה של קירות לשחור לחלוטין על-ידי הסרת הלוח המשמש בהקשר A. הרצפה היא רצפת רשת. הערה: לא מוצג ריח ספציפי מלבד ריח אלכוהול קל לניקוי.</li>
		<li>האר את קופסת הניסוי באמצעות דיודה פולטת אור לבנה עילית (LED, 240 לוקס) (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>שוקר<ol><li>חברו שוקר ערבול (ראו טבלת חומרים) לרצפת רשת המורכבת ממוטות נירוסטה. זה משמש כדי לספק זעזועים ברגל. עוצמת ההלם בכף הרגל נקבעה על 0.9 מיליאמפר בעקבות השיטות הנפוצות של התניה של פחד 10,11,12,13.</li>
	</ol></li>
	<li>מחולל אודיו<ol><li>הניחו רמקול (ראו טבלת חומרים) על התקרה. כל הגירויים האקוסטיים מועצמים.</li>
		<li>שנה וכייל דיגיטלית את המשרעת הכוללת של כל גירוי כדי להפיק רמות לחץ קול (SPL, re: 20 μ Pa) בחזית 5 ס"מ של הרמקול עם מיקרופון בגודל 1/4 אינץ'. הציגו טון רציף שפרץ דרך הדובר הזה. הערה: כיול רמקול הקול חיוני כדי לבחון את ההשפעה העדינה של גירוי קול על התנהגויות הגנתיות במהלך התניה שונה זו של פחד.</li>
	</ol></li>
	<li>מתמר<ol><li>הניחו את רצפת תא הבדיקה על מתמר (ראו טבלת חומרים) לזיהוי רטט. האות מהמתמר מועבר לכרטיס קול עם תדר דגימה של 8 קילוהרץ כדי להקליט את התנודות ההתנהגותיות.</li>
	</ol></li>
	<li>מצלמת וידאו<ol><li>מקם מצלמת CMOS (ראה טבלת חומרים) על התקרה כדי לעקוב אחר תנועות הנושא ולהקליט את הצליל בקופסת ההתניה.</li>
	</ol></li>
	<li>מערכת הפעלה<ol><li>השתמש בתוכנת קול (ראה רשימת חומרים) להפעלת צלילים או זעזועי רגל בתזמונים מתוזמנים. הערה: כל ממריץ זמין מסחרית יעבוד עבור זה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניסוי התנהגותי
<ol><li>תכננו ארבעה ימים של הליכי התניה של פחד: התרגלות (יום אחד, 5 ניסויים), התניה (יומיים, 5 ניסויים כל אחד) ומפגשי בדיקה/הכחדה (יום אחד, 5 או 15 ניסויים). מרווחי הזמן בין הניסויים נעו בין 60 ל-75 שניות (איור 1B). הערה: רצוי לכלול עשרה נבדקים או יותר בקבוצה כדי להשיג נטיות התנהגותיות אמינות. שתיים או שלוש קבוצות נדרשות בהתאם למטרת המחקר.<ol><li>במהלך מפגש ההתניה, הציגו את הגירוי הבלתי מותנה (US) (1 שניות, 0.9 מיליאמפר) מיד לאחר סיום הגירוי המותנה (CS) (פרץ טון רציף, 8 קילוהרץ, 20 שניות, 95 dB SPL) כפי שמוצג באיור 1B. ספק חמישה זוגות CS-US ביום התניה.</li>
		<li>לאחר סיום שוק הרגל החמישי, השאירו את הנושא בהקשר למשך דקה אחת לפני החזרתו לכלוב הביתי. נגבו את התא ב-70% אלכוהול לניקוי לאחר כל מבחן התנהגותי. הערה: ניתן לשנות את עוצמת מדעי המחשב ואת עוצמת US בהתאם למטרת המחקר. דיווחים קודמים הראו כי עוצמת CS חזקה יותר מפעילה התנהגויות הגנתיות אקטיביות יותר מאשר התנהגויות רכותיותר 15. ניתן גם להאריך את ימי ההתניה.</li>
	</ol></li>
	<li>עודד התנהגויות טיסה במהלך מצגות CS בהתאם ללוח הזמנים המוזכר להלן. הערה: CS (95 dB SPL) ו- US (0.9 mA) משמשים בניסוי זה.<ol><li>ביום הראשון, חשוף את הנבדקים ל-5 ניסויים במדעי המחשב בלבד בהקשר A.</li>
		<li>בימים 2 ו-3, התנינו נבדקים עם 5 ניסויי אסוציאציה CS-US בהקשר B.</li>
		<li>ביום הרביעי, חשוף את הנבדקים ל-5 ניסויי CS בלבד למפגש ההיזכרות בהקשר B. במקרה של בדיקת הכחדת זיכרון, חשוף את הנבדקים ל-15 ניסויים במדעי המחשב בלבד. הערה: כדי לבדוק את יציבות הזיכרון, הארכת מפגשי ההכחדה למשך 2-3 ימים תעזור. כמו כן, בדיקת זיכרון שבוע לאחר מכן במקום ביום 4 יכולה לספק אישור נוסף ליציבות הזיכרון.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח התנהגויות הגנתיות
הערה: תנועת, אחוז הקפיאה ומספר הקפיצות במהלך מצגות CS מנותחים. הפרטים מתוארים להלן. אם אפשר, ניתוח בצורה כפולת סמיות יהיה טוב יותר.
<ol><li>סנכרן את תזמוני האירועים בסרטון ואת תזמוני הגירויים (CS ו- US) באמצעות תחילת הטון שהוקלטה בסרטון.</li>
	<li>השתמש בקוד מותאם אישית כדי לחשב הן את התנועה הממוצעת והן את התנועה הכוללת של עכברים בהתבסס על ההבדל במרכז המסה של צללית הנושא בין מסגרות. הערה: יחידה שרירותית משמשת למדידה זו מכיוון שמהירות התנועה תלויה בקצב הדגימה של הסרט.</li>
	<li>כדי למדוד את אחוז הקיפאון, השתמש באות המתמר בזמן.<ol><li>אותות מתמר קדם-תהליך באמצעות מסנן מעבר פס של 20-500 הרץ.</li>
		<li>חשב את המשרעת הריבועית הממוצעת של השורש של אות המתמר בזמן עבור כל סל של 50 אלפיות השנייה.</li>
		<li>הגדר סף עבור משרעת האות כדי לזהות את תקופת חוסר התנועה. משך חוסר התנועה הוא תקופת האות הנמוכה מהסף עבור יותר מ -1 שניות.</li>
		<li>מדוד ידנית את משך ההקפאה על ידי צפייה בסרטון.</li>
		<li>התאם את סף משרעת האות להקפאה על-ידי השוואת אחוז הקפיאה שנמדד ידנית והאחוז המחושב מאות המתמר.</li>
	</ol></li>
	<li>ספור את מספר הקפיצות באופן ידני מקבצי וידאו. הערה: ספירת מספר החיצים תהיה שימושית גם בהערכת תגובת הטיסה.</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>הגדר את המובהקות הסטטיסטית על p < 0.05.</li>
	<li>להשוואות בין מספר קבוצות ומספר גורמים, ערוך ANOVA רב-כיווני ואחריו בדיקות פוסט-הוק. אם נבדק יום מסוים בלוח הזמנים של ההתניה, בצע בדיקות השוואה מרובות או בדיקות תמורות.</li>
</ol>

חקר התנהגויות הגנתיות אקטיביות בעכברים עם התניה שונה של פחד

<ol>
	<li>Fanselow, M. S., Lester, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evolution and learning. , 185-212 (1988).</li><li>Fanselow, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+organization+of+the+defensive+behavior+system+responsible+for+fear.">Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear.</a> Psychonomic Bulletin &amp; Review. 1 (4), 429-438 (1994).</li><li>Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space,+time,+and+fear:+Survival+computations+along+defensive+circuits.">Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits.</a> Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).</li><li>Black, D. W., Grant, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dsm-5+guidebook:+The+essential+companion+to+the+diagnostic+and+statistical+manual+of+mental+disorders.">Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders.</a> American Psychiatric Pub. , (2014).</li><li>Bienvenu, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+fear+conditioning+as+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder:+Learning+from+the+past+to+shape+the+future+of+ptsd+research.">The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research.</a> Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).</li><li>Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pavlovian+fear+memory+circuits+and+phenotype+models+of+ptsd.">Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd.</a> Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).</li><li>Yehuda, R., Ledoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+variation+following+trauma:+A+translational+neuroscience+approach+to+understanding+ptsd.">Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd.</a> Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).</li><li>Ledoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).</li><li>Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+divergent+expression+of+active+and+passive+conditioned+fear+responses+in+rats.">Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats.</a> Elife. 4, e11352 (2015).</li><li>Fadok, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+inhibitory+circuit+for+selection+of+active+and+passive+fear+responses.">A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses.</a> Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).</li><li>Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+salience+determines+defensive+behaviors+elicited+by+aversively+conditioned+serial+compound+auditory+stimuli.">Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli.</a> Elife. 9, e53803 (2020).</li><li>Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+and+unconditional+components+of+aversively+motivated+freezing,+flight+and+darting+in+mice.">Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice.</a> Elife. 11, e75663 (2022).</li><li>Borkar, C. D., Fadok, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pavlovian+fear+conditioning+paradigm+to+study+freezing+and+flight+behavior.">A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. 167, e61536 (2021).</li><li>Totty, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+brain+mechanisms+mediating+conditioned+flight+behavior+in+rats.">Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8215 (2021).</li><li>Furuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+contribute+to+flight+behaviors+during+fear+conditioning.">Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning.</a> Scientific Reports. 13 (1), 10402 (2023).</li><li>Cain, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+problems+reconsidered.">Avoidance problems reconsidered.</a> Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).</li><li>Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth,+death+and+resurrection+of+avoidance:+A+reconceptualization+of+a+troubled+paradigm.">The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm.</a> Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).</li><li>Bouchekioua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-ht2c+receptor+knockout+in+mice+attenuates+fear+responses+in+contextual+or+cued+but+not+compound+context-cue+fear+conditioning.">Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning.</a> Translational Psychiatry. 12 (1), 58 (2022).</li><li>Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+lick+suppression:+Assessing+contextual,+cued,+and+context-cue+compound+fear+responses+independently+of+locomotor+activity+in+mice.">Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice.</a> Bio-Protocol. 12 (23), e4568 (2022).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול התניה הפחד המתוקן שהוצג במאמר זה הוא שיטה יציבה לחקר התנהגויות טיסה בהקשר מפחיד. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, מצאנו כי התנהגויות התעופה של עכברים בהקשר המפחיד מופעלות על ידי גירויים בולטים ותלויות בהקשר. המאפיינים של התנהגות הטיסה לא נחקרו היטב, שכן לא היה פרוטוקול מתאים לצפייה בהת...

<a href="https://app.jove.com/t/6598">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66272">10.3791/66266</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/66266">Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice</a>. The Abstract section was updated.

Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

הבחירה הנכונה של התנהגויות הגנתיות בנסיבות מאיימות היא חיונית להישרדותם של כל בעלי החיים. התנהגויות הגנתיות עוברות בהדרגה מאחת לשנייה בהתבסס על קרבת איום, כגון המעבר בין קפיאה להתנהגות טיסה 1,2,3. דיסרגולציה של התנהגויות אלה נצפתה לעתים קרובות בהפרעות נפשיות שונות4. הפרעת דחק פוסט-טראומטית (PTSD) היא הפרעה כזו המאופיינת בהתנהגויות הגנתיות מוגזמות, כמו תגובות פאניקה לגירויים לא מאיימים4.
התניה קלאסית של פחד במכרסמים משמשת בדרך כלל כמודל ל-PTSD 5,6,7, אך מכרסמים אינם מבטאים התנהגויות מעופפות (דמויות פאניקה) במודל זה8. כתוצאה מכך, מודל התניה הפחד הקלאסי, המכונה לעתים קרובות "מודל PTSD מכרסמים", חסר תוקף פנים ל- PTSD בבני אדם, במיוחד בלכידת סימפטומים דמויי טיסה או פאניקה, שלא נחקרו היטב.
לאחרונה, מספר פרוטוקולים מתוקנים להתניה של פחד הוכיחו בהצלחה כי נבדקים מכרסמים מפגינים התנהגות תעופה במהלך הליכים אלה. לדוגמה, אסוציאציות חוזרות ונשנות של גירוי מותנה (CS) וגירוי בלתי מותנה (US) שבע פעמים ביום אפשרו לחולדות להפגין התנהגויות נועזות הדומות להתנהגויות טיסה9. בהתניות פחד שנמשכו יומיים באמצעות גירויים מורכבים סדרתיים (SCS; המורכבים מטון ואחריו רעש), עכברים החלו להראות התנהגויות טיסה במהלך חלק הרעש של מצגות SCS 10,11,12. התיאור המפורט של שיטת SCS מסופק בדוח פרוטוקול13. התניה של שלושה ימים עם SCS פעלה גם עבור חולדות כדי לגרום להתנהגויות טיסה14. עם זאת, לפרוטוקולים חדשים אלה יש כמה מגבלות. לדוגמה, השימוש בהצגת רמזים סדרתיים אינו מאפשר לשלול את השפעת הערכת הקרבה על התנהגות הגנתית. במקרה של קשר של פי שבעה של CS-US בחולדות, רוב תגובות התעופה נצפו בנקבות ולא בזכרים.
לאור שיקולים אלה, אנו מציגים פרוטוקול מותאם להתניה של פחד עבור עכברים כדי לחקור התנהגויות טיסה בהקשר מפחיד. עכברים זכרים מפגינים באופן עקבי התנהגות תעופה במהלך התניה שונה של פחד. בפרוטוקול זה, הטון הבולט משמש כ- CS במקום SCS. בנוסף, נדרש מינימום של חמישה זיווגים של CS-US ביום למשך יומיים לפחות, יחד עם הגברה של פחד על ידי ההקשר המותנה. הפרוטוקול מספק אפשרות נוספת לחקירת התנהגויות טיסה, המשלים פרוטוקולים קודמים, בהתאם למטרת המחקר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Audio speaker</td>
			<td>Fostex</td>
			<td>FT17H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Sony</td>
			<td>TA-F500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Sanwa Supply Inc.</td>
			<td>CMS-V43BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>Nosan</td>
			<td>Labo MR standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Yamazen</td>
			<td>LT-B05N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microphone</td>
			<td>ACO</td>
			<td>type 4156N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scramble shocker</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE 100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sound card</td>
			<td>Behringer</td>
			<td>UMC202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sound software</td>
			<td>Syntrillium Software</td>
			<td>Cool Edit 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE 111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified fear conditioning for inducing flight behaviors in mice

הביטוי המתאים של התנהגות הגנתית במצב מאיים הוא קריטי להישרדות. התיאוריה הרווחת גורסת כי התנהגות הגנתית אקטיבית, כגון קפיצה או קפיצה מהירה, מתבטאת תחת איום מיידי גבוה או איום ממשי, בעוד שהתנהגות הגנתית פסיבית, כגון קיפאון, מתבטאת כאשר האיום צפוי, אך האיום הממשמש ובא נמוך יחסית. בהתניה קלאסית של פחד, הנבדקים בדרך כלל מפגינים קיפאון כתגובה הגנתית מותנית, עם ביטוי מועט של התנהגות הגנתית פעילה ברוב המקרים. כאן, אנו מציגים הליך התניה שונה של פחד עבור עכברים כדי לצפות במעבר מקיפאון לטיסה ולהיפך, הכולל חמישה זיווגים חוזרים של גירויים מותנים (CS; טון רציף, 8 קילוהרץ, 95 dB SPL (רמות לחץ קול)) וגירויים בלתי מותנים (ארה"ב; שוק רגל, 0.9 mA, 1.0 שניות) במשך יומיים. הליך התניה שונה זה דורש מספר גדול יחסית של מפגשי התניה וימי התניה, אך אינו מחייב שוק רגלי בעוצמה גבוהה לביטוי צנוע של התנהגות טיסה. שימוש באותו הקשר להתניה ולמצגות CS בולטות הוא חיוני כדי לעורר התנהגויות טיסה. הליך התניה שונה זה של פחד הוא שיטה אמינה לצפייה בהתנהגויות הגנתיות אקטיביות בעכברים, ומספק הזדמנות להבהיר את המנגנונים והמאפיינים העדינים של התנהגויות כאלה בהקשר מפחיד.

The appropriate selection of defensive behaviors under threatening circumstances is crucial for the survival of all animals. Defensive behaviors gradually shift from one to another based on threat proximity, such as the transition between freezing and flight behaviors1,2,3. Dysregulation of these behaviors is often observed in various mental disorders4. Post-traumatic stress disorder (PTSD) is one such disorder characterized by exaggerated defensive behaviors, like panic responses to non-threatening stimuli4.
Classical fear conditioning in rodents is commonly used as a model for PTSD5,6,7, but rodents do not express flight (panic-like) behaviors in this model8. Consequently, the classical fear conditioning model, often referred to as the &#39;rodent PTSD model,&#39; lacks face validity for PTSD in humans, particularly in capturing flight or panic-like symptoms, which have not been well-studied.
Recently, several modified fear conditioning protocols have successfully demonstrated that rodent subjects exhibit flight behavior during these procedures. For instance, repetitive associations of a conditioned stimulus (CS) and an unconditioned stimulus (US) seven times in a day allowed female rats to exhibit darting behaviors similar to flight behaviors9. In two-day fear conditionings using serial compound stimuli (SCS; composed of tone followed by noise), mice began showing flight behaviors during the noise part of SCS presentations10,11,12. The detailed description of the SCS method is provided in a protocol report13. A three-day fear conditioning with SCS also worked for rats to induce flight behaviors14. However, these new protocols have some limitations. For example, the use of serial cue presentation does not allow for the exclusion of the influence of proximity estimation on defensive behavior. In the case of seven times association of CS-US in rats, the majority of flight responses were observed in females rather than males.
In light of these considerations, we introduce a modified fear conditioning protocol for mice to investigate flight behaviors in a fearful context. Male mice consistently exhibit flight behavior during our modified fear conditioning. In this protocol, the salient tone is used as the CS instead of SCS. Additionally, a minimum of five pairings of CS-US in a day for at least two days, along with fear potentiation by the conditioned context, is required. The protocol provides another option for investigating flight behaviors, complementing previous protocols, depending on the research purpose.

Author Spotlight: Exploring Neural Correlates of Defensive Behaviors in Fear Learning and Extinction

התניה שונה של פחד לגרימת התנהגויות טיסה בעכברים

1 We are investigating the neural correlation<v>2 for various defensive behaviors 3 in fear learning and extinction. 4 The present protocol could aid in the development 5 of new treatment for anxiety disorder 6 and post-traumatic stress disorder. 7 Our protocol uses two sound pressure levels 8 of conditioning stimuli to reset 9 freezing, darting, and flight.10 So our technique can assess various defensive behaviors 11 better than classical fear conditioning. 12 Our laboratory focuses on neural correlates 13 for fear learning and extinction. 14 The neural mechanisms of various defensive behaviors 15 to threats could support the development of new treatment 16 for anxiety disorder and PTSD.

תוצאות שהתקבלו עם התניה שונה של פחד בעכברים זכרים (C57BL/6J; בני 3-6 חודשים) מוצגות, בהתאם ללוח הזמנים שמוצג באיור 1C. הניסוי נועד לחקור כיצד ההקשר המותנה משפיע על ביטוי התנהגויות טיסה. שתי קבוצות הוקצו: קבוצה 1 (n = 10) וקבוצה 2 (n = 10). CS (95 dB SPL) ו-US (0.9 mA) שימשו בניסוי זה.
ביו?...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice at JoVE.com

כדי לחקור התנהגויות טיסה בהקשר של פחד, אנו מציגים פרוטוקול התניה שונה של פחד. פרוטוקול זה מבטיח שעכברים יפגינו באופן עקבי התנהגויות טיסה במהלך הצגת רמזים בהתניה של פחד.

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...

modified-fear-conditioning-for-inducing-flight-behaviors-in-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

590 Views.  Kanazawa Medical University. 1 אנו חוקרים את המתאם העצבי2 להתנהגויות הגנתיות שונות 3 בפחד למידה והכחדה. 4 הפרוטוקול הנוכחי עשוי לסייע בפיתוח 5 טיפול חדש להפרעת חרדה 6 ולהפרעת דחק פוסט טראומטית. 7 הפרוטוקול שלנו משתמש בשתי רמות לחץ קול 8 של גירויי התניה כדי לאפס 9 קיפאון, הטלת חצים, וטיסה....

Video: Author Spotlight: Exploring Neural Correlates of Defensive Behaviors in Fear Learning and Extinction

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Induction of Modified Fear Conditioning in Mice for the Analysis of Flight Behavior

1 To begin, set up a fear conditioning chamber<v>2 enclosed in a sound-attenuating box. 3 Next, create two contexts:A and B.4 For context A, attach black stripes 5 on a white plastic board. 6 For context B, make the wall entirely black.7 Use an overhead white light-emitting diode 8 to illuminate the experimental box. 9 Then, connect a scramble shocker to a grid floor 10 with stainless steel rods. 11 Now fix a speaker onto the box's ceiling.12 Then, digitally modify and calibrate the amplitudes 13 of each stimulus. 14 Place the floor of the test chamber on a transducer 15 to detect vibrations. 16 Then place a CMOS camera on the chamber's ceiling 17 to track the subject's motion and record sound.18 Set up the sound software to trigger tones or foot shocks 19 at scheduled time intervals. 20 Plan four days of fear conditioning, 21 with the first day assigned to habituation, 22 the next two days allocated to conditioning, 23 and the last day assigned to test or extinction sessions. 24 For the conditioning session, 25 present the unconditioned stimulus 26 immediately after terminating the conditioned stimulus.27 After ending the fifth shock, 28 leave the subject in the context for one minute 29 before returning to its home cage. 30 To induce flight behaviors, on day one, 31 expose the subjects to five conditioned stimuli only 32 in context A.33 On days two and three, condition the subjects 34 with five conditioned and unconditioned 35 stimuli association trials in context B.36 On the last day, expose the animal to five trials 37 of only conditioned stimuli in context B.38 The group one mice displayed pronounced flight behaviors 39 on days three and four. 40 The total motion increased with increased conditioning.41 Freezing during conditioned stimuli increased on day two 42 and remained constant in subsequent trials. 43 The animals demonstrated increased movements 44 at the onset of the condition stimuli 45 and were consistent throughout. 46 The group two mice showed flight behaviors 47 almost identical to group one on days two and three.48 However, the animals did not show any flight behavior 49 during conditioned stimuli presentations in context A.50 The group one mice displayed significantly higher motion 51 and total number of jumps relative to group two. 52 However, the group two mice froze more.