עבודה זו חלקית נתמך על ידי מספרים גרנט JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, ו- 17 K 07086, מספרים גרנט MEXT KAKENHI 25110737, 23110525, AMED גרנט מספר JP18ek0109311, ואת קרן מחקר רפואי SENSHIN את יפן אפילפסיה של קרן המחקר.

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של טוקיו מטרופוליטן המכון הרפואי למדע. 8 לאחר הלידה - מומלץ בן 16 בשבוע עכברים. כל זן המפגרים מקובל לניסוי. C57BL/6 עכברים הם עמידים יותר בפני PTZ, ואילו עכברים לבקן BALB/c ושווייץ רגישים יותר PTZ. C57BL/6 השתמשו במחקר זה. פגיעות PTZ תלויה גם הגיל של העכבר. בהשוואה לעכברים צעירים, עכברים בוגרים הם יותר דברים מעוותים PTZ35. מספר החיות לשימוש בשיטה זו יכול להשתנות, אבל לפחות 6-10 חיות נדרשים עבור כל תנאי.
1. הכנת PTZ
<ol><li>לפזר 2 מ"ג/מ"ל PTZ סטרילי 0.9% (w/v) NaCl. להכין PTZ ביום של שימוש.</li>
</ol>2. הזרקה של PTZ
<ol><li>ביצוע ניסויים כל בין 9:00 ל- 12:00 (בצהריים).</li>
	<li>מודדים משקל הגוף של בעל החיים.</li>
	<li>מקם את החיה חדר התצפית עבור habituation.</li>
	<li>במהלך תקופת habituation (3 דקות), לחשב את עוצמת הקול של פתרון PTZ הזריקה מבוסס על משקל הגוף של בעל החיים והמנה הזרקת נקבע בעבר. הערה: לדוגמה, בעת 35 מ"ג/ק"ג PTZ, 0.875 מ"ג PTZ נדרש לעכבר השוקל 25 גרם (35 מ"ג / ק"ג x 0.025 ק ג = 0.875 מ"ג). לכן, צריך להיות מוזרק 437.5 μL של פתרון PTZ 2 מ"ג/מ"ל (0.875 mg/2 מ"ג / מ"ל = 0.4375 מ"ל). המינון הזרקה של PTZ תלוי גנוטיפ העכבר ואת המתח. עבור פראי-סוג עכברים C57BL/6, מנה של 30-35 מ"ג PTZ/ק"ג משקל גוף מומלץ במשפט הראשון. רגישות PTZ תלוי העכבר זן המשמש36,37. הזרקת מינון משתנה על פי מטרת הניסוי.</li>
	<li>להזריק PTZ intraperitoneally עם מזרק 1-mL המצורפת מחט 27-מד לתוך המשולש השמאלי או הימני של הבטן של החיה. הימנע הזרקת בקו האמצע.<ol>
<li>הימנע זריקות חוזרות במיקום זהה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצפות בהתנהגויות בעלי חיים במשך 30 דקות לאחר PTZ המינהל (איור 1 א'), לסווג, ציון התנהגות חריגה כפי שמוצג להלן. במידת האפשר, לשמור על החיות תחת השגחה 24 שעות ביממה, או לפחות h 6-10 נוספים לאחר זריקה, במיוחד לאחר התוצאה חומרת ההתקף מגיע ל- 3 ומעלה.<ol>
<li>הערה כל התקפים קלים או שינויים התנהגותיים בבעלי החיים מעבר למשך 30-מין התבוננות. זה ממושך תצפית תקופה רשאי לפנות בעל השפעה חשובה במיוחד ושלמה של מנה subconvulsive של PTZ דור של התקפים התגרות כרונית של אפילפסיה.</li>
		<li>בנוסף, מדד משך ההתקף כל התקף שנצפה כשינויים משך ההתקף מתייחסים חומרת ההתקף. יתר על כן, ההשהיה עד ההתקף הראשון אחרי הזריקה PTZ הוא מדד חשוב נוסף כדי לאסוף. פיקוח על בתדירות ההתקפים, ומשך השהיה הוא קריטי עבור מחקר מולקולרי שאחרי שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק PTZ בכל יום אחר (איור 1 א'). מספר זריקות תלוי מטרת הניסוי. להלן דוגמאות מייצגות.<ol>
<li>כדי ליצור חיות לחלוטין הדולקת בפתחי הבתים, ברגע חיה חווה התקף עם ציון של 5 (תפיסה clonic), לסיים את הזריקה בתוך הממשלים שלושה נוספים. במקרה זה, להגדיל את המינון הזרקת אם הציון התקף אינה מגדילה עבור שלושה הממשלים רצופים. כל בעל חיים יכולים לקבל מנה של זריקות PTZ ומספר שונים.</li>
		<li>לתקן את המספר ואת המינון של הזרקת PTZ בכל מצב כדי להעריך את הפגיעות כדי PTZ, כולל הערכות של תרופות נגד אפילפסיה, מחקרים של פנוטיפ של עכברים מהונדסים. לתת כל בעלי מספר זהה של זריקות PTZ; סכום כולל של 8 עד 12 זריקות מומלץ. אם חיים מת, הציון התקף צריך להיות מסומן בתור 6.</li>
		<li>לקבוע את המינון הזרקה הדרושים לשמור על התקף גבוהה ציון (4 או 5) לזריקות 10 או יותר ללמוד את השינויים histopathological המתרחשות התקפים אפילפטיים. במקרה זה, המספר הכולל הזרקת צריך לנוע בין 25 ל- 30. להקטין את המינון הזרקת אם הציון התקף מגיע ל- 5. אם הציון התקף יורדת ל- 3 או נמוך יותר, להגדיל את המינון הזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תפיסת ניקוד
<ol><li>לצפות את התנהגות בעלי חיים, להקליט את הציונים.<ol>
<li>לסווג, ניקוד ההתנהגויות אפילפטי כפי שמוצג להלן38,39 (איור 1B): 0: התנהגות נורמלית, אין חריגות. 1: הנייח, שוכב על הבטן. 2: ראש מיוקלונוס מהנהן, טיפול פנים, forelimb או hindlimb. 3: רציף לכל הגוף מיוקלונוס, מיוקלונית jerks, הזנב. החזיק מעמד בנוקשות. 4: התקף לגידול, טוניק, נופל על צידו. 5: תפיסה clonic, נופל על גבו, פראי ממהר וקפיצה. 6: מוות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשנות את הקריטריונים התנהגותית המבוססת על ראסין ציון40, בהתאם לתנאי הניסוי.</li>
</ol>4. תפיסת שלאחר ניתוח
<ol><li>ניתוח Immunohistopathological<ol>
<li>קיבוע זלוף<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד כ 70 ° C עם התוספת של טיפה של NaOH M 1 (כ 1 µL של NaOH M 1 לפתרון PFA 50 מ ל).</li>
				<li>להכין 4 קר כקרח % כדורגלן ו באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
				<li>להגדיר את משאבת סחרור, עם צינור, המחט. לרוץ כ 20 מ ל מים דרך צינור כדי לנקות את שאריות. אז, במקום את הקצה הפתוח של הצינור ב- PBS קר כקרח.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial זלוף והכנה של המוח קבוע<ol>
<li>עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם 50% אתנול isoflurane/50% בצנצנת קטנה.</li>
				<li>לשמור את העכבר במצב פרקדן על ידי הצמדת קצות שלהם forelimbs, hindlimbs.</li>
				<li>לחתוך האמצע הגחון של הבטן ולחשוף את הסרעפת.</li>
				<li>חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal. לאחר מכן, לחתוך משני צדי הצלעות ועל הגוף. קמצוץ הסרעפת מאת המלקחיים נעילה ו אוורט הצלעות. לשמור על המיקום של הסרעפת על-ידי הצמדתה עם מחט או לצבוט את זה עם מלקחיים. לחשוף את הלב.</li>
				<li>הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ולעשות חתך ב אטריום ימין באמצעות מספריים. להיות מודע לא לדחוף את המחט רחוק מדי לתוך הלב, כמו זה יכול לחדור קיר פנימי.</li>
				<li>מתחילים זרימה קבועה של PBS קר כקרח דרך המחט לשטוף את הדם (כ 15-20 mL/min).</li>
				<li>כאשר הדם נוקתה מן הגוף, להעביר את הצינור פתרון paraformaldehyde 4% (כ- 60 מ"ל) ללא התוספת של בועות. אז תפסיק את זלוף.</li>
				<li>לחתוך את אחורי הצוואר ועמוד השדרה, קילוף העור הראש ואת החלק הגבי של הגולגולת עם לנתח מספריים.</li>
				<li>לחתוך את העצם premaxillary בין מסלולים העין, להסיר לחלוטין את החלק הגבי של הגולגולת.</li>
				<li>ליצור פער בין המוח לבין עצם ג'וגל האנסראג מן הצד האחורי וחותכים את המשולש העצבים ואת הצנטר מתחת המוח. בזהירות מסירים את המוח ואז למקם אותו בקבוקון המכיל 4% מחברים. פוסט-לתקן את המוח ב 4 ° C עבור h 12-16.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>המוח פרוסה הכנה<ol>
<li>להעביר את המוח קבועה 20% סוכרוז/PBS עד המוח שוקעת לתוך הפתרון כדי לאפשר cryoprotection.</li>
			<li>לחתוך את המוח קבוע בהתבסס על פרוסה נדרשת התמצאות החלק הנדרש של המוח.</li>
			<li>הגדר את cryomicrotome. להגדיר את הלהב בעמדה ולתחזק את הבמה מיקרוטום בטמפרטורה מתחת-20 ° C.</li>
			<li>למקם את המוח חתוכות מראש על הבמה, להרגיע את המוח עם 20% סוכרוז/PBS. הפתרון סוכרוז/PBS יהיה להקפיא בהדרגה, המכסים את המוח על הבמה, עד המוח לגמרי שמוטבע קפוא 20% סוכרוז/PBS.</li>
			<li>פורסים את המוח (עובי 30 מיקרומטר) על-ידי הזזת הלהב דרך הרקמות. להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשמור אותם ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אימונוהיסטוכימיה פלורסנט<ol>
<li>לשטוף את הפרוסות הדרושות ב- 0.1% X-100/PBS טריטון (PBST) למשך 10 דקות, 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
			<li>לחסום את הפרוסות על-ידי המקננת בהם ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% שור אלבומין (BSA) עבור h 1-2-RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות ב פתרון נוגדנים עם ריכוז נוגדן ראשוני ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% BSA מתאימים עבור לינה 1-7-4 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לשטוף את הפרוסות ב- PBST 10 דקות, 3 פעמים. ב RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות בפתרון נוגדנים משניים עם הריכוז מתאים של נוגדנים משניים ב- PBST עבור 1-2 h ב- RT, המוגן על-ידי אור.</li>
			<li>לטעון את הפרוסות על גבי מדרון זכוכית ולכסות עם הרכבה בינונית עם כיסוי זכוכית.</li>
			<li>לבחון את הפרוסות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן 3 תאיים<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להכין לפחות 2 2 - בת 6 חודשים 129/Sv עכברים מאותו המין כמו עכברים הנושא להיות "העכבר זר". Habituate כל עכברים בכלוב לפני הניתוח. עבור כל אימון, מקם את העכבר בתוך הכלוב ולהשאיר את העכבר למשך 15 דקות.</li>
			<li>לפני כל שלב habituation עם העכבר נושא, לנקות את כל המתקן ואת שני כלובים על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>מקם את הכלובים ריק בנבכי דו צדדי המנגנון 3-הקאמרית ופתח את הדלתות בין התאים.</li>
			<li>Habituate את העכבר נושא, במקום עכבר הנושא בבית הבליעה מרכז ולאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות ברחבי המנגנון עד העכבר כי נחקרו שני כלובים, בתוספת חיות נושא 5 דק נוספות שעשויות להיות הנוראית של הכלוב אינם לחקור את הכלוב כעשרים דקות ולא צריך לשמש לניתוח זה. חיות כאלה למנוע את הכלוב ובאים רק לעתים רחוקות מספיק לכלוב.</li>
			<li>אחרי החיה נעה אל מרכז החדר, סגור את הדלתות ולתת העכבר לנוע בחופשיות בבית הבליעה מרכז במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, לשים אחד מהעכברים 129/Sv בכלוב כדי habituate לכלוב.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח sociality<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר תקופת habituation של העכבר נושא.</li>
			<li>למקם את הכלוב המכיל עכבר 129/Sv, כינה "זר 1 בכלוב" באחד התאים בצד ומניחים את הכלוב ריק, כינה "אובייקט בכלוב", בחדר בצד השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את העכבר נושא כדי לנוע בחופשיות למשך 10 דקות ולהקליט את הפרמטרים הבאים התנהגותית. אם העכבר נושא מפחד העכבר בכלוב 1 זר, כמצוין על-ידי עכבר הימנעות הכלוב זר 1, נותר בפינה של אחד התאים, צריך החיה לא לשמש לניתוח. a) הזמן בילה כל תא, תא 1 זר, אובייקט קאמרית ו מרכז קאמרית. b) הזמן בילה חוקרים כל הכלוב, הכלוב זר 1 ועל הכלוב אובייקט. (העכבר מסווג כ חוקר את הכלוב אם העכבר מרחרחת או פרא העכבר או כלוב) ג) מספר כניסות לתא כל (אופציונלי) ד) המרחק הכולל נסע (אופציונלי)</li>
			<li>לאחר העכבר זז אל מרכז החדר, סגור את הדלתות</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח החדשנות החברתית<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר הניתוח sociality.</li>
			<li>נגב שני כלובים עם 70% אתנול.</li>
			<li>הנח את העכבר 129/Sv אחר באחד הכלובים, כינה את "כלוב זר 2" ואת הכלוב במקום ה 2 זר באחד התאים. הנח את העכבר 1 זר בכלוב השני, הנקרא "בכלוב זר 1" ולמקם את הכלוב זר 1 בחדר השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את הנושא העכבר כדי להזיז בחופשיות למשך 10 דקות, ומדידת באותם פרמטרים ההתנהגות המתוארת על הניתוח sociality. הערה: העכבר זר 1 ו- 2 זר צריך להיבחר באקראי. תא 1 זר אובייקט קאמרית וכן קאמרית זר 1 ואת 2 זר קאמרית צריך להיקבע באופן אקראי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>פחד הקשרי אפליה<ol>
<li>מיזוג<ol>
<li>לפני כל משפט מיזוג לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>הכנס עכבר מנגנון מיזוג עם תנאים מסוימים (המנגנון צורה צבע הקיר, חומר הרצפה, ריח, תאורה, עוצמת הקול רעש רקע מראש ייקבע). לדוגמה, המנגנון מיזוג המשמש כאן היה מנגנון מרובע עם פלקסיגלס ברור קירות, רצפה ברשת מתכת, ריח אתנול, בהירות 100 lux ו רעש לבן רקע 65-dB.</li>
			<li>להתנות את העכבר על ידי רגל-הלם בתזמון אקראיים מדומים של 0.1-mA זעזועים חשמליים עבור 2 s x 3 פעמים במשך 5 דקות.</li>
			<li>להחזיר את העכבר הכלוב הביתה לאחר מיזוג.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הערכת הזיכרון<ol>
<li>לפני כל הערכה, לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>למחרת מיזוג הבאים, להכניס את העכבר בתוך המנגנון אותו כתנאי הלם ומדידת הזמן קפוא במשך 5 דקות.</li>
			<li>מאוחר יותר באותו היום, מקם את העכבר מנגנון הרומן ומדידת זמן הקפאה במהלך הערכה 5-מין. מנגנון משולש עם קירות לבנים פלקסיגלס, צלחת קומה, אין ריח, בהירות לאקס 30 רעש לבן 70-dB שימש כאן.</li>
			<li>להשוות את הזמן קופא בין התנאי תנאי הרומן. העכברים עם יכולת זיכרון נורמלי יהיה להקפיא יותר באותו מצב מאשר במצב הרומן. הקפאה היא מוגדרת הקיפאון של החיה עבור יותר מ 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגישים נרחב להקמתה של מודל בעלי חיים תרופתי של אפילפסיה. בתיווך PTZ הצתה כימי היסטוריה ארוכה, הוא מודל שהנוהג המקובל עבור המחקר של פתולוגיה histopathology וסלולר של אפילפסיה41. הדגם הצתה כימי של אפילפסיה נצפה בעבר על-ידי Suzdak ג'נסן, 199542. אינדוקציה פר?...

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית כרונית זה מאופיין על-ידי התקפים חוזרים ונשנים ומשפיע כ- 1% של אנשים. המנגנונים שבבסיס הדור epileptogenesis ותפיסה בחולי אפילפסיה לא יכול להיות מובהר מלא במחקרים קליניים. לכן, מודל חיה המתאימה נדרש לצורך המחקר של אפילפסיה1.
מגוון רחב של מודלים חייתיים של אפילפסיה שימשו כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפילפסיה וכדי לזהות תרופות אנטי-אפילפטי2,3. בין אלה מודלים, תפיסת תרופתי אינדוקציה הוא שיטה נפוצה המשמשת ליצירת מודל חיה על החקירה של הפתולוגיה של אפילפסיה4. שיטה זו היא פשוטה וזולה. הצתה בתיווך אלקטרודה היא גם שיטה בשימוש נפוץ, אבל העלויות של הליך זה הן גבוהות יותר, השיטה דורשת מיומנויות כירורגית, חשמליים כדי לגרום להתקפים חוזרים5.
אינדוקציה תרופתי יש יתרון גם כי התזמון ואת מספר התקפים נשלטים בקלות. מודלים העכבר גנטי כי התערוכה התקפים ספונטנית משמשים גם במחקר של אפילפסיה. עם זאת, לחזות מתי ובאיזו תכיפות ההתקפים עולות דגמים גנטיים אלה עשוי להיות אפשרי6. מערכת ניטור נדרש כדי לצפות את ההתנהגות אפילפטיים של עכברים מהונדסים6.
חומצה Kainic, פילוקרפין ו- pentylenetetrazole (PTZ) נמצאים בשימוש נרחב כמו גרימת התקף תרופות7. חומצה Kainic הוא אגוניסט עבור רצפטורים גלוטמט, ומפעילה פילוקרפין קולטנים שימוש. PTZ הוא גמא בוטירית (GABA)-אנטגוניסט קולטני8. PTZ מעלימה את הפונקציה של הסינפסות מעכבות, שמוביל פעילות. עצבית מוגברת. תקנה זו גורמת מוכללת ויהיו בעלי חיים9. זריקה אחת של חומצה kainic, פילוקרפין יכול לגרום להתקפים חריפה, במיוחד סטטוס אפילפטיקוס (SE)10,11 ומקדם kainic חומצה או פילוקרפין-בתיווך SE התקפים ספונטנית ולא חוזרים ונשנים כרונית12 , 13. הקלטות electroencephalographic (EEG) וניתוח התנהגות הראו כי התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית שנצפו חודש אחרי12,13זריקה בודדת. זריקה אחת של מנה עוויתית של PTZ גורם גם התקף אקוטי. עם זאת, התקפים ספונטנית כרונית לאחר זריקה אחת של PTZ קשים לקדם. ממשל כרונית של PTZ נדרש כדי לגרום להתקפים חוזרים14. בשיטה אחת, הדור של התקפים חוזרים הוא מסוגל לגרום מחלה דומה יותר לזה של אפילפסיה האנושית מאשר בדור של התקפים חריפה. במקרה של PTZ, כל זריקה מעורר התקף, חומרת ההתקף הופכת קשה יותר בצורה stepwise עם כל זריקה. לבסוף, זריקה אחת של PTZ במינון נמוך גורם של תפיסה clonic חמורה. בשלב זה, כל זריקה מעורר התקפים חמורים. בנוסף, תפיסת השהיה והמשך גם להשתנות לאורך המסלול של הזריקות. ההשהיה לתפיסה טוניק לעתים קרובות הופך קצר יותר בשלב האחרון של בני15. יתר על כן, עוגמת נפש ההתקף מלווה משך התקף ממושך16. חוקרים את המנגנון המולקולרי המסדיר את חומרת ההתקף, השהיה, ומשך שימושית הקרנת סמים אנטי-אפילפטי17,18,19.
התקפים הם בדרך כלל המושרה על ידי ניהול מערכתי יחידה של PTZ, ההחלמה היא מהירה מאוד, במרחק של 30 דקות4,5. לכן, מספר התקפים הוא יותר לשליטה במודל PTZ-הסקה. עם זאת, ניטור EEG ציין כי קוצים מוכללת, ניתן לראות עד 12 שעות לאחר ההתקף בתיווך PTZ20. לכן, בעלי חיים צריכים רצוי להישאר בהשגחה במשך 24 שעות לאחר ההתקף מיוקלונית או טוניק21 לניתוח מדויק יותר של מנגנוני הצתה.
הממשל של תרופות אנטי-אפילפטי, כגון ethosuximide, valproate, פנוברביטל, vigabatrin ו- retigabine3, לפני או אחרי הזרקת PTZ מפחית את הסיכון של העצבים של תפיסת חומרת3,22, 23. באופן דומה, עכברים knockout כי חוסר גנים מעורבים החרפה התקף, כגון מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-924, FGF-2225 ו- neuritin26, הוכחו שהפגינו חומרת ההתקף מופחתת לאחר זריקות PTZ מרובים. בנוסף, צופה שינויים histopathological לאחר התקפים אפילפטיים אפשרי בשיטה זו. בחולים עם אפילפסיה, ישנם שינויים היסטולוגית טיפוסי במוח, כגון סיבים מוסי הלבלוב דופאמינרגיים astrogliosis30, גרגר חריג נוירון ההעברה29,27,28 מוות ההיפוקמפוס31,32ולאחר טרשת בהיפוקמפוס33. שינויים דומים הם נצפו בחיות מודל אפילפטיים. בין השיטות הזמינות, בתיווך PTZ הצתה כימי היא שיטה טובה, הדירים זול לייצר במודל חיה של אפילפסיה. במודל בתיווך פילוקרפין SE, תפיסת השליטה קשה, עכברים רבים מתים או לא מצליחים לפתח SE34. לעומת זאת, התמותה, חומרת ההתקף הם יותר לשליטה במודל PTZ. בנוסף, PTZ הוא זול יותר מאשר חומצה kainic, מיומנויות ניתוח מוח העכבר אינם הכרחיים לצורך והתרופות האמריקני.

<table><tbody><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>MANAC</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Mouse</td><td>CLEA Japan</td><td></td><td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td></tr><tr><td>Syringe (1mL)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Needle(27G x 3/4&quot;) (0.40 x 19 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Weighing scale</td><td>Mettler</td><td>PE2000</td><td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&amp;amp;D company.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>nacalai tesque</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>ATTO</td><td>SJ1211</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>nacalai tesque</td><td>30404-45</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Yamato</td><td>REM-700</td><td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>anti-synaptoporin antibody</td><td>Synaptic systems</td><td>102 002</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZnT3 antibody</td><td>Synaptic systems</td><td>197 002</td><td></td></tr><tr><td>anti-doublecortin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8066</td><td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td></tr><tr><td>Contextual fear discrimination test apparatus</td><td>O&#039;hara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Three chamber test apparatus</td><td>Muromachi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) הוא אנטגוניסט קולטן GABA-A. זריקה בקרום הבטן של PTZ לחיה המניע של התקף אקוטי, חמור במינון גבוה, בעוד זריקות רציפים של מנה subconvulsive שימשו לפיתוח כימית מוצתים, מודל אפילפסיה. זריקה אחת במינון נמוך של PTZ גורם התקף קל ללא עווית. עם זאת, חוזרות זריקות במינון נמוך של PTZ להקטין את הסף לעורר התקף עוויתי. לבסוף, במינון נמוך מתמשך, מינהל PTZ גורם של תפיסה clonic חמורה. שיטה זו היא פשוטה, החלים נרחב לחקור הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה, אשר מוגדרת כמחלה כרונית המערבת התקפים חוזרים. הכימי מוצתים פרוטוקול גורמת להתקפים חוזרים אצל בעלי חיים. בשיטה זו, הוערך פגיעות בתיווך PTZ התקפים או מידת ההחמרה של התקפים אפילפטיים. יתרונות אלה הובילו השימוש בשיטה זו לסינון סמים אנטי-אפילפטי, גנים הקשורים אפילפסיה. בנוסף, שיטה זו שימש לחקור נזקים עצביים לאחר התקפים אפילפטיים, בגלל השינויים היסטולוגית במוחם של חולי אפילפסיה להופיע גם במוחם של חיות כימית-כיליון. לפיכך, פרוטוקול זה שימושי להפקת בנוחות מודלים חייתיים של אפילפסיה.

הזרקה חוזרות של PTZ גורם לעלייה בחומרתן התקף. 6 C57BL/6 עכברים שטופלו PTZ, עוד 6 עכברים שטופלו תמיסת מלח כקבוצת בקרה. המינון PTZ היה 35 מ"ג/ק"ג, 10 זריקות נוהלו. הציון התקף גדל בהדרגה עם זריקות PTZ, ואילו ללא התקפים או התנהגויות חריגות ולעוצמת על ידי זריקות מלוחים (איור 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model at JoVE.com

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of the Epilepsies

SCIENTISTS IN ACTION

32.7K Views.  Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

Video: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential cellular mechanism underlying learning and information storage, have long been used to elucidate the physiology of various neuronal circuits in the hippocampus, amygdala, and other limbic and cortical structures. With this in mind, transgenic mouse models of neurological diseases represent useful platforms to conduct long-term&#160;potentiation (LTP) studies to develop a greater understanding of the role of genes in normal and abnormal synaptic communication in neuronal networks involved in learning, emotion and information processing. This article describes methodologies for reliably inducing LTP in the freely behaving mouse. These methodologies can be used in studies of transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neurodegenerative diseases.

Transgenic and knockout mouse models of neurological diseases are useful for studying the role of genes in normal and abnormal neurophysiology. This article describes methodologies which can be used to study long-term potentiation, a cellular mechanism which may underlie learning and memory, in transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neuropathology.

הגברה לטווח ארוך של Perforant מסלול-משוננת gyrus סינפסה בחופשיות מתנהג עכברים

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Behavior

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little research to reveal the possible mechanisms behind these effects. To investigate the effect of acupuncture on epilepsy and sleep, several issues need to be addressed. The first is to identify the acupoints, which correspond between humans, rats, and mice. Furthermore, the depth of insertion of the acupuncture needle, the degree of needle twist in manual needle acupuncture, and the stimulation parameters for electroacupuncture (EA) need to be determined. To evaluate the effects of acupuncture on epilepsy and sleep, a feasible model of epilepsy in rodents is required. We administer pilocarpine into the left central nucleus of the amygdala (CeA) to simulate focal temporal lobe epilepsy (TLE) in rats. Intraperitoneal (IP) injection of pilocarpine induces generalized epilepsy and status epilepticus (SE) in rats. Five IP injections of pentylenetetrazol (PTZ) with a one-day interval between each injection successfully induces spontaneous generalized epilepsy in mice. Recordings of electrocorticograms (ECoGs), electromyograms (EMGs), brain temperature, and locomotor activity are used for sleep analysis in rats, while ECoGs, EMGs, and locomotor activity are employed for sleep analysis in mice. ECoG electrodes are implanted into the frontal, parietal, and contralateral occipital cortices, and a thermistor is implanted above the cerebral cortex by stereotactic surgery. EMG electrodes are implanted into the neck muscles, and an infrared detector determines locomotor activity. The criteria for categorizing vigilance stages, including wakefulness, rapid eye movement (REM) sleep, and non-REM (NREM) sleep are based on information from ECoGs, EMGs, brain temperature, and locomotor activity. Detailed classification criteria are stated in the text.

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms ECoGs and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

This paper demonstrates the performance of acupuncture, epilepsy models, and the analysis of sleep in rodents. The acupuncture procedure and the identification of acupoints are described. Pilocarpine or pentylenetetrazol (PTZ) is used to induce epilepsy. Electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), brain temperature, and locomotor activity recordings are employed for sleep analysis.

מניפולציה של Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) ולישון חולדות ועכברים ידי דיקור

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of acquired epilepsy. TBI can result in a focal or diffuse brain injury. Focal injury is a result of direct mechanical forces, sometimes penetrating through the cranium, creating a direct lesion in the brain tissue. These are visible during brain imaging as areas with contusion, laceration, and hemorrhage. Focal lesions induce neuronal death and glial scar formation and are present in 20%&minus;25% of all people who incur a TBI. However, in the majority of TBI cases, injury is caused by acceleration-deceleration forces and subsequent tissue shearing, resulting in nonfocal, diffuse damage. A subpopulation of TBI patients continues to develop post-traumatic epilepsy (PTE) after a latency period of months or years. Currently, it is impossible to predict which patients will develop PTE, and seizures in PTE patients are challenging to control, necessitating further research. Until recently, the field was limited to only two animal/rodent models with validated spontaneous post-traumatic seizures, both presenting with large focal lesions with massive tissue loss in the cortex and sometimes subcortical structures. In contrast to these approaches, it was determined that diffuse TBI induced using a modified weight drop model is sufficient to initiate development of spontaneous convulsive and non-convulsive seizures, even in the absence of focal lesions or tissue loss. Similar to human patients with acquired post-traumatic epilepsy, this model presents with a latency period after injury before seizure onset. In this protocol, the community will be provided with a new model of post-traumatic epilepsy, detailing how to induce diffuse non-lesional TBI followed by continuous long-term video-electroencephalographic animal monitoring over the course of several months. This protocol will detail animal handling, the weight drop procedure, the electrode placement for two acquisition systems, and the frequent challenges encountered during each of the steps of surgery, postoperative monitoring, and data acquisition.

This systematic protocol describes a new animal model of post-traumatic epilepsy after repetitive mild traumatic brain injury. The first part details steps for traumatic brain injury induction using a modified weight drop model. The second part provides instructions on the surgical approach for single- and multi-channel electroencephalographic data acquisition systems.

גרימת אפילפסיה פוסט טראומטית במודל עכבר של פגיעה במוח החוזר ומפוזר טראומטי

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of acquired epilepsy. TBI can result in a focal or diffuse brain injury. Focal injury is a result of ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

הכנה והשתלה של אלקטרודות להצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre ליצירת מודל לאפילפסיה של האונה הרקתית

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Using a Bipolar Electrode to Create a Temporal Lobe Epilepsy Mouse Model by Electrical Kindling of the Amygdala

The amygdala is one of the most common origins of seizures, and the amygdala mouse model is essential for the illustration of epilepsy. However, few studies have described the experimental protocol in detail. This paper illustrates the whole process of amygdala electrical kindling epilepsy model making, with the introduction of a method of bipolar electrode fabrication. This electrode can both stimulate and record, reducing brain injury caused by implanting separate electrodes for stimulation and recording. For long-term electroencephalogram (EEG) recording purposes, slip rings were used to eliminate the record interruption caused by cable tangles and falling off.
After periodic stimulation (60 Hz, 1 s every 15 min) of the basolateral amygdala (AP: 1.67 mm, L: 2.7 mm, V: 4.9 mm) for 19.83 &plusmn; 5.742 times, full kindling was observed in six mice (defined as induction of three continuous grade V episodes classified by Racine's scale). An intracranial EEG was recorded throughout the entire kindling process, and an epileptic discharge in the amygdala lasting 20-70 s was observed after kindling. Therefore, this is a robust protocol for modeling epilepsy originating from the amygdala, and the method is suitable for revealing the role of the amygdala in temporal lobe epilepsy. This research contributes to future studies on the mechanisms of mesial temporal lobe epilepsy and novel antiepileptogenic drugs.

The amygdala plays a key role in temporal lobe epilepsy, which originates in and propagates from this structure. This article provides a detailed description of the fabrication of deep brain electrodes with both recording and stimulating functions. It introduces a model of medial temporal lobe epilepsy originating from the amygdala.

שימוש באלקטרודה דו-קוטבית ליצירת מודל עכבר אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי הצתה חשמלית של האמיגדלה

The amygdala is one of the most common origins of seizures, and the amygdala mouse model is essential for the illustration of epilepsy. However, few ...

Handling-Induced Seizures in a Mouse Model

Source: Batot, G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63673">A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler&#39;s Murine Encephalomyelitis Virus.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the induction of handling-induced seizures in a mouse infected with Theiler&#39;s Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV). The infected mouse, which has hyperexcitable neurons, is exposed to external physical stimuli. This exposure causes stress, leading to abnormal electrical activity in the neurons, which results in seizures.

Source: Batot, G., et al. A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler&#39;s Murine Encephalomyelitis Virus.&#160;J. Vis. Exp. (2022).
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Triggering and Monitoring Heat-Induced Seizures in a Transgenic Mouse Model

Source: Das, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62846">A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the procedure to induce heat-induced seizures in a transgenic mouse with epilepsy-related gene mutations by gradually increasing body temperature in a controlled chamber. This protocol is used to study seizure mechanisms and potential therapies for epilepsy.

Source: Das, A., et al. A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy. J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the ...

Establishing a Pentylenetetrazole-Induced Epileptic Seizure Model in Mice

Source: Shimada, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56573">Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of inducing epilepsy in mice using pentylenetetrazole (PTZ) injections, a GABA-A receptor antagonist. Repeated intraperitoneal administration of PTZ progressively lowers the seizure threshold by inhibiting chloride ion influx, disrupting inhibitory neurotransmission, and leading to hyperexcitability in neurons that trigger seizures. This process results in kindling and the development of spontaneous seizures, mimicking chronic epilepsy.

Source: Shimada, T., et al. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of inducing epilepsy ...

Systemic Pilocarpine Treatment: Mouse Model of Temporal Lobe Epilepsy

Source: Kim, J. E. and Cho, K. O. <a href="https://www.jove.com/video/56831/the-pilocarpine-model-temporal-lobe-epilepsy-eeg-monitoring-using">The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video presents the procedure for inducing status epilepticus (SE) in mice by systemic administration of pilocarpine to model temporal lobe epilepsy.

טיפול פילוקרפין מערכתי: מודל עכברי של אפילפסיה של האונה הרקתית

Source: Kim, J. E. and Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. J. Vis. Exp. ...

Biology

Rodent Models

Adult

Technique to Induce Post-Traumatic Seizures in a Mouse Model via a Weight Drop Traumatic Injury

Source: Shandra, O. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60360">Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury.</a> J. Vis. Exp. (2020)