עבודה זו חלקית נתמך על ידי מספרים גרנט JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, ו- 17 K 07086, מספרים גרנט MEXT KAKENHI 25110737, 23110525, AMED גרנט מספר JP18ek0109311, ואת קרן מחקר רפואי SENSHIN את יפן אפילפסיה של קרן המחקר.

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של טוקיו מטרופוליטן המכון הרפואי למדע. 8 לאחר הלידה - מומלץ בן 16 בשבוע עכברים. כל זן המפגרים מקובל לניסוי. C57BL/6 עכברים הם עמידים יותר בפני PTZ, ואילו עכברים לבקן BALB/c ושווייץ רגישים יותר PTZ. C57BL/6 השתמשו במחקר זה. פגיעות PTZ תלויה גם הגיל של העכבר. בהשוואה לעכברים צעירים, עכברים בוגרים הם יותר דברים מעוותים PTZ35. מספר החיות לשימוש בשיטה זו יכול להשתנות, אבל לפחות 6-10 חיות נדרשים עבור כל תנאי.
1. הכנת PTZ
<ol><li>לפזר 2 מ"ג/מ"ל PTZ סטרילי 0.9% (w/v) NaCl. להכין PTZ ביום של שימוש.</li>
</ol>2. הזרקה של PTZ
<ol><li>ביצוע ניסויים כל בין 9:00 ל- 12:00 (בצהריים).</li>
	<li>מודדים משקל הגוף של בעל החיים.</li>
	<li>מקם את החיה חדר התצפית עבור habituation.</li>
	<li>במהלך תקופת habituation (3 דקות), לחשב את עוצמת הקול של פתרון PTZ הזריקה מבוסס על משקל הגוף של בעל החיים והמנה הזרקת נקבע בעבר. הערה: לדוגמה, בעת 35 מ"ג/ק"ג PTZ, 0.875 מ"ג PTZ נדרש לעכבר השוקל 25 גרם (35 מ"ג / ק"ג x 0.025 ק ג = 0.875 מ"ג). לכן, צריך להיות מוזרק 437.5 μL של פתרון PTZ 2 מ"ג/מ"ל (0.875 mg/2 מ"ג / מ"ל = 0.4375 מ"ל). המינון הזרקה של PTZ תלוי גנוטיפ העכבר ואת המתח. עבור פראי-סוג עכברים C57BL/6, מנה של 30-35 מ"ג PTZ/ק"ג משקל גוף מומלץ במשפט הראשון. רגישות PTZ תלוי העכבר זן המשמש36,37. הזרקת מינון משתנה על פי מטרת הניסוי.</li>
	<li>להזריק PTZ intraperitoneally עם מזרק 1-mL המצורפת מחט 27-מד לתוך המשולש השמאלי או הימני של הבטן של החיה. הימנע הזרקת בקו האמצע.<ol>
<li>הימנע זריקות חוזרות במיקום זהה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצפות בהתנהגויות בעלי חיים במשך 30 דקות לאחר PTZ המינהל (איור 1 א'), לסווג, ציון התנהגות חריגה כפי שמוצג להלן. במידת האפשר, לשמור על החיות תחת השגחה 24 שעות ביממה, או לפחות h 6-10 נוספים לאחר זריקה, במיוחד לאחר התוצאה חומרת ההתקף מגיע ל- 3 ומעלה.<ol>
<li>הערה כל התקפים קלים או שינויים התנהגותיים בבעלי החיים מעבר למשך 30-מין התבוננות. זה ממושך תצפית תקופה רשאי לפנות בעל השפעה חשובה במיוחד ושלמה של מנה subconvulsive של PTZ דור של התקפים התגרות כרונית של אפילפסיה.</li>
		<li>בנוסף, מדד משך ההתקף כל התקף שנצפה כשינויים משך ההתקף מתייחסים חומרת ההתקף. יתר על כן, ההשהיה עד ההתקף הראשון אחרי הזריקה PTZ הוא מדד חשוב נוסף כדי לאסוף. פיקוח על בתדירות ההתקפים, ומשך השהיה הוא קריטי עבור מחקר מולקולרי שאחרי שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק PTZ בכל יום אחר (איור 1 א'). מספר זריקות תלוי מטרת הניסוי. להלן דוגמאות מייצגות.<ol>
<li>כדי ליצור חיות לחלוטין הדולקת בפתחי הבתים, ברגע חיה חווה התקף עם ציון של 5 (תפיסה clonic), לסיים את הזריקה בתוך הממשלים שלושה נוספים. במקרה זה, להגדיל את המינון הזרקת אם הציון התקף אינה מגדילה עבור שלושה הממשלים רצופים. כל בעל חיים יכולים לקבל מנה של זריקות PTZ ומספר שונים.</li>
		<li>לתקן את המספר ואת המינון של הזרקת PTZ בכל מצב כדי להעריך את הפגיעות כדי PTZ, כולל הערכות של תרופות נגד אפילפסיה, מחקרים של פנוטיפ של עכברים מהונדסים. לתת כל בעלי מספר זהה של זריקות PTZ; סכום כולל של 8 עד 12 זריקות מומלץ. אם חיים מת, הציון התקף צריך להיות מסומן בתור 6.</li>
		<li>לקבוע את המינון הזרקה הדרושים לשמור על התקף גבוהה ציון (4 או 5) לזריקות 10 או יותר ללמוד את השינויים histopathological המתרחשות התקפים אפילפטיים. במקרה זה, המספר הכולל הזרקת צריך לנוע בין 25 ל- 30. להקטין את המינון הזרקת אם הציון התקף מגיע ל- 5. אם הציון התקף יורדת ל- 3 או נמוך יותר, להגדיל את המינון הזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תפיסת ניקוד
<ol><li>לצפות את התנהגות בעלי חיים, להקליט את הציונים.<ol>
<li>לסווג, ניקוד ההתנהגויות אפילפטי כפי שמוצג להלן38,39 (איור 1B): 0: התנהגות נורמלית, אין חריגות. 1: הנייח, שוכב על הבטן. 2: ראש מיוקלונוס מהנהן, טיפול פנים, forelimb או hindlimb. 3: רציף לכל הגוף מיוקלונוס, מיוקלונית jerks, הזנב. החזיק מעמד בנוקשות. 4: התקף לגידול, טוניק, נופל על צידו. 5: תפיסה clonic, נופל על גבו, פראי ממהר וקפיצה. 6: מוות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשנות את הקריטריונים התנהגותית המבוססת על ראסין ציון40, בהתאם לתנאי הניסוי.</li>
</ol>4. תפיסת שלאחר ניתוח
<ol><li>ניתוח Immunohistopathological<ol>
<li>קיבוע זלוף<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד כ 70 ° C עם התוספת של טיפה של NaOH M 1 (כ 1 µL של NaOH M 1 לפתרון PFA 50 מ ל).</li>
				<li>להכין 4 קר כקרח % כדורגלן ו באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
				<li>להגדיר את משאבת סחרור, עם צינור, המחט. לרוץ כ 20 מ ל מים דרך צינור כדי לנקות את שאריות. אז, במקום את הקצה הפתוח של הצינור ב- PBS קר כקרח.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial זלוף והכנה של המוח קבוע<ol>
<li>עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם 50% אתנול isoflurane/50% בצנצנת קטנה.</li>
				<li>לשמור את העכבר במצב פרקדן על ידי הצמדת קצות שלהם forelimbs, hindlimbs.</li>
				<li>לחתוך האמצע הגחון של הבטן ולחשוף את הסרעפת.</li>
				<li>חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal. לאחר מכן, לחתוך משני צדי הצלעות ועל הגוף. קמצוץ הסרעפת מאת המלקחיים נעילה ו אוורט הצלעות. לשמור על המיקום של הסרעפת על-ידי הצמדתה עם מחט או לצבוט את זה עם מלקחיים. לחשוף את הלב.</li>
				<li>הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ולעשות חתך ב אטריום ימין באמצעות מספריים. להיות מודע לא לדחוף את המחט רחוק מדי לתוך הלב, כמו זה יכול לחדור קיר פנימי.</li>
				<li>מתחילים זרימה קבועה של PBS קר כקרח דרך המחט לשטוף את הדם (כ 15-20 mL/min).</li>
				<li>כאשר הדם נוקתה מן הגוף, להעביר את הצינור פתרון paraformaldehyde 4% (כ- 60 מ"ל) ללא התוספת של בועות. אז תפסיק את זלוף.</li>
				<li>לחתוך את אחורי הצוואר ועמוד השדרה, קילוף העור הראש ואת החלק הגבי של הגולגולת עם לנתח מספריים.</li>
				<li>לחתוך את העצם premaxillary בין מסלולים העין, להסיר לחלוטין את החלק הגבי של הגולגולת.</li>
				<li>ליצור פער בין המוח לבין עצם ג'וגל האנסראג מן הצד האחורי וחותכים את המשולש העצבים ואת הצנטר מתחת המוח. בזהירות מסירים את המוח ואז למקם אותו בקבוקון המכיל 4% מחברים. פוסט-לתקן את המוח ב 4 ° C עבור h 12-16.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>המוח פרוסה הכנה<ol>
<li>להעביר את המוח קבועה 20% סוכרוז/PBS עד המוח שוקעת לתוך הפתרון כדי לאפשר cryoprotection.</li>
			<li>לחתוך את המוח קבוע בהתבסס על פרוסה נדרשת התמצאות החלק הנדרש של המוח.</li>
			<li>הגדר את cryomicrotome. להגדיר את הלהב בעמדה ולתחזק את הבמה מיקרוטום בטמפרטורה מתחת-20 ° C.</li>
			<li>למקם את המוח חתוכות מראש על הבמה, להרגיע את המוח עם 20% סוכרוז/PBS. הפתרון סוכרוז/PBS יהיה להקפיא בהדרגה, המכסים את המוח על הבמה, עד המוח לגמרי שמוטבע קפוא 20% סוכרוז/PBS.</li>
			<li>פורסים את המוח (עובי 30 מיקרומטר) על-ידי הזזת הלהב דרך הרקמות. להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשמור אותם ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אימונוהיסטוכימיה פלורסנט<ol>
<li>לשטוף את הפרוסות הדרושות ב- 0.1% X-100/PBS טריטון (PBST) למשך 10 דקות, 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
			<li>לחסום את הפרוסות על-ידי המקננת בהם ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% שור אלבומין (BSA) עבור h 1-2-RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות ב פתרון נוגדנים עם ריכוז נוגדן ראשוני ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% BSA מתאימים עבור לינה 1-7-4 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לשטוף את הפרוסות ב- PBST 10 דקות, 3 פעמים. ב RT.</li>
			<li>דגירה הפרוסות בפתרון נוגדנים משניים עם הריכוז מתאים של נוגדנים משניים ב- PBST עבור 1-2 h ב- RT, המוגן על-ידי אור.</li>
			<li>לטעון את הפרוסות על גבי מדרון זכוכית ולכסות עם הרכבה בינונית עם כיסוי זכוכית.</li>
			<li>לבחון את הפרוסות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>מבחן 3 תאיים<ol>
<li>הכנה<ol>
<li>להכין לפחות 2 2 - בת 6 חודשים 129/Sv עכברים מאותו המין כמו עכברים הנושא להיות "העכבר זר". Habituate כל עכברים בכלוב לפני הניתוח. עבור כל אימון, מקם את העכבר בתוך הכלוב ולהשאיר את העכבר למשך 15 דקות.</li>
			<li>לפני כל שלב habituation עם העכבר נושא, לנקות את כל המתקן ואת שני כלובים על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>מקם את הכלובים ריק בנבכי דו צדדי המנגנון 3-הקאמרית ופתח את הדלתות בין התאים.</li>
			<li>Habituate את העכבר נושא, במקום עכבר הנושא בבית הבליעה מרכז ולאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות ברחבי המנגנון עד העכבר כי נחקרו שני כלובים, בתוספת חיות נושא 5 דק נוספות שעשויות להיות הנוראית של הכלוב אינם לחקור את הכלוב כעשרים דקות ולא צריך לשמש לניתוח זה. חיות כאלה למנוע את הכלוב ובאים רק לעתים רחוקות מספיק לכלוב.</li>
			<li>אחרי החיה נעה אל מרכז החדר, סגור את הדלתות ולתת העכבר לנוע בחופשיות בבית הבליעה מרכז במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, לשים אחד מהעכברים 129/Sv בכלוב כדי habituate לכלוב.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח sociality<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר תקופת habituation של העכבר נושא.</li>
			<li>למקם את הכלוב המכיל עכבר 129/Sv, כינה "זר 1 בכלוב" באחד התאים בצד ומניחים את הכלוב ריק, כינה "אובייקט בכלוב", בחדר בצד השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את העכבר נושא כדי לנוע בחופשיות למשך 10 דקות ולהקליט את הפרמטרים הבאים התנהגותית. אם העכבר נושא מפחד העכבר בכלוב 1 זר, כמצוין על-ידי עכבר הימנעות הכלוב זר 1, נותר בפינה של אחד התאים, צריך החיה לא לשמש לניתוח. a) הזמן בילה כל תא, תא 1 זר, אובייקט קאמרית ו מרכז קאמרית. b) הזמן בילה חוקרים כל הכלוב, הכלוב זר 1 ועל הכלוב אובייקט. (העכבר מסווג כ חוקר את הכלוב אם העכבר מרחרחת או פרא העכבר או כלוב) ג) מספר כניסות לתא כל (אופציונלי) ד) המרחק הכולל נסע (אופציונלי)</li>
			<li>לאחר העכבר זז אל מרכז החדר, סגור את הדלתות</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח החדשנות החברתית<ol>
<li>לבצע ניתוח זה מיד לאחר הניתוח sociality.</li>
			<li>נגב שני כלובים עם 70% אתנול.</li>
			<li>הנח את העכבר 129/Sv אחר באחד הכלובים, כינה את "כלוב זר 2" ואת הכלוב במקום ה 2 זר באחד התאים. הנח את העכבר 1 זר בכלוב השני, הנקרא "בכלוב זר 1" ולמקם את הכלוב זר 1 בחדר השני.</li>
			<li>פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.</li>
			<li>לאפשר את הנושא העכבר כדי להזיז בחופשיות למשך 10 דקות, ומדידת באותם פרמטרים ההתנהגות המתוארת על הניתוח sociality. הערה: העכבר זר 1 ו- 2 זר צריך להיבחר באקראי. תא 1 זר אובייקט קאמרית וכן קאמרית זר 1 ואת 2 זר קאמרית צריך להיקבע באופן אקראי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>פחד הקשרי אפליה<ol>
<li>מיזוג<ol>
<li>לפני כל משפט מיזוג לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>הכנס עכבר מנגנון מיזוג עם תנאים מסוימים (המנגנון צורה צבע הקיר, חומר הרצפה, ריח, תאורה, עוצמת הקול רעש רקע מראש ייקבע). לדוגמה, המנגנון מיזוג המשמש כאן היה מנגנון מרובע עם פלקסיגלס ברור קירות, רצפה ברשת מתכת, ריח אתנול, בהירות 100 lux ו רעש לבן רקע 65-dB.</li>
			<li>להתנות את העכבר על ידי רגל-הלם בתזמון אקראיים מדומים של 0.1-mA זעזועים חשמליים עבור 2 s x 3 פעמים במשך 5 דקות.</li>
			<li>להחזיר את העכבר הכלוב הביתה לאחר מיזוג.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הערכת הזיכרון<ol>
<li>לפני כל הערכה, לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.</li>
			<li>למחרת מיזוג הבאים, להכניס את העכבר בתוך המנגנון אותו כתנאי הלם ומדידת הזמן קפוא במשך 5 דקות.</li>
			<li>מאוחר יותר באותו היום, מקם את העכבר מנגנון הרומן ומדידת זמן הקפאה במהלך הערכה 5-מין. מנגנון משולש עם קירות לבנים פלקסיגלס, צלחת קומה, אין ריח, בהירות לאקס 30 רעש לבן 70-dB שימש כאן.</li>
			<li>להשוות את הזמן קופא בין התנאי תנאי הרומן. העכברים עם יכולת זיכרון נורמלי יהיה להקפיא יותר באותו מצב מאשר במצב הרומן. הקפאה היא מוגדרת הקיפאון של החיה עבור יותר מ 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגישים נרחב להקמתה של מודל בעלי חיים תרופתי של אפילפסיה. בתיווך PTZ הצתה כימי היסטוריה ארוכה, הוא מודל שהנוהג המקובל עבור המחקר של פתולוגיה histopathology וסלולר של אפילפסיה41. הדגם הצתה כימי של אפילפסיה נצפה בעבר על-ידי Suzdak ג'נסן, 199542. אינדוקציה פר?...

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית כרונית זה מאופיין על-ידי התקפים חוזרים ונשנים ומשפיע כ- 1% של אנשים. המנגנונים שבבסיס הדור epileptogenesis ותפיסה בחולי אפילפסיה לא יכול להיות מובהר מלא במחקרים קליניים. לכן, מודל חיה המתאימה נדרש לצורך המחקר של אפילפסיה1.
מגוון רחב של מודלים חייתיים של אפילפסיה שימשו כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפילפסיה וכדי לזהות תרופות אנטי-אפילפטי2,3. בין אלה מודלים, תפיסת תרופתי אינדוקציה הוא שיטה נפוצה המשמשת ליצירת מודל חיה על החקירה של הפתולוגיה של אפילפסיה4. שיטה זו היא פשוטה וזולה. הצתה בתיווך אלקטרודה היא גם שיטה בשימוש נפוץ, אבל העלויות של הליך זה הן גבוהות יותר, השיטה דורשת מיומנויות כירורגית, חשמליים כדי לגרום להתקפים חוזרים5.
אינדוקציה תרופתי יש יתרון גם כי התזמון ואת מספר התקפים נשלטים בקלות. מודלים העכבר גנטי כי התערוכה התקפים ספונטנית משמשים גם במחקר של אפילפסיה. עם זאת, לחזות מתי ובאיזו תכיפות ההתקפים עולות דגמים גנטיים אלה עשוי להיות אפשרי6. מערכת ניטור נדרש כדי לצפות את ההתנהגות אפילפטיים של עכברים מהונדסים6.
חומצה Kainic, פילוקרפין ו- pentylenetetrazole (PTZ) נמצאים בשימוש נרחב כמו גרימת התקף תרופות7. חומצה Kainic הוא אגוניסט עבור רצפטורים גלוטמט, ומפעילה פילוקרפין קולטנים שימוש. PTZ הוא גמא בוטירית (GABA)-אנטגוניסט קולטני8. PTZ מעלימה את הפונקציה של הסינפסות מעכבות, שמוביל פעילות. עצבית מוגברת. תקנה זו גורמת מוכללת ויהיו בעלי חיים9. זריקה אחת של חומצה kainic, פילוקרפין יכול לגרום להתקפים חריפה, במיוחד סטטוס אפילפטיקוס (SE)10,11 ומקדם kainic חומצה או פילוקרפין-בתיווך SE התקפים ספונטנית ולא חוזרים ונשנים כרונית12 , 13. הקלטות electroencephalographic (EEG) וניתוח התנהגות הראו כי התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית שנצפו חודש אחרי12,13זריקה בודדת. זריקה אחת של מנה עוויתית של PTZ גורם גם התקף אקוטי. עם זאת, התקפים ספונטנית כרונית לאחר זריקה אחת של PTZ קשים לקדם. ממשל כרונית של PTZ נדרש כדי לגרום להתקפים חוזרים14. בשיטה אחת, הדור של התקפים חוזרים הוא מסוגל לגרום מחלה דומה יותר לזה של אפילפסיה האנושית מאשר בדור של התקפים חריפה. במקרה של PTZ, כל זריקה מעורר התקף, חומרת ההתקף הופכת קשה יותר בצורה stepwise עם כל זריקה. לבסוף, זריקה אחת של PTZ במינון נמוך גורם של תפיסה clonic חמורה. בשלב זה, כל זריקה מעורר התקפים חמורים. בנוסף, תפיסת השהיה והמשך גם להשתנות לאורך המסלול של הזריקות. ההשהיה לתפיסה טוניק לעתים קרובות הופך קצר יותר בשלב האחרון של בני15. יתר על כן, עוגמת נפש ההתקף מלווה משך התקף ממושך16. חוקרים את המנגנון המולקולרי המסדיר את חומרת ההתקף, השהיה, ומשך שימושית הקרנת סמים אנטי-אפילפטי17,18,19.
התקפים הם בדרך כלל המושרה על ידי ניהול מערכתי יחידה של PTZ, ההחלמה היא מהירה מאוד, במרחק של 30 דקות4,5. לכן, מספר התקפים הוא יותר לשליטה במודל PTZ-הסקה. עם זאת, ניטור EEG ציין כי קוצים מוכללת, ניתן לראות עד 12 שעות לאחר ההתקף בתיווך PTZ20. לכן, בעלי חיים צריכים רצוי להישאר בהשגחה במשך 24 שעות לאחר ההתקף מיוקלונית או טוניק21 לניתוח מדויק יותר של מנגנוני הצתה.
הממשל של תרופות אנטי-אפילפטי, כגון ethosuximide, valproate, פנוברביטל, vigabatrin ו- retigabine3, לפני או אחרי הזרקת PTZ מפחית את הסיכון של העצבים של תפיסת חומרת3,22, 23. באופן דומה, עכברים knockout כי חוסר גנים מעורבים החרפה התקף, כגון מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-924, FGF-2225 ו- neuritin26, הוכחו שהפגינו חומרת ההתקף מופחתת לאחר זריקות PTZ מרובים. בנוסף, צופה שינויים histopathological לאחר התקפים אפילפטיים אפשרי בשיטה זו. בחולים עם אפילפסיה, ישנם שינויים היסטולוגית טיפוסי במוח, כגון סיבים מוסי הלבלוב דופאמינרגיים astrogliosis30, גרגר חריג נוירון ההעברה29,27,28 מוות ההיפוקמפוס31,32ולאחר טרשת בהיפוקמפוס33. שינויים דומים הם נצפו בחיות מודל אפילפטיים. בין השיטות הזמינות, בתיווך PTZ הצתה כימי היא שיטה טובה, הדירים זול לייצר במודל חיה של אפילפסיה. במודל בתיווך פילוקרפין SE, תפיסת השליטה קשה, עכברים רבים מתים או לא מצליחים לפתח SE34. לעומת זאת, התמותה, חומרת ההתקף הם יותר לשליטה במודל PTZ. בנוסף, PTZ הוא זול יותר מאשר חומצה kainic, מיומנויות ניתוח מוח העכבר אינם הכרחיים לצורך והתרופות האמריקני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) הוא אנטגוניסט קולטן GABA-A. זריקה בקרום הבטן של PTZ לחיה המניע של התקף אקוטי, חמור במינון גבוה, בעוד זריקות רציפים של מנה subconvulsive שימשו לפיתוח כימית מוצתים, מודל אפילפסיה. זריקה אחת במינון נמוך של PTZ גורם התקף קל ללא עווית. עם זאת, חוזרות זריקות במינון נמוך של PTZ להקטין את הסף לעורר התקף עוויתי. לבסוף, במינון נמוך מתמשך, מינהל PTZ גורם של תפיסה clonic חמורה. שיטה זו היא פשוטה, החלים נרחב לחקור הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה, אשר מוגדרת כמחלה כרונית המערבת התקפים חוזרים. הכימי מוצתים פרוטוקול גורמת להתקפים חוזרים אצל בעלי חיים. בשיטה זו, הוערך פגיעות בתיווך PTZ התקפים או מידת ההחמרה של התקפים אפילפטיים. יתרונות אלה הובילו השימוש בשיטה זו לסינון סמים אנטי-אפילפטי, גנים הקשורים אפילפסיה. בנוסף, שיטה זו שימש לחקור נזקים עצביים לאחר התקפים אפילפטיים, בגלל השינויים היסטולוגית במוחם של חולי אפילפסיה להופיע גם במוחם של חיות כימית-כיליון. לפיכך, פרוטוקול זה שימושי להפקת בנוחות מודלים חייתיים של אפילפסיה.

הזרקה חוזרות של PTZ גורם לעלייה בחומרתן התקף. 6 C57BL/6 עכברים שטופלו PTZ, עוד 6 עכברים שטופלו תמיסת מלח כקבוצת בקרה. המינון PTZ היה 35 מ"ג/ק"ג, 10 זריקות נוהלו. הציון התקף גדל בהדרגה עם זריקות PTZ, ואילו ללא התקפים או התנהגויות חריגות ולעוצמת על ידי זריקות מלוחים (איור 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model at JoVE.com

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of the Epilepsies

SCIENTISTS IN ACTION

32.2K Views.  Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

Video: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

איתור של הפלאק מדלקת עצבים במודל מחלת אלצהיימר עכבר

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

שיטות לניהול עצמי תוך ורידים במודל של עכברים

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

הכנה והשתלה של אלקטרודות להצתה חשמלית של עכברי VGAT-Cre ליצירת מודל לאפילפסיה של האונה הרקתית

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...