מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82201084), הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2022M722232), קרן המחקר הפוסט-דוקטורט בבייג'ינג (2023-ZZ-020), פרויקט Miaopu של בית החולים טיאנטאן בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (2023MP10) וקרן המחקר הכללית, מועצת מענקי המחקר של הונג קונג (27111820 ו-17116521).

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה האתית של בית החולים בייג'ינג טיאנטאן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (NO. KY2023-177-01), וכל החולים המעורבים במחקר זה סיפקו הסכמה מדעת.
1. קריטריוני הכללה והדרה של מטופלים
<ol><li>קריטריוני הכללה: לסווג חולים כחולי pSS אם הם עומדים בקריטריונים של המכללה האמריקאית לראומטולוגיה (ACR)/הליגה האירופית נגד ראומטיזם (EULAR) משנת 201612. באופן ספציפי, לבסס את קריטריוני הסיווג הסופיים על הסכום המשוקלל של חמישה פריטים: אנטי-SSA/Ro נוגדנים חיוביים וסיאלדניטיס לימפוציטית מוקדית עם ציון מיקוד של ≥ 1 מוקדים / 4 מ"מ2, כל אחד ציון 3; ציון חריג של צביעת עיניים של ≥ 5 (או ציון ואן בייסטרוולד של ≥ 4), תוצאת בדיקה של שירמר של ≤ 5 מ"מ / 5 דקות וקצב זרימת רוק לא מגורה של ≤ 0.1 מ"ל לדקה, כל אחד ציון 1. אנשים עם סימנים ו / או תסמינים המרמזים על SS שיש להם ציון כולל של ≥ 4 עבור הפריטים לעיל עומדים בקריטריונים עבור pSS.</li>
	<li>קריטריוני אי-הכללה: לא לכלול חולים שאינם יכולים לשתף פעולה עם איסוף הדגימות וחולים המקבלים טיפול לזיהום קנדידה דרך הפה. הערה: חשוב לציין כי השיטות המתוארות להלן מתאימות גם לאפיון מקיף של זיהומי קנדידה אוראליים באנשים עם SS משני.</li>
	<li>כדי למנוע זיהומים פוטנציאליים במהלך האיסוף, ההובלה והטיפוח של דגימות קנדידה , יש לנקוט באמצעי זהירות קפדניים. זה כולל הכנה ניסיונית קפדנית, שימוש בחומרים חד פעמיים וסטריליים, תיוג נכון, איטום מאובטח של צינורות דיגום, וביצוע הליכים ניסיוניים בארון בטיחות ביולוגי מקצועי.</li>
</ol>2. איסוף דוגמאות
<ol><li>איסוף רוק: יש להנחות את המטופלים להחזיק את הצינורית באמצעות משפך ולתת לרוק לזרום בהדרגה לתוך הצינור לאורך השפה התחתונה. בסוף האיסוף, בקש מהמטופל לירוק את כל הרוק שנותר בפה לתוך הצינור. לאסוף את הרוק במשך 15 דקות.</li>
	<li>שטיפת פה ואיסוף מטושים: אם למטופל אין או זרימת רוק בלתי מגורה נמוכה במיוחד (פחות מ-0.03 מ"ל/דקה), יש לספוג את אזור רירית הפה עם חשד לזיהום קנדידה פומי לפחות פי 10, ולאחר מכן לבקש מהמטופל להשתמש ב-5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS; ראה טבלת חומרים) כדי לשטוף את הפה במשך דקה אחת. אחסנו את שטיפת הפה בצינור סטרילי בנפח 50 מ"ל והכניסו את המקלון לצינור שטיפת הפה. הערה: עבור חולי pSS עם זרימת רוק לא מגורה של יותר מ -0.03 מ"ל/דקה, שלב 2.2 עדיין יכול לשמש לאיסוף דגימות לזיהוי זיהום קנדידה דרך הפה.</li>
</ol>3. עיבוד דגימה
<ol><li>הוסף 1 מ"ל של PBS לרוק שנאסף. אין להוסיף PBS לשטיפת הפה עם PBS. רטטו את צינור שטיפת הפה באמצעות מערבולת למשך דקה אחת.</li>
</ol>4. תרבות קנדידה
<ol><li>כדי להפוך את האגר של Sabourand (SDA) מדיום, להמיס 70 גרם SDA (ראה טבלה של חומרים) ב 1000 מ"ל של מים מזוקקים כפול.</li>
	<li>סטרילי עם אוטוקלאבה ב 121 ° C למשך 15 דקות, צלחת 10 מ"ל של מדיום SDA זה בצלחת תרבית מיקרוביולוגית 10 ס"מ (ראה טבלת חומרים) ומקורר.</li>
	<li>קח 200 μL של דגימה שהוכנה בשלב 3 ופז אותה על כלי תרבית מיקרוביולוגית 10 ס"מ מוכן עם 10 מ"ל של מדיום SDA בשלב 4.2.</li>
	<li>דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ואת מושבת קנדידה יבשיל. אחסנו באופן זמני את צלחת SDA עם מושבות קנדידה בטמפרטורה של 4°C. מושבות קנדידה המתורבתות על צלחת SDA ניתן לאחסן במשך 2-4 שבועות.</li>
</ol>5. זיהוי זן קנדידה
<ol><li>כדי להפוך את המדיום, להוציא 47.7 גרם של אבקת אגר אבחון קנדידה (ראה טבלה של חומרים), לשים אותו לתוך 1000 מ"ל של מים מזוקקים כפול, לחמם אותו ל 100 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כאשר המדיום רותח מעט, צלחת 10 מ"ל בצלחת תרבית מיקרוביולוגית 10 ס"מ ולאפשר להתקרר.</li>
	<li>להמיס את מושבות קנדידה ב 500 μL של מדיום SDA (שלב 4), להשהות ולהתנתק על ידי pipetting.</li>
	<li>צלחת 50 μL של הדגימה עם מושבות קנדידה (שלב 5.3) על המדיום מוכן בשלב 5.2. דוגרים במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עד שמושבות הקנדידה בשלות.</li>
	<li>על פי הצבע והתבניות של מושבות הקנדידה , לקבוע את הזן(ים) של קנדידה נרכשת מחולי pSS. השתמש בקריטריונים הבאים לזיהוי זן קנדידה : המושבה ירוקת האזמרגד היא קנדידה אלביקנס, המושבה הכחולה-אפורה היא קנדידה טרופיקליס, המושבות הוורודות עם הקצוות המטושטשים, והמיקרוווילי הם קנדידה קרוסיי, המושבה הקטנה האדומה ארגמנית היא קנדידה גלברטה, המושבה הלבנה החלבית מכילה מספר זנים כולל קנדידה פרפסילוזיס.</li>
</ol>6. בדיקת היווצרות ביופילם קנדידה
<ol><li>כדי להפוך את בסיס חנקן שמרים (YNB)-50 גלוקוז (G) בינוני, לשקול 1.34 גרם YNB (ראה טבלה של חומרים) ו 1.98 גרם D (+)-גלוקוז (ראה טבלה של חומרים). ממיסים אותם ב 200 מ"ל של מים מזוקקים כפול.</li>
	<li>כדי להפוך את המדיום YNB-100G, להוציא 1.34 גרם YNB ו 3.96 גרם D (+)-גלוקוז ולהמיס אותם ב 200 מ"ל של מים מזוקקים כפול.</li>
	<li>סנן את התמיסות באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). ניתן לאחסן את התווך המסונן YNB-50G ו- YNB-100G ב- 4 ° C למשך 3 חודשים.</li>
	<li>בחרו את 3 המושבות (או יותר) מאותו זן על הכלים בשלב 5 והעבירו אותן ל-200 μL של מדיום YNB-50G (שלבים 6.1 ו-6.3) בצלחת של 96 בארות (ראו טבלת חומרים). עשו זאת עבור הזנים שנצפו בצלחת. תרבית לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד.</li>
	<li>שואפים את מתלה הקנדידה , מוסיפים 1 מ"ל PBS, צנטריפוגו את תאי השמרים ב 1500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ומשליכים את supernatant. חזור על שלב זה 2x באותה צינור.</li>
	<li>להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום YNB-100G ולהכין דילולים שונים (1:10, 1:100, ו 1:1000) של תאים. קח 200 μL של תרחיף תאים הדרגתי וצלחת אותו על מדיום SDA 10 ס"מ על ידי שיטת צלחת ספירלה13. הציפוי נעשה באמצעות מכונה המפקידה נפח דגימה ידוע על צלחת אגר מסתובבת בכמות הולכת ופוחתת בצורת ספירלת ארכימדס. תרבית במשך 24-48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חשב את ריכוז התאים בדילולים שונים על פי מספר CFUs בלוח SDA בהתבסס על שיטה סטנדרטית13. ספרו בקצרה את המושבות המופרדות היטב על כל צלחת. ספרו את המושבות באוקטנט אחד מהקצה החיצוני לכיוון המרכז עד שנצפו לפחות 25 מושבות. כמו כן, ספרו את שארית הקשת שבה התרחשה הספירהה-25 . חישוב ריכוז התאים על ידי חלוקת ספירת המושבה בנפח הנוזל המתאים לאזור שעליו התקבלה ספירת המושבה13. התאם את ריכוז התאים ל 1 x 107 תאים / מ"ל.</li>
	<li>הכניסו 100 μL של מתלה התא ב-YNB-100G לצלחת של 96 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים תוך כדי רעידות ב-200 סל"ד.</li>
	<li>הוציאו בזהירות את הסופרנטנט, שטפו 2x עם PBS, והרחיקו את תאי השמרים הצפים. הביופילם של קנדידה נוצר בתחתית הצלחת בת 96 הקידוחים.</li>
</ol>7. בדיקת היווצרות Hyphal
הערה: רק קנדידה שיכולה ליצור קורים (כגון קנדידה אלביקנס) יכולה להיות מושרית להיווצרות hyphal. עבור לשלב 8 לאפיון נוסף של קנדידה שאינה יכולה ליצור קורים (כגון קנדידה גלברטה).
<ol><li>השהה מחדש את תרחיף תאי השמרים בשלב 6.6 והתאם את ריכוז התא ל- 1 x 106 תאים/מ"ל עם מדיום YNB-100G.</li>
	<li>כדי להכין את מדיום הצמיחה המלא RPMI 1640, הוסף 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (ראה טבלת חומרים) לתוך 450 מ"ל של מדיום RPMI 1640 (ראה טבלת חומרים) ואחסן ב 4 ° C לניסוי נוסף.</li>
	<li>מעבירים 2 μL של תרחיף תאי קנדידה מדולל ב-200 μL של RPMI 1640 מצע גידול מלא לתוך צלחת של 96 בארות ותרבית למשך הלילה ב-37°C כדי לאפשר לתאי ה-hyphae והשמרים להיווצר.</li>
</ol>8. בדיקת מריחת KOH ובדיקת צביעת CFW
<ol><li>הוציאו 1 μL של דגימות משלב 3 או שלב 6 או שלב 7 באמצעות לולאה יצוקה מדויקת (ראו טבלת חומרים) ומרחו שטח של 1 ס"מ x 1 ס"מ על שקופיות הזכוכית. המתינו לייבוש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להכנת תמיסת KOH 10%, יש לשקול 10 גרם אבקת KOH (ראו טבלת חומרים) ולהמיס אותה ב-100 מ"ל מים בזיקוק כפול.</li>
	<li>חממו מעט את המגלשה עם מנורת אלכוהול עד שהדגימה תתמוסס. צבעו את השקופיות שהוכנו בשלב 8.1 ב-10% KOH (שלב 8.2), וכסו בחלקת כיסוי. לחצו מעט על החלקת הכיסוי כדי להפוך את הדגימה לשקופה.</li>
	<li>דמיינו את תאי הקורים והשמרים מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>הכתימו שקופיות שהוכנו בשלב 8.1 עם טיפה של CFW (ראו טבלת חומרים), כסו בכיסוי והמתינו דקה.</li>
	<li>דמיינו את הקורים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלות של 100x ו-200x. CFW מעורר ב-355 ננומטר ומזוהה ב-300-440 ננומטר. צלמו את התמונות בזמן החשיפה. חזור על הפעולה 3 פעמים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות.</li>
</ol>9. בדיקת רגישות אנטי פטרייתית
הערה: בדיקה זו מבוצעת בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת רגישות פטרייתית דמוית שמרים (מיקרודילול; ראה טבלת חומרים).
<ol><li>הכינו מושבות קנדידה (שלב 4) בנות פחות מ-4 ימים עם אמפולה NaCl 0.85% (ראו טבלת חומרים) ורכשו את המתלה בעל עכירות המקבילה ל-2 מקפרלנד. קבע את העכירות על פי ערכת התקנים של מקפרלנד (ראה טבלת חומרים). השתמש במתלי קנדידה מוכנים באופן מיידי.</li>
	<li>פיפטה 135 μL של מדיום ATB F2 בערכה המכילה 3 x 104 תאי שמרים / מ"ל לתוך כל כיפה ברצועת הבדיקה ולשים את המכסה. שים את רצועת הבדיקה בכלי אטום. תרבית במשך 24 שעות ב 35 °C (75 °F).</li>
	<li>שימו לב לצמיחת הקנדידה בעזרת פרשנות חזותית (עיינו במדריך למשתמש). לקבלת ערך ההפניה (טווח הפניה), עיין במדריך למשתמש. בדוק אם חור הבקרה גדל כראוי. אם הצמיחה של חור הבקרה אינה מספיקה או אינה גדלה, אז לא ניתן לקרוא את התוצאות וצריך עוד 24 שעות של טיפוח.</li>
</ol>

אבחון וזיהוי זנים של קנדידה אוראלית הקשורה ל- pSS

<ol>
	<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+dysbiosis+in+primary+Sj&#246;gren's+syndrome+and+the+ameliorative+effect+of+hydroxychloroquine.">Microbiota dysbiosis in primary Sj&#246;gren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine.</a> Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).</li><li>Humphrey, S. P., Williamson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+saliva:+normal+composition,+flow,+and+function.">A review of saliva: normal composition, flow, and function.</a> J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).</li><li>Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+saliva+on+the+oral+microbiota.">Influence of saliva on the oral microbiota.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).</li><li>Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+saliva:+Antimicrobial+and+beyond.">The power of saliva: Antimicrobial and beyond.</a> PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).</li><li>Serrano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+related+to+oral+candidiasis+in+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome.">Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sj&#246;gren's syndrome.</a> Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).</li><li>Nape&#241;as, J. J., Rouleau, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+complications+of+Sj&#246;gren's+syndrome.">Oral complications of Sj&#246;gren's syndrome.</a> Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 26 (1), 55-62 (2014).</li><li>Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+manifestations+of+Sj&#246;gren's+syndrome.">Oral manifestations of Sj&#246;gren's syndrome.</a> J Dent Res. 87 (4), 308-318 (2008).</li><li>Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome+sufferers+have+increased+oral+yeast+levels+despite+regular+dental+care.">Sj&#246;gren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care.</a> Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).</li><li>Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjective+and+clinical+oral+symptoms+in+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome.">Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sj&#246;gren's syndrome.</a> Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).</li><li>Alam, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+identification:+a+journey+from+conventional+to+molecular+methods+in+medical+mycology.">Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology.</a> World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).</li><li>Bauters, T. G., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+chromogenic+and+fluorogenic+membrane+filtration+methods+for+detection+of+four+Candida+species.">Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species.</a> J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).</li><li>Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarc&#243;n-Segovia, D., Kraus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+candidiasis+and+Sj&#246;gren's+syndrome.">Oral candidiasis and Sj&#246;gren's syndrome.</a> J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).</li><li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+plate+method+for+bacterial+determination.">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).</li><li>Biomerieux. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATB+FUNGUS+3+Sensitivity+test+for+yeast-like+fungi.+REF+14204.">ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204.</a> Biomerieux. , (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widely+used+ATB+FUNGUS+3+automated+readings+in+China+and+its+misleading+high+MICs+of+Candida+spp.+to+Azoles:+Challenges+for+developing+countries'+clinical+microbiology+labs.">The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs.</a> PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).</li><li>Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+staining+vs.+routine+KOH+smear+for+rapid+diagnosis+of+oral+candidiasis-A+diagnostic+test.">Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test.</a> Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).</li><li>Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+krusei+infections+and+fluconazole+therapy.">Candida krusei infections and fluconazole therapy.</a> Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).</li><li>Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+Molecular+mechanisms+in+Candida+albicans+and+beyond.">Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond.</a> Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).</li><li>Rihab, B., Lina, E. H., No&#233;mie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+experience+of+dry+mouth+and+screening+for+Sjogren's+syndrome+by+the+dentist:+patient-reported+experiences.">The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences.</a> BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).</li><li>Panpetch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+administration+in+a+Clostridium+difficile+mouse+model+worsens+disease+severity+but+is+attenuated+by+Bifidobacterium.">Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium.</a> PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).</li><li>Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+oral+candidiasis+in+patients+under+12+years:+18S+rRNA+as+a+marker+of+molecular+characterization+of+Candida+tropicalis.">Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis.</a> Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).</li><li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+infection+as+an+early+sign+of+subsequent+Sj&#246;gren's+syndrome:+A+population-based+matched+cohort+study.">Candida infection as an early sign of subsequent Sj&#246;gren's syndrome: A population-based matched cohort study.</a> Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

בכתב היד הנוכחי, אנו מספקים סדרה של שיטות שיטתיות, פשוטות ואפשריות לאיתור זיהומי קנדידה דרך הפה, זיהוי זני קנדידה ובדיקת הרגישות האנטי פטרייתית של תרופות נפוצות בחולים עם pSS. 
במסגרות מעשיות, לא כל השיטות שהוכנסו בכתב יד זה נחוצות. ניתן לבחור את שיטות זיהוי הקנדיד...

קנדידאזיס נגרמת על ידי Candida spp., שהם פתוגנים אופורטוניסטיים. בין הזנים הנפוצים Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis ו-Candida dubliniensis1. זיהומים אופורטוניסטיים הנגרמים על ידי Candida spp. כוללים זיהומי קנדידה שטחיים וקנדידה פולשנית. קנדידה פולשנית מתרחשת בעיקר אצל אנשים מדוכאי חיסון; לדוגמה, בחולים עם תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס), קנדידה פולשנית יכולה לאיים באופן משמעותי על איכות החיים או אפילו על תוחלת החיים2. זיהום קנדידה שטחי, כגון קנדידה רירית, שכיח יותר בחולים3. 
קנדידה אוראלית, זיהום קנדידה שטחי, היא הזיהום הפטרייתי האנושי הנפוץ ביותר. קנדידה אלביקנס היא קומנסל נורמלי של הפה; שיעור ההובלה של קנדידה spp. דווח כי נע בין 20% ל -75% באוכלוסייה הכללית ללא תסמינים4. צמיחת יתר של קנדידה עלולה להוביל לאי נוחות מקומית בחולים, כגון שינוי בטעם התחושה, תחושת צריבה בפה, דיספגיה עקב תזונה לקויה, התאוששות מאוחרת ושהייה ממושכת בבית החולים. קנדידה אוראלית ארוכת טווח עלולה להוביל לקנדידה פולשנית קשה, וכתוצאה מכך לתחלואה ותמותה משמעותיות5. קנדידה אוראלית יכולה גם להגביר את הסיכון לסרטן הפה5. תפקוד לקוי של בלוטת הרוק הוא בין גורמי הסיכון לקנדידה אוראלית6. התחלת הזיהום היא היצמדות קנדידה לדפנות תאי אפיתל. זה ואחריו התפשטות ונימה של קנדידה ואת היווצרות והבשלה של ביופילם7. ביופילמים קשים מאוד למיגור והם עמידים לטיפול אנטי פטרייתי קונבנציונלי, מה שהופך את הטיפול הקליני לאתגר עבור זיהום קנדידה פומי הקשור לביופילם7.
תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת ביובש בפה, עיניים יבשות ותסמינים שיטתיים אחרים8. יובש בפה הוא התסמין השכיח ביותר של pSS. לרוק יש תפקידים פיזיולוגיים אנטי פטרייתיים חשובים. מצד אחד, הוא יכול לדלל ולסרוק את הפה ולאחר מכן להסיר אורגניזמים מן הרירית. מצד שני, רוק מכיל חלבונים מיקרוביאליים, כגון לקטופרין, סיאלופרוקסידז, ליזואנזים, פוליפפטידים עשירים בהיסטידין, ונוגדנים אנטי קנדידליים ספציפיים, אשר יכולים לקיים אינטראקציה עם רירית הפה ולמנוע צמיחת יתר של קנדידה6. זרימת הרוק המופחתת עלולה לגרום לחולי pSS לקנדידה אוראלית. מחקר חתך תצפיתי שנערך בקרב 61 חולי pSS מצא כי 13.1% מחולי pSS הציגו סימנים אוראליים של קנדידה ויחידה ליצירת מושבה (CFU)/מ"ל של קנדידה אלביקנס נמצאה בקורלציה משמעותית ושלילית עם רמות של רוק שלם לא מגורה (UWS) ורוק שלם מגורה (SWS)9.
השיטות שהוכנסו בכתב יד זה מסוגלות לזהות זיהום קנדידה אוראלי על סמך תכונות מורפולוגיות מאופיינות (למשל, תאי הקורים והשמרים) במריחה ישירה או לאחר תרבית10. זיהוי הזנים של הקנדידה באמצעות אגר דיאגנוסטי קנדידה מבוסס על היווצרות מושבות צבעוניות שונות בעלות מורפולוגיה מגוונת, הנובעות מפיצול מצעים כרומוגניים על ידי אנזימים ספציפיים למין11. בכתב יד זה מוצגות שיטות שיטתיות לגילוי זיהום קנדידה פומי, כולל תרבית קנדידה אוראלית מסורתית ובדיקה מהירה על ידי בדיקת מריחה של אשלגן הידרוקסידי (KOH) ובדיקת צביעה לבנה (CFW)10. בנוסף, הוצגה בדיקת רגישות אנטי פטרייתית, שיכולה להנחות טיפול קליני בזיהום קנדידה דרך הפה. במצבים ממשיים, אין צורך לבצע את כל השיטות שהוכנסו בכתב יד זה; ניתן לבחור את שיטות זיהוי הקנדידה דרך הפה בהתאם למטרה. בדיקת זיהום קנדידה פומי וקביעת זני קנדידה בחולי pSS לא רק מועילה לטיפול במחלה אלא גם מסייעת להעריך את אפיון הקנדידה האוראלית ואת פרופילי המינים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filter</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Microbiological Culture Dishes</td>
			<td>Jet Bio-Filtration Co. Ltd</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 0.85% NaCl ampule</td>
			<td>BIOMERIEUX</td>
			<td>20070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Candida</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>P002860</td>
			<td>Candida diagnostic agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose Monohydrate</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26170035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McFarland Standards Kit</td>
			<td>BIOMERIEUX</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc precision molded loops&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>254399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>P112284-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSoil DNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>MO BIO</td>
			<td>12888-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabourand&#39;s Agar Medium</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino acids</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Y8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)</td>
			<td>BIOMERIEUX</td>
			<td>14204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of oral candida infection in primary sj&#246;gren&#39;s syndrome patients

תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בתסמינים כגון יובש בפה, עיניים יבשות ותסמינים שיטתיים אחרים. בשל hyposalivation שחוו חולי pSS, dysbacteriosis אוראלי מתרחשת לעתים קרובות. סיבוך נפוץ של pSS הוא זיהום קנדידה דרך הפה. במאמר זה, המחברים מתארים שיטות שיטתיות שיכולות לאבחן ביעילות זיהום קנדידה דרך הפה ולזהות את זני הקנדידה באמצעות רוק, מקלוני רירית הפה או מי פה מחולי pSS. בדיקת דקסטרוז אגר (SDA) של Sabouraud, בדיקת היווצרות היפאל, בדיקת מריחת אשלגן הידרוקסיד (KOH) ובדיקת צביעה לבנה (CFW) משמשים לאבחון זיהום קנדידה דרך הפה. אגר אבחון קנדידה משמש לזיהוי זני קנדידה . לבסוף, בדיקות רגישות אנטי פטרייתיות משמשות לקביעת טיפול תרופתי אנטי פטרייתי מתאים. שיטה מתוקננת זו יכולה לשפר את האבחון, הטיפול והמחקר העתידי של זיהומי קנדידה אוראליים הקשורים ל- pSS. אבחון מוקדם, בשיטה זו, יכול גם למנוע סיבוכים הנובעים מאיחור בקבלת טיפול מתאים.

Candidiasis is caused by Candida spp., which are opportunistic pathogens. Common strains include Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis, and Candida dubliniensis1. Opportunistic infections caused by Candida spp. include superficial Candida infections and invasive candidiasis. Invasive candidiasis mainly happens in immunocompromised individuals; for example, in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), invasive candidiasis can significantly threaten the quality of life or even the life span2. Superficial Candida infection, such as mucocutaneous candidiasis, is more common in patients3. 
Oral candidiasis, a superficial Candida infection, is the most common human fungal infection. Candida albicans is a normal commensal of the mouth; the carriage rate of Candida spp. has been reported to range from 20% to 75% in the general population without any symptoms4. Overgrowth of Candida can lead to local discomfort in patients, such as the altered taste of sensation, burning sensation in the mouth, dysphagia due to poor nutrition, delayed recovery, and prolonged hospital stay. Long-term oral candidiasis can lead to severe invasive candidiasis, resulting in significant morbidity and mortality5. Oral candidiasis can also increase the risk of oral cancer5. Impaired salivary gland function is among the risk factors for oral candidiasis6. The initiation of infection is the adhesion of Candida to epithelial cell walls. This is followed by the proliferation and filamentation of Candida and the formation and maturation of biofilm7. Biofilms are extremely difficult to eradicate and are resistant to conventional antifungal treatment, making clinical treatment a challenge for biofilm-associated oral Candida infection7.
Primary Sj&#246;gren's syndrome (pSS) is an autoimmune disease that is characterized by dry mouth, dry eyes, and other systematic symptoms8. Dry mouth is the most frequent symptom of pSS. Saliva has important physiological antifungal functions. On the one hand, it can dilute and scour the mouth and thereafter remove organisms from the mucosa. On the other hand, saliva contains antimicrobial proteins, such as lactoferrin, sialoperoxidase, lysozyme, histidine-rich polypeptides, and specific anti-candidal antibodies, which can interact with the oral mucosa and prevent the overgrowth of Candida6. The reduced saliva flow may predispose pSS patients to oral candidiasis. An observational cross-sectional study conducted in 61 pSS patients found that 13.1% of pSS patients presented oral signs of candidiasis and colony forming unit (CFU)/mL of Candida albicans was found significantly and negatively correlated with levels of unstimulated whole saliva (UWS) and stimulated whole saliva (SWS)9.
The methods introduced in this manuscript can identify oral Candida infection based on characterized morphological attributes (e.g., the hyphae and yeast cells) in direct smear or after culturing10. The strain identification of the Candida using a Candida diagnostic agar is based on the formation of different colored colonies with varied morphology, which result from the cleavage of chromogenic substrates by species-specific enzymes11. In this manuscript, systematic methods for detecting oral Candida infection are introduced, including traditional oral Candida culture and rapid examination by potassium hydroxide (KOH) smear test and calcofluor white (CFW) staining assay10. Additionally, the antifungal susceptibility test, which can guide clinical oral Candida infection treatment, has been introduced. In actual situations, it is not necessary to perform all of the introduced methods in this manuscript; the oral Candida detection method(s) can be selected according to the purpose. The examination of oral Candida infection and the determination of Candida strains in pSS patients not only benefit the disease treatment but also help assess the characterization of oral candidiasis and the species profiles.

מחבר זרקור: אבחון קנדידה דרך הפה לקידום משטר הטיפול הקליני בחולי pSS

בדיקת זיהום קנדידה פומי בחולי תסמונת סיוגרן ראשונית

In this research, we present a protocol for the examination of oral candida infection in patients with primary Sjogren syndrome, which can be used for timely treatment to avoid infection-related complications. We provide a series of systematic, simple, and feasible methods for detecting oral candida infections, identifying candida strains, and testing the antifungal susceptibility of commonly-used drugs in patients with primary Sjogren's syndrome. Maybe our focus on the role of oral candida infection in the onset and the progression of primary Sjogren's syndrome pathologists in our future studies.

במחקר זה, 12 חולים עם pSS נבחרו כחולים מייצגים ונבדקו לזיהום קנדידה פומי (טבלה 1). בקרב המטופלים האלה, חלק מהמטופלים הציגו נגעים אוראליים טיפוסיים של זיהום קנדידה , כולל דלקת צ'יליטיס זוויתית (המאופיינת בסדקים בזוויות הפה, ייאווש והיפרמיה, איור 1A), בצקת אדומה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Oral Candida Diagnosis to Advance Clinical Treatment Regimen for pSS Patients at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת זיהום קנדידה אוראלי בחולים עם תסמונת סיוגרן ראשונית, אשר ניתן להשתמש בהם לטיפול בזמן, ולאחר מכן, הימנעות סיבוכים הקשורים.

Primary Sj&#246;gren's syndrome (pSS) is an autoimmune disease characterized by symptoms such as dry mouth, dry eyes, and other systematic symptoms. Due ...

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת זיהום קנדידה אוראלי בחולים עם תסמונת סיוגרן ראשונית, אשר ניתן להשתמש בו לטיפול בזמן כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום. אנו מספקים סדרה של שיטות שיטתיות, פשוטות ואפשריות לאיתור זיהומי קנדידה דרך הפה, זיהוי זני קנדידה ובדיקת הרגישות האנטי פטרייתית של תרופות נפוצות בחולים עם תסמונת סיוגרן ראשונית. אולי ההתמקדות שלנו בתפקיד של זיהום קנדידה אוראלי בהתפרצות ובהתקדמות של פתולוגים ראשוניים של תסמונת סיוגרן במחקרים העתידיים שלנו.

examination-oral-candida-infection-primary-sjgren-s-syndrome

Research

JoVE Journal

Medicine

Examination of Oral Candida Infection in Primary Sj&#246;gren&#39;s Syndrome Patients

568 Views.  Capital Medical University. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת זיהום קנדידה אוראלי בחולים עם תסמונת סיוגרן ראשונית, אשר ניתן להשתמש בו לטיפול בזמן כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום. אנו מספקים סדרה של שיטות שיטתיות, פשוטות ואפשריות לאיתור זיהומי קנדידה דרך הפה, זיהוי זני קנדידה ובדיקת הרגישות האנטי ...

Video: מחבר זרקור: אבחון קנדידה דרך הפה לקידום משטר הטיפול הקליני בחולי pSS

Primary Sj&#246;gren's syndrome (pSS) is an autoimmune disease characterized by symptoms such as dry mouth, dry eyes, and other systematic symptoms. Due to the hyposalivation experienced by pSS patients, oral dysbacteriosis often occurs. A common complication of pSS is the oral Candida infection. In this article, the authors describe systematic methods that can effectively diagnose oral Candida infection and identify the Candida strains using saliva, oral mucosal swabs, or mouthwash from pSS patients. The Sabouraud's Dextrose Agar (SDA), hyphal formation assay, potassium hydroxide (KOH) smear test, and calcofluor white (CFW) staining assay are used for the diagnosis of oral Candida infection. A Candida diagnostic agar is used for the identification of Candida strains. Finally, antifungal susceptibility testing is used to determine appropriate antifungal drug treatment. This standardized method can enhance the diagnosis, treatment, and future research of pSS-related oral Candida infections. Early diagnosis, using this method, can also prevent any complications arising due to delay in receiving appropriate treatment.

Here, we present a protocol for the examination of oral Candida infection in patients with primary Sj&#246;gren's syndrome, which can be used for timely treatment and, thereafter, avoiding related complications.

Sample Collection for Diagnosis of Oral Candida in pSS Patients

To begin, select the participants based on the framed inclusion criteria. For saliva collection, instruct the patient to hold the tube with a funnel and let the saliva flow gradually into the tube along the lower lip for 15 minutes. At the end, ask the participant to spit all the remaining saliva into the tube.In case of low, unstimulated saliva flow, swab the oral mucosa in infection-suspected areas at least 10 times, and let the patient rinse their mouth with five milliliters of PBS for one minute. Then collect the mouthwash in a 50-milliliter sterile tube and put the swab into it. Add one milliliter of PBS to the collected saliva and vortex the tube for one minute.