המחברים מודים על תמיכת המימון של קרן הגבולות החדשים במחקר של קנדה (NFRF), תוכנית גילוי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), ומלגות ההכשרה לתואר שני Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). המחברים גם רוצים להודות לקבוצתו של פרופ' יאויאו ז'או במקגיל על תמיכתם הטכנית בהדפסה תלת-ממדית של רכיבים מסוימים.

מין היתושים המשמש לפרוטוקול זה הוא נקבה בוגרת לא נגועה Aedes aegypti (A. aegypti), שקיבלה הקפאה ואוחסנה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. המין סופק על ידי NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center להפצה באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. לנתח את labium מן proboscis
<ol><li>בעזרת פינצטה, הניחו יתוש מת על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ וודאו שיש קצה מחודד בקצה החוטם (איור 2A).</li>
	<li>בזמן שאתם שומרים את היתוש על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל בעדינות מעל הלביום ליד ראשו של היתוש (איור 2B).</li>
	<li>ממשיכים לבצע חתך לאורך כל החצי העליון של הלביום (חתך של כ 80 מיקרומטר) עם עומק חדירה רדוד דרך עובי הלביום. הקפידו להפעיל לחץ קל על הלהב כדי לחתוך רק את הלביום אך לא את הפאשקוויל שנמצא מתחת.</li>
	<li>בעזרת זוג פינצטה, החזיקו היטב את ראש היתוש, ובעזרת זוג פינצטה מדויק נוסף, צבטו קלות את הלביום בכל מיקום בין הקצה המחודד למיקום החתך (איור 2B).<ol><li>משכו את הפינצטה שמחזיקה את הלביום לכיוון הקצה המחודד (איור 2C). המשיכו למשוך את הפינצטה עד שהלביום נקרע והוסר לחלוטין מהפשקוויל.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו את היתוש מתחת למיקרוסקופ ובדקו אם קצה הלברום קיים. אפשר לזהות זאת על-ידי נוכחות של קצה מחודד על הפשקוויל (איור 2D).</li>
</ol>2. הפרדת קצה הלברום משאר חברי הפשקוויל
<ol><li>מהדקים וסוגרים את הקצוות של סט פינצטות מדויקות ומניחים את קצה הפינצטה ממש ליד הלברום ליד קצהו.</li>
	<li>השתמשו בקצה הפינצטה כדי להפעיל כוח עדין על הלברום בכיוון המאונך לאורך הפאשקוויל (איור 3A).</li>
	<li>המשיכו לדחוף את הלברום על פני מגלשת הזכוכית עד שתושג הפרדה של הלברום משאר חברי הפשקוויל.</li>
	<li>בדקו את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהושגה הפרדה נכונה בין הלברום לבין חברי פשקוויל אחרים (איור 3, משמאל). אם ההפרדה נכשלה, עיין שוב בשלב 2.1.</li>
</ol>3. חיתוך קצה הלברום
<ol><li>בזמן שהלברום עדיין על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל מעל הלברום במרחק של כ~200 מיקרומטר מקצה הלברום (איור 4A). הפעילו בעדינות לחץ מספיק וחתכו את קצה הלברום עד הסוף. בעוד קצה הלברום צריך להיות קצר ככל האפשר, ~ 200 מיקרומטר הוא הטוב ביותר שהגישה הנוכחית יכולה להתמודד איתו.</li>
	<li>מדדו את אורך הלברום החתוך כדי לוודא שאורכו אינו עולה על 300 מיקרומטר (איור 4B) באמצעות כל תוכנת מדידה דיגיטלית. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- ImageJ14.</li>
</ol>4. תופסים את קצה הלברום
<ol><li>בעזרת זוג פינצטות מדויקות, אתרו ובודדו את קצה הלברום במגלשת הזכוכית. השליכו את כל החלקים שנותרו על מגלשת הזכוכית מלבד קצה הלברום.</li>
	<li>עם אותה פינצטה מדויקת, צובטים לאט ובקלילות את הלברום כך שהקצה החתוך חופשי וללא הפרעה על ידי הפינצטה. כמו כן, יש לוודא שהכיוון של הלברום מקביל לכיוון אורך הפינצטה והקצה החתוך של הלברום מצביע הרחק מגוף הפינצטה.</li>
	<li>לאחר שהדגימה נצבטה היטב, הסירו את כוח ההידוק המחזיק את קצות הפינצטה יחד. קצה הלברום יידבק לאחד מקצות הפינצטה.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ, בדקו את קצות הפינצטה וודאו שקצה הלברום נמצא על אחד מקצות הפינצטה (איור 5). אם קצה הלברום אינו נמצא בפינצטה, יש לחזור לשלב 4.2, ואם קצה הלברום אינו על הפינצטה וגם לא על מגלשת הזכוכית, יש לחזור לשלב 1.</li>
</ol>5. מריחת אפוקסי על קרן הקצוות
<ol><li>הניחו טיפה (~0.05 מ"ל) אפוקסי על קצה מגלשת זכוכית חדשה על ידי הטלת הדבק ישירות מהבקבוק/מיכל המקורי שלו. הניחו את מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי מתחת לתחנת הבדיקה והתמקדו בה.</li>
	<li>הרכיבו את מכלול המהדק ללא קצה על מכלול המהדק על ידי אבטחת הבסיס (כלומר, הקצה הגדול יותר), והותירו את קצה הפתח חופשי ותלוי בחלל. ודא שהחלק התחתון של מזנון AFM פונה כלפי מטה.</li>
	<li>הרכיבו את המניפולטור על תחנת הבדיקה.</li>
	<li>הרם את ציר Z של המניפולטור למצב שבו הקנטייבר חסר הקצה נמצא כמה מילימטרים מעל מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי.</li>
	<li>הזז ידנית את המניפולטור כך שהמעצור חסר הקצה יהיה גלוי בתצוגת השדה של המצלמה בתחנת הבדיקה.</li>
	<li>באמצעות המניפולטור, הזיזו את ה-AFM לאורך כיווני X ו-Y עד שקצה המזנון מונח ישירות מעל האפוקסי בקצה מגלשת הזכוכית.</li>
	<li>בעזרת המניפולטור שוב, הורידו באיטיות את המזנון חסר הקצה בכיוון Z מעבר לקצה מגלשת הזכוכית.</li>
	<li>כאשר המזנון מונמך ומתקרב למגלשת הזכוכית, המשיכו להוריד את המזנון לאט מאוד עד שהוא נוגע לראשונה באפוקסי. אין להנמיך את המגן עוד.</li>
	<li>בזהירות, הפעילו את המניפולטור כדי להזיז את הקנטיל באיטיות בכיוון X או Y והסירו את הקנטיל ממאגר האפוקסי על ידי הזזת הקנטיל ברציפות בכיוון שנבחר עד שהקנטיל מופרד לחלוטין מהאפוקסי במגלשת הזכוכית. למיכל חסר הקצה צריכה להיות בועה מיניאטורית של אפוקסי בקצהו, הנראית מתחת לתחנת הבדיקה.</li>
	<li>הרם את המגן בכיוון Z באמצעות המניפולטור.</li>
</ol>6. הצמדת קצה הלברום לקורה ללא קצה
<ol><li>סובב את המניפולטור על הציר הארוך של הקנילטור ב -90 מעלות והנח את המניפולטור על תחנת הבדיקה על צידו. בתצורה זו, העוביים לאורך ה-AFM הוא בכיוון האנכי.</li>
	<li>מקם את הפינצטה המדויקת המכילה את קצה הלברום מתחת למצלמת תחנת הבדיקה, כך שכל אורך קצה הלברום יהיה גלוי על צג המחשב.</li>
	<li>מקם את מכלול המניפולטור המחזיק את המהדק ואת הקנטליבר חסר הקצה מתחת למצלמת תחנת הגשוש, כך שכל אורכו של המהדק ללא קצה נראה על צג המחשב.</li>
	<li>מקדו את המיקרוסקופ של תחנת הגשושית על קצה הלברום ועל הקנטיליבר חסר החוד.</li>
	<li>כיוון את המזנון בניצב לקצה הלברום על-ידי סיבוב זהיר וידני של המניפולטור (איור 6A).</li>
	<li>באמצעות דרגות החופש של המניפולטור, הזיזו באיטיות את הקנטיליבר חסר הקצה בכיווני XY כך שהדבק שעל הקנטיל ייגע בקצה החתוך של קצה הלברום (איור 6B).</li>
	<li>לרפא את אפוקסי, מצק את המפגש בין cantilever ו יתושים labrum.</li>
	<li>לאחר שהאפוקסי נרפא, הפעילו בעדינות את המניפולטור בכיווני XY והרחיקו את המזנון מהפינצטה, תוך אימות שקצה הלברום עומד כעת על קרן הקנטיל חסרת הקצה (איור 6C).</li>
</ol>

בדיקת AFM ביו-היברידית עם יתוש לברום לחקר התנהגויות עקיצות

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vector+control+response+2017&#8211;2030.">Global vector control response 2017&#8211;2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mosquitoes&#8217;+painless+piercing.">Lessons from mosquitoes&#8217; painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li><li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle,+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle:+A+review.">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li><li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito&#8217;s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design.">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito&#8217;s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li><li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement.">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).</li><li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy.">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li><li>Garc&#237;a, R., Per&#233;z, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+atomic+force+microscopy+methods.">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li><li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone.">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li><li>M&#252;ller, D. J., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology.">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis:+An+elegant+biomicroelectromechanical+system.">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito.">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li><li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר.

שלב 1 של הפרוטוקול נועד לנקות את הדגימה הביולוגית של הלביום הלא רצוי. כדי להשיג זאת, מבצעים חתך על הלביום, אבל לא על הפשקוויל, שנמצא ישירות מתחת ללאביום (איור 1). מכיוון שהפאשיל והלביום אינם מחוברים זה לזה בממשק שלהם (כלומר, הלביום חופשי להחליק לאורך הפאשקוויל ונשמר במקומו רק ?...

ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) מהוות מעל 17% מכלל המחלות הזיהומיות, הגורמות ליותר מ -7,00,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. לדוגמה, כחיה הקטלנית ביותר בעולם, יתושים מפיצים פתוגנים רבים, כגון דנגי, מלריה וזיקה, באמצעות פרוקי רגליים הניזונים מדם, וכתוצאה מכך 700 מיליון זיהומים מדי שנה1. מחקרים לקראת פיתוח אמצעים יעילים למניעת VBDs הם בעלי חשיבות מכרעת, כולל חיקוי התנהגויות החדירה של יתושים כדי לחקור את מנגנוני העקיצה שלהם ומחקרים על חסמים פוטנציאליים כדי להוכיח את יעילותם במניעת חדירה. אתגר מרכזי אחד הוא לפתח גישות מתאימות לביצוע חקירות כאלה. נעשו מאמצים בספרות, כולל פיתוח מחטים בקנה מידה זעיר הדומות לגיאומטריה של עוקץ יתושים; עם זאת, רבים מהחומרים המשמשים לייצור מיקרו-מחטים אלה (כלומר, חומרים ויסקו-אלסטיים2, סיליקון (Si), זכוכית, קרמיקה3 וכו ') הם בעלי תכונות מכניות שונות מאשר החומר הביולוגי של היתוש. החומרים המהונדסים יכולים להיות שבירים ונוטים לשבר ואבזמים 3,4, בעוד שחוטמו של היתוש יכול לעמוד בשבר או באבזם טוב יותר4. היתרון של בדיקה ביו-היברידית המשתמשת בלברום של יתוש במקום בחומרים מהונדסים הוא שהיא יכולה להיות ייצוג מדויק יותר של מנגנון הפירסינג של יתושים. כמו כן, יש לשלב כלים מיוחדים עם מחטי מיקרו לביצוע מחקרים כמותיים, כגון מדידה מדויקת של כוח5, שאינה ניתנת להשגה בקלות עם הגדרות מותאמות אישית באמצעות מיקרו-מחטים מהונדסות.
הגישה המבוססת על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבטיחה בכך שהיא פועלת על ידי שימוש במקל עם קצה דק במיוחד הממוקם בזהירות קרוב לפני השטח של הדגימה. הקצה יכול לסרוק לרוחב או להילחץ לכיוונ/לתוך משטח, חווה כוחות מושכים או דוחים משתנים עקב האינטראקציות שלו עם מדגם6. אינטראקציות אלה מובילות לסטייה של הקנטילבר, אשר עוקבת על ידי השתקפות של קרן לייזר מראש הקנטיליבר אל פוטו-גלאי6. הרגישות יוצאת הדופן לתנועה של המערכת מאפשרת ל-AFM לבצע מגוון רחב של מדידות, כולל, אך לא רק, מיפוי מורפולוגי בדיוק פיקומטר, מדידות כוח החל מפיקוניוטון ועד מיקרוניוטון, וחקירות מולטיפיזיקליות מקיפות7. לדוגמה, ניתן לבצע הזחות AFM כדי להעריך במדויק את התגובה לכוח המופעל של מדגם וגם כדי למדוד את הקשיות, האלסטיות ותכונות מכניות אחרות של מדגם על ידי צימוד עם מודלים אנליטיים מתאימים8. הגשושית של AFM עשויה לרוב מסיליקון (Si) או סיליקון ניטריד (Si3N4)8 באורך של 20-300 מיקרומטר9 ורדיוס קצה בסדר גודל של כמה עד עשרות ננומטרים10. רדיוס קצה קנה המידה הננומטרי יכול להיות אידיאלי עבור יישומים כגון הדמיה ברזולוציה גבוהה; עם זאת, אין לו את המאפיינים של עוקצים ביולוגיים למחקרים המנסים לחקות התנהגויות חדירה במונחים של נוקשות, רדיוס, צורה ויחס גובה-רוחב. לדוגמה, מבנה המיקרו-מחט של יתוש הוא הפשיקל, שיש לו יחס גובה-רוחב של ~6011 (אורך ~ 1.5 מ"מ עד 2 מ"מ; קוטר ~ 30 מיקרומטר)12. בעוד שניתן להניח שגשושית AFM קונבנציונלית דומה לעקיצות ביולוגיות כמו לברום, התכונות והממדים החומריים הייחודיים שלה לא ישקפו את המצב האמיתי במהלך נשיכה.
כדי לאפשר חקירה כמותית של התנהגויות חדירה המחקות עקיצות ביולוגיות של חרקים או בעלי חיים אחרים עם עוקץ, כאן מפותח תהליך לייצור מכלי AFM ביו-היברידיים עם עוקץ ביולוגי כקצהו. כמקרה בוחן, הודגם בהצלחה מקל AFM עם קצה לברום יתוש מחובר. תוך רתימת מידע קיים מהספרות על כוחות ההחדרה האופייניים שיתוש משתמש בהם כדי לחדור דרך עורו של קורבן12,13, AFM ביו-היברידי זה יכול לאפשר חיקוי כמעט אמיתי של עקיצות יתושים תחת AFM רגיל. הפרוטוקול של מינוף עוקצים מיקרו-ביולוגיים לייצור מיכלי AFM ביו-היברידיים יכול להיות מיושם גם בפיתוח של מכלי AFM ביו-היברידיים חדים אחרים מבוססי עוקץ חד לחקירות כמותיות של מגוון מנגנוני נשיכה.
טרמינולוגיות סכמה של חוטם ומרכיבי העניין שלו מוצגים באיור 1, וההגדרות שלהם הן: (1) פרובוסקיס: חלק גוף מפיו של יתוש המאפשר ליתוש להאכיל את עצמו, עם מבנה של קליפת ליבה המורכב מהפשקוויל (הליבה) והלאביום (קונכייה), (2) לאביום: הכיסוי החיצוני הכהה והקהה של חוטם2, (3) פשקוויל: קבוצה של מחטים דקות הכלולות בתוך הלביום, כולל שתי מקסילות, שתי לסתות, היפופרינקס ולברום2, (4) היפופרינקס: אחראי על הפרשת רוק למחזור הדם של הפונדקאי2, (5) מקסילה: חבר משונן המסייע במנגנון ההזנה2, (5) מנדבלים: בדומה למקסילה, הם מסייעים ליתוש במנגנון ההזנה ויש להם קצה חד2, (6) לברום: האיבר העיקרי לחדירה לעור הקורבן, שהוא הרבה יותר גדול מהמקסילה, הלסת התחתונה וההיפופרינקס. יש לו גם מבנים חושיים המאפשרים לו למצוא כלי דם ותעלות פנימיות מתחת לעור2, (7) מניפולטור: הרכבה עם שלוש דרגות חופש ודיוק בקנה מידה מיקרוני למיקום, המאפשר תנועה בכיווני XYZ, (8) הרכבת מהדק: מהדק 2 חלקים בהתאמה אישית המורכב על המניפולטור המשמש להידוק ה- AFM חסר הקצה במהלך הניסוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

יתושים, הידועים לשמצה כבעלי החיים הקטלניים ביותר לבני אדם בשל יכולתם להעביר מחלות, מהווים אתגר מתמשך לבריאות הציבור. אסטרטגיית המניעה העיקרית הנמצאת בשימוש כיום כוללת חומרים דוחי כימיקלים, אשר לעתים קרובות מתגלים כלא יעילים מכיוון שיתושים מפתחים עמידות במהירות. כתוצאה מכך, המצאת שיטות מניעה חדשות היא חיונית. פיתוח כזה תלוי בהבנה מעמיקה של התנהגויות עקיצת יתושים, מה שמחייב מערך ניסויי שמשכפל במדויק תרחישי עקיצה אמיתיים עם פרמטרים של בדיקה נשלטת ומדידות כמותיות. כדי לגשר על פער זה, הונדס מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM), הכולל עוקץ ביולוגי - במיוחד, לברום יתושים - כקצהו. בדיקה ביו-היברידית זו, התואמת למערכות AFM סטנדרטיות, מאפשרת סימולציה כמעט אותנטית של התנהגויות חדירת יתושים. שיטה זו מסמנת צעד קדימה במחקר הכמותי של מנגנוני עקיצה, מה שעשוי להוביל ליצירת מחסומים יעילים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) ולפתוח אפיקים חדשים במאבק במחלות המועברות על ידי יתושים.

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

מחבר זרקור: פיתוח מכלי AFM ביו-היברידיים לניתוח כמותי של מנגנוני עקיצת יתושים

פיתוח גשושית ביו-היברידית מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי מבוסס יתושים

We're looking to develop an AFM cantilever to potentially quantitatively study the biting mechanisms of the mosquito. Our protocol offers a new method for creating accurate, controllable, and reliable AFM probes in order to study animal biting or stinging processes. Our protocol aims at accurately simulating the animal biting process, causing current methodologies to either be uncontrollable, unreproducible in a reliable manner, or in certain cases completely inaccurate.The impact of our work is twofold. The first, we create a protocol that enables other researchers to fabricate their own custom bio-hybrid AFM cantilevers. Secondly, our work paves the way for creating other protocols that merge testing systems with biological material for creating more realistic testing scenarios.

תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של גשושית AFM ביו-היברידית מפוברקת ניתן למצוא באיור 7. קצה הלברום הודבק בהצלחה לקורה חסרת החוד. בשל העקמומיות הטבעית של עוקץ יתושים ואת הפעולה הידנית של הפרוטוקול המוצג, קשה מאוד להשיג cantilever עם קצה עוקץ בניצב לחלוטין cantilever. הזווית הלא מר...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

מחקרים כמותיים ומבוקרים של התנהגויות עקיצת חרקים חיוניים לגיבוש אסטרטגיות יעילות למאבק במחלות המועברות על ידי וקטורים. בהקשר זה מוצגת שיטה לייצור מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM).

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

אנחנו מחפשים לפתח מקל AFM כדי לחקור כמותית את מנגנוני העקיצות של היתוש. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה חדשה ליצירת בדיקות AFM מדויקות, ניתנות לשליטה ואמינות על מנת לחקור תהליכי נשיכה או עקיצה של בעלי חיים. הפרוטוקול שלנו נועד לדמות במדויק את תהליך נשיכת בעלי החיים, ולגרום למתודולוגיות הנוכחיות להיות בלתי נשלטות, בלתי ניתנות לשחזור בצורה אמינה, או במקרים מסוימים לחלוטין לא מדויקות.ההשפעה של העבודה שלנו היא כפולה. הראשון, אנו יוצרים פרוטוקול המאפשר לחוקרים אחרים לייצר מכלי AFM ביו-היברידיים מותאמים אישית משלהם. שנית, העבודה שלנו סוללת את הדרך ליצירת פרוטוקולים אחרים הממזגים מערכות בדיקה עם חומר ביולוגי ליצירת תרחישי בדיקה מציאותיים יותר.

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

445 Views.  McGill University. אנחנו מחפשים לפתח מקל AFM כדי לחקור כמותית את מנגנוני העקיצות של היתוש. הפרוטוקול שלנו מציע שיטה חדשה ליצירת בדיקות AFM מדויקות, ניתנות לשליטה ואמינות על מנת לחקור תהליכי נשיכה או עקיצה של בעלי חיים. הפרוטוקול שלנו נועד לדמות במדויק את תהליך נשיכת בעלי החיים, ולגרום למתודולוג?...

Video: מחבר זרקור: פיתוח מכלי AFM ביו-היברידיים לניתוח כמותי של מנגנוני עקיצת יתושים

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.