Yazarlar, Kanada'nın New Frontiers in Research Fund (NFRF), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif programı ve Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT) yüksek lisans eğitim burslarından sağlanan finansman desteğini kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca, bazı bileşenlerin 3D baskısı konusundaki teknik destekleri için Prof. Yaoyao Zhao'nun McGill'deki grubuna teşekkür etmek istiyor.

Bu protokol için kullanılan sivrisinek türü, enfekte olmamış yetişkin bir dişi Aedes aegypti (A. aegypti), dondurularak alınır ve -20 °C derece dondurucuda saklanır. Tür, BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920 aracılığıyla dağıtılmak üzere NIH/NIAID Filariasis Araştırma Reaktifi Kaynak Merkezi tarafından sağlandı. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Labiumun hortumdan çıkarılması
<ol><li>Cımbız kullanarak, ölü bir sivrisineği mikroskop altında bir cam slayt üzerine yerleştirin ve hortumun ucunda konik bir uç olduğundan emin olun (Şekil 2A).</li>
	<li>Sivrisineği cam kaydırak üzerinde tutarken, sivrisineğin başının yanındaki labiumun üzerine nazikçe bir neşter bıçağı yerleştirin (Şekil 2B).</li>
	<li>Labiumun kalınlığı boyunca sığ bir penetrasyon derinliği ile labiumun tüm üst yarısı boyunca (yaklaşık 80 μm'lik bir kesi) bir kesi yapmaya devam edin. Bıçağa, yalnızca labium'u kesecek, altında bulunan fasikülü kesmeyecek şekilde hafif bir baskı uyguladığınızdan emin olun.</li>
	<li>Bir cımbızla, sivrisineğin başını sıkıca tutun ve başka bir hassas cımbızla, konik uç ile insizyonun yeri arasındaki herhangi bir pozisyonda labium'u hafifçe sıkıştırın (Şekil 2B).<ol><li>Labium'u tutan cımbızı konik uç yönünde çekin (Şekil 2C). Labium serbest kalana ve fasikülden tamamen çıkarılana kadar cımbızı çekmeye devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sivrisineği mikroskobun altına yerleştirin ve labrumun ucunun mevcut olup olmadığını kontrol edin. Bu, fasikül üzerinde konik bir ucun varlığı ile tanımlanabilir (Şekil 2D).</li>
</ol>2. Labrumun ucunu diğer fasikül üyelerinden ayırmak
<ol><li>Bir dizi hassas cımbızın uçlarını sıkıştırın ve kapatın ve cımbızın ucunu labrumun hemen yanına, ucuna yakın bir yere yerleştirin.</li>
	<li>Fasikülün uzunluğuna dik yönde labruma hafif bir kuvvet uygulamak için cımbız ucunu kullanın (Şekil 3A).</li>
	<li>Labrumun diğer fasikül üyelerinden ayrılması sağlanana kadar labrumu cam slayt boyunca itmeye devam edin.</li>
	<li>Labrum ve diğer fasikül elemanları arasında uygun ayrımın sağlandığını doğrulamak için numuneyi mikroskop altında inceleyin (Şekil 3, solda). Ayırma başarısız olursa, adım 2.1'e geri dönün.</li>
</ol>3. Labrumun ucunun kesilmesi
<ol><li>Labrum hala cam slayt üzerindeyken, labrumun ucundan yaklaşık ~ 200 μm mesafede labrumun üzerine bir neşter bıçağı yerleştirin (Şekil 4A). Nazikçe yeterli basınç uygulayın ve labrumun ucunu tamamen kesin. Labrum ucu ideal olarak mümkün olduğunca kısa olmalıdır, ancak ~ 200 μm mevcut yaklaşımın üstesinden gelebileceği en iyisidir.</li>
	<li>Herhangi bir dijital ölçüm yazılımı kullanarak 300 μm'den uzun olmadığından emin olmak için kesilen labrumun uzunluğunu ölçün (Şekil 4B). Bu protokolde ImageJkullanılmıştır 14.</li>
</ol>4. Labrumun ucunu tutmak
<ol><li>Bir çift hassas cımbızla, labrumun ucunu cam slayt üzerinde bulun ve izole edin. Labrumun ucu dışında cam slayt üzerinde kalan her parçayı atın.</li>
	<li>Aynı hassas cımbızla, labrumu yavaşça ve hafifçe sıkıştırın, böylece kesilen uç cımbız tarafından serbest kalır ve engellenmez. Ayrıca, labrumun yönünün cımbızın uzunluğunun yönüne paralel olduğundan ve labrumun kesik ucunun cımbızın vücudundan uzağa baktığından emin olun.</li>
	<li>Numune sıkıca sıkıştıktan sonra, cımbızın uçlarını bir arada tutan sıkıştırma kuvvetini çıkarın. Labrumun ucu cımbızın uçlarından birine yapışacaktır.</li>
	<li>Mikroskop altında, cımbızın uçlarını inceleyin ve labrumun ucunun cımbızın uçlarından birinde bulunduğundan emin olun (Şekil 5). Labrumun ucu cımbızın üzerinde değilse, adım 4.2'ye geri dönün ve labrumun ucu cımbızda veya cam slaytta değilse, adım 1'e geri dönün.</li>
</ol>5. Uçsuz konsol kirişine epoksi uygulanması
<ol><li>Yapıştırıcıyı orijinal şişesinden/kabından doğrudan damlatarak yeni bir cam slaytın kenarına bir damla (~ 0.05 mL) epoksi yerleştirin. Epoksi içeren cam slaytı prob istasyonunun altına yerleştirin ve üzerine odaklanın.</li>
	<li>Ucu olmayan AFM konsolunu cl'ye monte edinamp tabanı (yani daha büyük ucu) sabitleyerek tertibat, konsol ucunu serbest bırakarak ve boşlukta asılı bırakarak. AFM konsolunun alt kısmının aşağı baktığından emin olun.</li>
	<li>Manipülatörü prob istasyonuna monte edin.</li>
	<li>Manipülatörün Z eksenini, uçsuz konsolun epoksi içeren cam sürgünün birkaç milimetre üzerinde olduğu bir konuma yükseltin.</li>
	<li>Manipülatörü, prob istasyonundaki kameranın alan görünümünde uçsuz konsol görünecek şekilde manuel olarak hareket ettirin.</li>
	<li>Manipülatörü kullanarak, konsolun ucu doğrudan cam sürgünün kenarındaki epoksinin üzerinde durana kadar AFM konsolunu X ve Y yönleri boyunca hareket ettirin.</li>
	<li>Manipülatörü tekrar kullanarak, uçsuz konsolu cam sürgünün kenarı üzerinden Z yönünde yavaşça indirin.</li>
	<li>Konsol indirilirken ve cam kızağa yaklaşırken, konsolu epoksiye ilk temas edene kadar çok yavaş indirmeye devam edin. Konsolu daha fazla indirmeyin.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde, konsolu X veya Y yönünde yavaşça hareket ettirmek için manipülatörü devreye sokun ve konsol cam slayt üzerindeki epoksiden tamamen ayrılana kadar konsolu sürekli olarak seçilen yönde hareket ettirerek konsolu epoksi havuzundan çıkarın. Uçsuz konsol, ucunda prob istasyonunun altında görülebilen minyatür bir epoksi kabarcığa sahip olmalıdır.</li>
	<li>Manipülatörü kullanarak konsolu Z yönünde kaldırın.</li>
</ol>6. Labrumun ucunun uçsuz konsol kirişine yapıştırılması
<ol><li>Manipülatörü konsolun uzun ekseni etrafında 90 derece döndürün ve manipülatörü yan tarafındaki prob istasyonuna yerleştirin. Bu konfigürasyonda, AFM konsolunun uzunluğu boyunca kalınlıklar dikey yöndedir.</li>
	<li>Labrumun ucunu içeren hassas cımbızları, labrumun ucunun tüm uzunluğu bilgisayar monitöründe görünecek şekilde prob istasyonu kamerasının altına yerleştirin.</li>
	<li>cl'yi tutan manipülatör tertibatınıamp ve uçsuz konsolu prob istasyonu kamerasının altına, uçsuz konsolun tüm uzunluğu bilgisayar monitöründe görünecek şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Prob istasyonu mikroskobunu labrumun ucuna ve uçsuz konsola odaklayın.</li>
	<li>Manipülatörü dikkatli ve manuel olarak döndürerek konsolu labrumun ucuna dik olarak yönlendirin (Şekil 6A).</li>
	<li>Manipülatörün serbestlik derecelerini kullanarak, uçsuz konsolu, konsol üzerindeki yapıştırıcı labrum ucunun kesik ucuna temas edecek şekilde XY yönlerinde yavaşça hareket ettirin (Şekil 6B).</li>
	<li>Konsol ve sivrisinek labrumu arasındaki kesişimi katılaştırarak epoksiyi sertleştirin.</li>
	<li>Epoksi sertleştikten sonra, manipülatörü XY yönlerinde nazikçe devreye sokun ve konsolu cımbızdan uzaklaştırın, böylece labrumun ucunun artık uçsuz konsol kirişi üzerinde durduğunu doğrulayın (Şekil 6C).</li>
</ol>

Isırma Davranışlarını İncelemek için Sivrisinek Labrumlu Biyo-Hibrit AFM Probu

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vector+control+response+2017&#8211;2030.">Global vector control response 2017&#8211;2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mosquitoes&#8217;+painless+piercing.">Lessons from mosquitoes&#8217; painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li><li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle,+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle:+A+review.">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li><li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito&#8217;s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design.">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito&#8217;s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li><li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement.">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).</li><li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy.">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li><li>Garc&#237;a, R., Per&#233;z, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+atomic+force+microscopy+methods.">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li><li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone.">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li><li>M&#252;ller, D. J., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology.">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis:+An+elegant+biomicroelectromechanical+system.">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito.">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li><li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Protokolün 1. adımı, istenmeyen labiumun biyolojik örneğini temizlemek içindir. Bunu başarmak için labium üzerinde bir kesi yapılır, ancak doğrudan labiumun altında duran fasikül üzerinde bir kesi yapılmaz (Şekil 1). Fasikül ve labium arayüzlerinde birleştirilmediğinden (yani, labium fasikül boyunca serbestçe kayabilir ve sadece sivrisinek kafasına bağlanmasıyla yerinde tutulur), yapılan kesi, labiumun bir kısmını sivrisinek kafasından ayırmak ve böylece dı?...

Dünya Sağlık Örgütü (WHO), vektör kaynaklı hastalıkların (VBD'ler) tüm bulaşıcı hastalıkların %17'sinden fazlasını oluşturduğunu ve dünya çapında yılda 7.000.000'den fazla ölüme neden olduğunu bildirmiştir. Örneğin, dünyanın en ölümcül hayvanı olan sivrisinekler, kanla beslenen eklembacaklılar yoluyla dang humması, sıtma ve Zika gibi çok sayıda patojeni yayarak her yıl 700 milyon enfeksiyona neden olur1. Sivrisineklerin ısırma mekanizmalarını araştırmak için penetrasyon davranışlarını taklit etmek ve penetrasyonu önlemedeki etkinliklerini kanıtlamak için potansiyel engellerin incelenmesi de dahil olmak üzere, VBD'leri önlemek için etkili önlemlerin geliştirilmesine yönelik araştırmalar çok önemlidir. Önemli zorluklardan biri, bu tür araştırmaları gerçekleştirmek için uygun yaklaşımlar geliştirmektir. Literatürde, bir sivrisinek iğnesinin geometrisine benzeyen mikro ölçekli iğnelerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çabalar sarf edilmiştir; bununla birlikte, bu mikro iğneleri yapmak için kullanılan malzemelerin çoğu (yani, viskoelastik malzemeler2, silikon (Si), cam, seramik3, vb.), sivrisinek hortumunun biyolojik malzemesinden farklı mekanik özelliklere sahiptir. Mühendislik malzemeleri kırılgan olabilir ve kırılmaya ve burkulmayaeğilimli olabilir 3,4, oysa sivrisineğin hortumu kırılmaya veya burkulmaya daha iyi dayanabilir4. Mühendislik malzemeleri yerine bir sivrisineğin labrumunu kullanan biyo-hibrit bir proba sahip olmanın yararı, sivrisineklerin delici mekanizmasının daha doğru bir temsili olabilmesidir. Ayrıca, mühendislik ürünü mikro iğneler kullanılarak özelleştirilmiş kurulumlarla kolayca elde edilemeyen5 kuvvetinin doğru ölçümü gibi nicel çalışmaları gerçekleştirmek için özel aletler mikro iğnelerle entegre edilmelidir.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tabanlı yaklaşım, bir numunenin yüzeyine dikkatlice yerleştirilmiş ultra ince uçlu bir konsol kullanarak çalışması açısından umut vericidir. Uç, bir numune6 ile etkileşimleri nedeniyle değişen çekici veya itici kuvvetlere maruz kalarak bir yüzeyi tarayabilir veya bir yüzeye doğru / içine bastırılabilir. Bu etkileşimler, konsolun üst kısmından bir lazer ışınının bir fotodetektöre6 yansımasıyla izlenen konsolun sapmasına yol açar. Sistemin hareketine karşı olağanüstü hassasiyeti, AFM'nin pikometre doğruluğu ile morfolojik haritalama, pikonewtonlardan mikronewtonlara kadar değişen kuvvet ölçümleri ve kapsamlı multifizik araştırmaları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli ölçümler yapmasını sağlar7. Örneğin, bir numunenin uygulanan kuvvete tepkisini hassas bir şekilde değerlendirmek ve ayrıca uygun analitik modellerle birleştirilerek bir numunenin sertliğini, elastikiyetini ve diğer mekanik özelliklerini ölçmek için AFM girintileri yapılabilir8. AFM'nin probu en yaygın olarak silikon (Si) veya silisyum nitrürden (Si3N4) yapılır.8 20-300 μm9 uzunluğunda ve birkaç ila onlarca nanometre10 mertebesinde bir uç yarıçapı. Nanometre ölçeği uç yarıçapı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi uygulamalar için ideal olabilir; Bununla birlikte, sertlik, yarıçap, şekil ve en boy oranı açısından penetrasyon davranışlarını taklit etmeye çalışan çalışmalar için biyolojik iğnelerin özelliklerine sahip değildir. Örneğin, bir sivrisineğin mikroiğne yapısı, ~6011 (uzunluk ~ 1,5 mm ila 2 mm; çap ~ 30 μm) en boy oranına sahip fasiküldür12. Konvansiyonel bir AFM probunun bir labrum gibi biyolojik bir iğneye benzediği varsayılabilirken, farklı malzeme özellikleri ve boyutları, bir ısırma sırasındaki gerçek durumu yansıtmayacaktır.
Böceklerin veya iğneli diğer hayvanların biyolojik ısırıklarını taklit eden penetrasyon davranışlarının nicel araştırmalarını mümkün kılmak için, burada, ucu biyolojik bir iğne olan biyo-hibrit AFM konsolları üretmek için bir süreç geliştirilmiştir. Bir vaka çalışması olarak, bir sivrisinek labrumunun ucu takılı bir AFM konsolu başarıyla gösterildi. Bir sivrisineğin kurbanın derisini delmek için kullandığı tipik yerleştirme kuvvetleri12,13 hakkındaki literatürdeki mevcut bilgilerden yararlanan bu biyo-hibrit AFM konsolu, normal bir AFM altında sivrisinek ısırıklarının neredeyse gerçek taklidine potansiyel olarak izin verebilir. Biyo-hibrit AFM konsollarını imal etmek için mikro biyolojik iğnelerden yararlanma protokolü, çeşitli ısırma mekanizmalarının kantitatif araştırmaları için diğer keskin stinger bazlı biyohibrit AFM konsollarının geliştirilmesine de uygulanabilir.
Terminoloji Bir hortumun şeması ve ilgilenilen bileşenleri Şekil 1'de gösterilmiştir ve tanımları şöyledir: (1) Hortum: Bir sivrisineğin ağzından çıkan ve sivrisineğin kendi kendini beslemesine izin veren, fasikül (çekirdek) ve labiumdan (kabuk) oluşan bir çekirdek-kabuk yapısına sahip bir vücut parçası, (2) Labium: bir hortumun koyu ve künt dış örtüsü2, (3) Fasikül: iki maksilla, iki mandibula, bir hipofarenks ve bir labrum2 dahil olmak üzere labiumun içinde bulunan bir grup ince iğne, (4) Hipofarenks: konakçının kan dolaşımına tükürük salgılamaktan sorumludur2, (5) Maksilla: beslenme mekanizmasına yardımcı tırtıklı üye2, (5) Mandibulalar: maksillaya benzer şekilde, sivrisineğe beslenme mekanizmasında yardımcı olurlar ve keskin bir uca sahiptirler2, (6) Labrum: maksilla, mandibula ve hipofarenksten çok daha büyük olan bir kurbanın derisine nüfuz etmek için ana üye. Ayrıca deri altındaki kan damarlarını ve iç kanalları bulmasını sağlayan duyusal yapılara sahiptir2, (7) Manipülatör: XYZ yönlerinde harekete izin veren, konumlandırma için üç serbestlik derecesine ve mikron ölçeğinde doğruluğa sahip bir düzenek, (8) Kelepçe düzeneği: deney sırasında uçsuz AFM konsolunu sıkıştırmak için kullanılan manipülatöre monte edilmiş özel yapım 2 parçalı bir kelepçe.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

Hastalık bulaştırma kapasiteleri nedeniyle insanlar için en ölümcül hayvanlar olarak ün salmış sivrisinekler, halk sağlığı için kalıcı bir sorun teşkil etmektedir. Şu anda kullanımda olan birincil önleme stratejisi, sivrisinekler hızla direnç geliştirdikçe genellikle etkisiz olduğu kanıtlanan kimyasal kovucuları içerir. Sonuç olarak, yeni önleyici yöntemlerin icadı çok önemlidir. Bu tür bir gelişme, sivrisinek ısırma davranışlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına dayanır ve kontrol edilebilir test parametreleri ve nicel ölçümlerle gerçek ısırma senaryolarını doğru bir şekilde kopyalayan deneysel bir kurulum gerektirir. Bu boşluğu doldurmak için, ucu olarak biyolojik bir iğne - özellikle bir sivrisinek labrumu - içeren bir biyo-hibrit atomik kuvvet mikroskobu (AFM) probu tasarlandı. Standart AFM sistemleriyle uyumlu olan bu biyo-hibrit prob, sivrisinek penetrasyon davranışlarının neredeyse otantik bir simülasyonunu sağlar. Bu yöntem, ısırma mekanizmalarının kantitatif çalışmasında ileriye doğru atılmış bir adımdır ve potansiyel olarak vektör kaynaklı hastalıklara (VBD'ler) karşı etkili bariyerlerin oluşturulmasına ve sivrisineklerle bulaşan hastalıklara karşı mücadelede yeni yollar açılmasına yol açar.

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

Yazar Gündemi: Sivrisinek Isırma Mekanizmalarının Kantitatif Analizi için Biyo-Hibrit AFM Konsollarının Geliştirilmesi

Biyo-Hibrit Sivrisinek Stinger Tabanlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Probunun Geliştirilmesi

Fabrikasyon biyo-hibrit AFM probunun taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri Şekil 7'de bulunabilir. Labrumun ucu, uçsuz konsol kirişine başarıyla yapıştırıldı. Sivrisinek iğnelerinin doğal eğriliği ve sunulan protokolün manuel olarak çalıştırılması nedeniyle, konsola mükemmel şekilde dik bir iğne ucu olan bir konsol elde etmek son derece zordur. Stinger ile konsola dik hayali bir merkez çizgisi arasındaki merkez dışı açı genellikle ~10 derecedir. Bi...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

Böcek ısırma davranışlarına yönelik nicel ve kontrollü araştırmalar, vektör kaynaklı hastalıklarla mücadelede etkili stratejiler geliştirmek için çok önemlidir. Bu bağlamda, bir biyo-hibrit atomik kuvvet mikroskobu (AFM) probu üretmek için bir yöntem tanıtılmaktadır.

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

Sivrisineklerin ısırma mekanizmalarını potansiyel olarak nicel olarak incelemek için bir AFM konsolu geliştirmek istiyoruz. Protokolümüz, hayvan ısırma veya sokma süreçlerini incelemek için doğru, kontrol edilebilir ve güvenilir AFM probları oluşturmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Protokolümüz, hayvan ısırma sürecini doğru bir şekilde simüle etmeyi, mevcut metodolojilerin kontrol edilemez, güvenilir bir şekilde tekrarlanamaz veya bazı durumlarda tamamen yanlış olmasına neden olmayı amaçlamaktadır.Çalışmalarımızın etkisi iki yönlüdür. Birincisi, diğer araştırmacıların kendi özel biyo-hibrit AFM konsollarını üretmelerini sağlayan bir protokol oluşturuyoruz. İkinci olarak, çalışmamız, daha gerçekçi test senaryoları oluşturmak için test sistemlerini biyolojik materyalle birleştiren diğer protokollerin oluşturulmasının önünü açıyor.

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

476 Görüntüleme.  McGill University. Sivrisineklerin ısırma mekanizmalarını potansiyel olarak nicel olarak incelemek için bir AFM konsolu geliştirmek istiyoruz. Protokolümüz, hayvan ısırma veya sokma süreçlerini incelemek için doğru, kontrol edilebilir ve güvenilir AFM probları oluşturmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Protokolümüz, hayvan ısırma sürecini doğru bir şekilde simüle etmeyi, mevcut metodolojilerin kontrol edilemez, güvenilir bir şekilde tekrarlanamaz veya bazı durumlarda tamamen yan...

Video: Yazar Gündemi: Sivrisinek Isırma Mekanizmalarının Kantitatif Analizi için Biyo-Hibrit AFM Konsollarının Geliştirilmesi

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.