אנו מכירים בתרומות של Mgr. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת צ'ארלס) לסריקת שקופיות שלמות ולפרויקט "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140), שסיפק לנו את המשאבים החישוביים למחקר זה. הטכנאים יאנה דוסודילובה ויאן יאבורק ידועים על עזרתם הטכנית המצוינת. מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, מענק N°856620, ומשרד הבריאות של צ'כיה, מענק AZV NU21-03-00506, ועל ידי תוכנית Cooperatio (דיסציפלינות כירורגיות). מתקן הליבה של מיקרוסקופיה Vinicna ממומן במשותף על ידי פרויקט RI הגדול של צ'כיה-BioImaging LM2023050.

פרוטוקול זה היה חלק ממחקר שנערך בהתאם לאמות המידה האתיות שנקבעו בהצהרת הלסינקי (גרסת 2013); היא אושרה על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה ובית החולים האוניברסיטאי בפילזן (118/2021, 11 במרץ 2021). איור 1 מציג סיכום של השיטות שננקטו.
1. בחירת בלוקים רקמת FFPE
<ol><li>אחזר מזהי בלוקים מסוג FFPE מתיקי מטופלים בעזרת רופאים מטפלים או פתולוגים.</li>
	<li>בקש את בלוקי FFPE מארכיון הפתולוגיה המקומי.</li>
	<li>עבור כל מטופל, בחר 2-3 בלוקים FFPE המכילים רקמת גידול קיימא, עדיף עם אזור peritumor שמסביב כבד שאינו סרטני. הערה: מומלץ לקבל חוות דעת של פתולוג מומחה לבחירה זו. הערכה היסטולוגית של הכבד שאינו גידולי, יחד עם נתונים אנמנסטיים, קליניים ומעבדתיים שימשו להגדרת האטיולוגיה הבסיסית של HCC.</li>
</ol>2. Deparaffinization ו rehydration של רקמת FFPE
<ol><li>חתכו קטע רקמה אחד או שניים בעובי 4 מיקרומטר מכל אחד מגושי רקמת FFPE על מיקרוטום. הערה: עובי הקטעים יכול להיות בין 3 מיקרומטר ל -5 מיקרומטר ללא השפעת כתמים מורגשת; עם זאת, עובי של 4 מיקרומטר הוא הסטנדרט.</li>
	<li>הכניסו את המקטעים לאמבט מים (42°C) כדי להסיר קמטים.</li>
	<li>הרכיבו את המגלשות על ידי הרמתן והנחתן על מגלשה מיקרוסקופית מזכוכית טעונה חיובית. לאחר מכן, יש למרוח את המגלשות לייבוש בטמפרטורת הסביבה (AT) למשך 24 שעות.</li>
	<li>הניחו את המגלשות בתרמוסטט (56°C) למשך שעה אחת.</li>
	<li>השתמש autostainer כדי deparaffinize את החלקים בתמיסת שעווה-1 (30 s ב 72 ° C), תמיסת שעווה-2 (10 s ב 72 ° C), תמיסת שעווה-3 (10 s ב AT), אתנול 96%-1 (10 שניות), אתנול 96%-2 (10 שניות), אתנול 96%-3 (10 שניות).</li>
	<li>השתמש במכתים אוטומטיים כדי להחזיר לחות לחלקים בתמיסת שטיפה-1 (10 שניות, AT), תמיסת כביסה-2 (10 שניות, AT) ותמיסת כביסה-3 (5 דקות, AT).</li>
</ol>3. ביצוע IHC במכתים אוטומטי לחלוטין
הערה: IHC מבוצע בהתאם לפרוטוקול היצרן. השלבים מוסברים בקצרה להלן.
<ol><li>שיטת שליפת אנטיגן<ol><li>אחזור אנטיגן באמצעות הליך אחזור אפיטופים (ER) המושרה בחום בתמיסת מיון עם pH גבוה (למשל, Tris-EDTA): פתרון ER-1 (10 שניות, AT), תמיסת ER-2 (10 שניות, AT), תמיסת ER-3 (20 דקות ב- 100 ° C), תמיסת ER-4 (12 דקות, AT).</li>
		<li>שטפו את המגלשה בתמיסת כביסה במשך 3 פעמים (30 שניות כל אחת) ו-1 x (3 דקות).</li>
		<li>חסום פרוקסידז אנדוגני באמצעות תמיסת בלוק מי חמצן למשך 5 דקות ב- AT.</li>
		<li>יש לשטוף בתמיסת כביסה למשך 3 פעמים (30 שניות כל אחת).</li>
		<li>חסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים עם בלוק חלבון עבור NKp46 רק למשך 30 דקות ב- AT.</li>
	</ol></li>
	<li>קשירה עם נוגדנים ראשוניים: יש לדגור עם נוגדנים ראשוניים למשך 15 דקות ב-AT, ולאחר מכן לשטוף בתמיסת שטיפה למשך 3x (30 שניות כל אחת).</li>
	<li>עבור קשירת נוגדנים משנית, בצע את השלבים המתוארים להלן.<ol><li>יש לדגור עם נוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידז חזרת למשך 8 דקות ב-AT.</li>
		<li>יש לשטוף בתמיסת כביסה במשך 2 פעמים (2 דקות כל אחת) ופעם אחת במים נטולי יונים.</li>
		<li>דמיינו את התגובה על ידי שטיפת השקופיות בתמיסת דיאמינובנזידין (DAB) ולאחר מכן דגירה עליהן בתמיסת DAB למשך 10 דקות ב-AT.</li>
		<li>יש לשטוף במשך 3 פעמים (30 שניות) במים נטולי יונים.</li>
		<li>מכתימים את החלקים עם המטוקסילין של מאייר.</li>
		<li>יש לשטוף במים נטולי יונים, למשך 1x (30 שניות), בתמיסת שטיפה למשך 1x (30 שניות) ובמים נטולי יונים, למשך 1x (30 שניות).</li>
		<li>השתמש במכתים אוטומטי לחלוטין כדי לייבש את החלקים באתנול 70% (2 דקות), אתנול 80% (2 דקות), אתנול 96%-1 (3 דקות), אתנול 96%-2 (3 דקות), אתנול 100% (3 דקות), קסילן-1 (4 דקות), קסילן-2 (4 דקות) וקסילן-3 (4 דקות).</li>
		<li>השתמש בנעלי כיסוי זכוכית אוטומטיות לחלוטין כדי להרכיב את החלקים בשקופיות למדיום הרכבה. הערה: דגימות בקרת רקמות שליליות וחיוביות (שקדים) שימשו לאורך כל הדרך.</li>
	</ol></li>
</ol>4. קבלת סריקות שקופיות שלמות
<ol><li>סרוק את השקופיות המוכתמות באמצעות המטרה פי 20 והצפיפות הבינונית-גבוהה של התמקדות בסורק שקופיות שלם.</li>
</ol>5. ניתוח IHC באמצעות התוכנה
<ol><li>צור פרויקט עבור תמונות IHC בתוכנה.<ol><li>הורד ופתח את QuPath-0.4.3 (ומעלה).exe</li>
		<li>צור תיקיה חדשה עם שם מתאים.</li>
		<li>לחץ על הלחצן צור פרויקט בפינה השמאלית העליונה של התוכנה ובחר את התיקיה החדשה שנוצרה.</li>
		<li>גרור תמונות סרוקות לחלון התוכנה. כאשר חלון חדש מופיע באופן אוטומטי, בחר Set Image Type >- H-DAB ולחץ על Import (Figure 2).</li>
		<li>שימו לב לרשימת התמונות בחלון השמאלי של התפריט; לחץ פעמיים כדי לפתוח את התמונה.</li>
		<li>בחר מהתפריט הראשי בחלק העליון קובץ כדי לשמור את התמונות כפרויקט. הערה: התוכנה יכולה להתמודד עם מגוון רחב של פורמטים של תמונות, כולל פורמטים רבים של שקופיות שלמות. עם זאת, תבנית tiff עדיפה כדי למנוע אובדן של נתונים גולמיים ומטה-נתונים המשויכים אליהם.</li>
	</ol></li>
	<li>ביאור אזורי עניין<ol><li>בחרו בכלי מברשת או בכלי שרביט מהתפריט הראשי בחלק העליון כדי להוסיף ביאורים לאזור הגידול. עבור אזורים לא רציפים של הגידול, בצע את השלבים 5.2.1.1-5.2.1.3.<ol><li>הוסף להם ביאורים בנפרד.</li>
			<li>לחץ לחיצה ממושכת על מקש Ctrl תוך בחירת כל אזורי הגידול</li>
			<li>לחץ לחיצה ימנית ובחר ערוך > מרובים מזג נבחר.</li>
		</ol></li>
		<li>ודא כי ביאור הגידול נבחר (גבולות יש צבע צהוב).</li>
		<li>לחץ על אוטומציה בתפריט הראשי ובחר הצג עורך סקריפטים.</li>
		<li>העתק/י את הסקריפט הזמין בקובץ משלים 1 או ב-https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls והדבק/י אותו בעורך הסקריפטים ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״. החזר ההשקעה: מרכז הגידול (TC), השוליים הפנימיים (IM), השוליים החיצוניים (OM) והאזור ההיקפי (PT) ייווצרו ויסומנו באופן אוטומטי.</li>
		<li>לקבלת דרך חלופית ליצירת אזורי עניין, בצע את השלבים 5.2.5.1-5.2.5.5.<ol><li>בחרו בכלי Polyline מהתפריט הראשי בחלק העליון כדי לשרטט גבול המפריד בין קיני התאים הממאירים לבין רקמות סמוכות שאינן סרטניות.</li>
			<li>בחר את הגבול שנוצר. בחר מהתפריט הראשי בחלק העליון אובייקטים > ביאור > הרחב ביאורים >- 500 מיקרומטר עבור רדיוס הרחבה > שטוח עבור כיפות קו. הפעילו את 'הסר פנים' והפעילו את 'אילוץ להורה'.</li>
			<li>לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הביאור המתקבל, ערוך פיצול > יחיד. שני ביאורים נפרדים יורחבו אוטומטית כאזורים ברוחב 500 מיקרומטר בכל צד של הגבול.</li>
			<li>תן שם מתאים לאזורים עם ביאורים עבור הודעות מיידיות ו- OM על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הביאור ברשימה מימין, בחירה באפשרות קבע מאפיינים והזנת השם.</li>
			<li>ה- TC מייצג את אזור הגידול הנותר. הרחב את שטח ה- PT ברוחב 500 מיקרומטר הסמוך ל- OM באמצעות אותו הליך. הערה: שקופיות מבוארות וזיהוי מיקוד אוטומטי QuPath נבדקו על-ידי היסטופתולוג מומחה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>אופטימיזציה של סיווג פיקסלים<ol><li>בחרו בכלי מלבן מהתפריט הראשי. לאחר מכן הוסף ביאורים לאזור, המכיל את כל סוגי הפיקסלים שיש להבחין ביניהם (לדוגמה, המטוקסילין, DAB ורקע).</li>
		<li>בתפריט הראשי, בחר נתח > עיבוד מראש > הערכת וקטור כתמים.</li>
		<li>כאשר חלון Visual Stain Editor מופיע באופן אוטומטי, בחר Auto > OK, והגדר H- DAB מוערך כשם עבור וקטור הכתם.</li>
		<li>לקבלת שיטה חלופית, בצע את השלבים 5.3.4.1-5.3.4.3.<ol><li>בחרו בכלי מלבן מהתפריט הראשי והוסיפו הערות לאזור קטן של גרעין טיפוסי המוכתם בהמטוקסילין.</li>
			<li>בחר תמונה מהתפריט השמאלי ולחץ פעמיים על Stain 1 > כן.</li>
			<li>בחרו בכלי מלבן מהתפריט הראשי והוסיפו הערות לאזור קטן של צביעה חיובית באמצעות DAB. בחר תמונה מהתפריט השמאלי ולחץ פעמיים על Stain 2 > כן.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>הערכה של חלק שטח של תאי חיסון חיוביים באמצעות האפשרות סיווג פיקסלים .<ol><li>בתפריט הראשי, לחץ על סיווג > פיקסלים > צור סף.</li>
		<li>בחר גבוה עבור הרזולוציה > ערוץ: DAB > קדם-סינון: גאוסיאן > סיגמא: 0.5 > (איור 3) סף: (0.2-0.3) > מעל הסף: חיובי > מתחת לסף: שלילי.</li>
		<li>עבור האזור, בחר כל הערה, הקלד שם עבור מסווג > שמור > מידה > אישור. התאים החיוביים ל-DAB ישתנו לצבע אדום (איור 4).</li>
		<li>העתק את התוצאות מהתפריט השמאלי לגיליון אלקטרוני.</li>
		<li>לחלופין, פתחו את 'מדידה ' בתפריט הראשי העליון, בחרו 'הצג מדידות ביאור >'העתק ללוח' והדביקו תוצאות בגיליון אלקטרוני.</li>
		<li>כדי לסגור את התמונה, לחץ לחיצה ימנית > Multi View > Close Viewer. הערה: לפני הכימות, כל הממצאים בוטלו. הסף הותאם לכל מקרה עם כתם חיובי ספציפי חלש. נכונות הביאורים וסיווג הפיקסלים הוצלבה תחילה ולאחר מכן נבדקה על ידי היסטופתולוג בכיר. כל הניתוחים נעשו בצורה עיוורת. מידע נוסף על ניתוח IHC באמצעות התוכנה ניתן למצוא בכתובת https://forum.image.sc/tag/QP.</li>
	</ol></li>
</ol>6. שיטות סטטיסטיות וניתוח נתונים
<ol><li>נקודות הסיום של המחקר היו זמן להישנות (TTR), הישרדות ללא מחלות (DFS) והישרדות כוללת (OS). חולים ללא הישנות או מוות צונזרו במעקב האחרון שלהם. הערה: נתונים רציפים שאינם מבוזרים באופן נורמלי מבוטאים כחציון (min-max). הפרופורציות מבוטאות כנתונים גולמיים (אחוזים). שברי שטח של תאי חיסון באזורים שונים של עניין (ROIs) הושוו על ידי פרידמן ANOVA, ואחריו וילקוקסון התאמת זוגות מבחן עם תיקון Bonferroni. בגלל ההתפלגות הלא פרמטרית של רוב המשתנים, מתאם ספירמן שימש להערכת הקשרים בין זוגות של משתנים סודרים או כמותיים. כדי לקבוע את הערך הפרוגנוסטי של מנבאים בודדים עבור נקודות קצה, בוצע ניתוח רגרסיה חד-משתני ואחריו ניתוח רגרסיה רב-משתנים של קוקס. חושבו יחסי סיכון (HR). HR הראה את הסיכון היחסי עבור קבוצת הביניים הגבוהה המשולבת בהשוואה ל -1 עבור הקבוצה הנמוכה. כל אומדני ההישרדות חושבו בשיטת קפלן-מאייר והושוו בין קבוצות במבחן דירוג לוג. GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) שימש לניתוחים סטטיסטיים. ערך p דו-צדדי < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

Prognostic Significance of Immune Cell Infiltration in Hepatocellular Carcinoma

אין ניגודי עניינים כספיים לחשוף.

באמצעות ניטור ארגון החיסון באתרו ב- TME, תחום האימונו-אונקולוגיה יכול להוסיף סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים לסרטן. המאמר שלנו שפורסם בעבר על תפקידם של תאי מערכת החיסון הנרכשת ב- TME של HCC הראה קשרים פרוגנוסטיים חיוביים של תאי T CD3+ ו- CD8+ וכן תאי CD20+ B ב- ROI נבחרים עד לזמן להישנות2. כאן, תוכנת ניתוח התמונה QuPath שימשה להערכת השפע של CD1a+ iDCs, תאי פיטום CD117+ ותאי NK NKp46+ במספר אזורים שונים של HCC והעריכה את המשמעות הפרוגנוסטית שלהם. בשל הצורות הלא סדירות של חלק מתאי מערכת החיסון המולדת, הכימות שלהם יכול להיות לא מדויק. זו הסיבה שהערכת חלק השטח של תאים חיוביים למערכת החיסון הייתה האפשרות האופטימלית. מבין שלושת סוגי התאים, רק תאי פיטום CD117+ הדגימו השפעה פרוגנוסטית משמעותית: מיקוד אוטומטי גבוה יותר של תאי פיטום באזור ה-IM ואזור ה-PT היה קשור להישרדות ארוכה יותר.
תאי פיטום היו הנפוצים ביותר בכל ה-ROIs, והקשר של המיקוד האוטומטי שלהם באזור הפריטומור והשוליים הפנימיים עם הישרדות טובה יותר משקף את התפקיד האנטי-סרטני של תאי פיטום. תאי פיטום יכולים להימשך לתוך TME על ידי כימותרפיה משוחררת תאי גידול, כגון SCF או CCL1518. תאי פיטום יכולים להשפיע על תגובה אנטי-סרטנית על ידי ציטוטוקסיות ישירה לתאי הגידול27 או על ידי הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים שיכולים לעכב את צמיחת הגידול18. צפיפות תאי פיטום מוגברת הגנה מפני הישנות סרטן הערמונית28, סרטן קיבה27 ו- HCC לאחר השתלת כבד29. מחקר מקיף שכלל עוקבה גדולה יותר של 245 חולי HCC מצא מתאם חיובי בין חדירת תאי פיטום משמעותית יותר בדגימות גידול לבין הישרדות ממושכת יותר לאחר כריתת גידול30. Rohr-Udilova et al. דיווחו על תוצאות דומות של צפיפות גדולה יותר של תאי פיטום ברקמת HCC שמסביב; עם זאת, רק צפיפות תאי פיטום תוך סרטניים הייתה קשורה לשיעור הישנות נמוך יותר29.
במחקר זה, תאי פיטום הפעילו השפעה אנטי-סרטנית בכבד IM ו-PT בלבד. ה-TME של גידולים שונים הוא הטרוגני לגבי ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון31. המשמעות הפרוגנוסטית של תאי מערכת החיסון ב-TME קשורה באופן קריטי גם להתפלגותם המרחבית 32,33. הוצעו גישות שונות לביאור השוליים החודרניים של הגידול, כולל שוליים שלמים ברוחב שונה 4,34,35, שוליים פנימיים וחיצוניים, שוב ברוחב שונה36,37, עם או בלי PT 2,7. עקבנו אחר המתודולוגיה המתוקננת והניתנת לשחזור של קבוצת העבודה הבינלאומית לאימונואונקולוגיה כדי להגדיר את השוליים הפולשניים כאזור של 1 מ"מ שבמרכזו הגבול המפריד בין קיני התאים הממאירים לבין הרקמה המארחת ומייצג את הגידול המרכזי כאזור הגידול הנותר38. מאז המחקר הקודם הדגיש הבדלים משמעותיים בתוצאות של שוליים פולשניים פנימיים וחיצוניים2, אזורים אלה (כל 500 מיקרומטר רוחב) נותחו בנפרד. לפרופיל החיסוני המרחבי של אזור הפריטומור יש חשיבות ניבוי מובהקת39,40, ולכן נכלל גם אזור ה-PT.
ניתוח של TC, שולי הגידול וכבד PT בוצע ב- WSIs בניגוד לאפשרות להעריך שדות ראייה נבחרים באזורים המתאימים. הדמיית שקופית שלמה היא מקור פוטנציאלי עשיר של נתונים41. מכיוון שלא ביצענו תת-דגימה, "הערך האמיתי הצפוי" התקבל באופן יעיל בזמן10. בנוסף, מערכת זו הייתה סבירה מכיוון שנותחו רק 1 או 2 שקופיות לכל בלוק, מה שאפשר לנו להימנע מההטיה של בחירת טלאים42. זרימת העבודה האיטית אתגרה אותנו במחקר הקודם כאשר יושמה הסטרולוגיה לכימות תאי מערכת החיסון2.
IHC מאפשר לוקליזציה ישירה של ביטוי תאי פיטום CD1a+ iDCs, NKp46+NK ו-CD117+ ברקמת הכבד, כימות ההתפלגויות שלהם, ולכן תת-סיווג של הקוהורט. ניתוח IHC מעניק למחקר זה יתרונות חשובים על פני בדיקות ביוכימיות ברקמה מסיסה, אשר עלולות להוביל לתוצאות שליליות כוזבות כאשר רק תאים חיוביים ביולוגיים מעטים נמצאים43 ואינם משקפים את התגובה האזורית של תאי מערכת החיסון למאפיינים היסטופתולוגיים44. IHC עדיף גם על ניתוח בסעיפים מוכתמים ב-H&E. מחקרים על סרטן המעי הגס וסרטן הריאה של תאים קטנים הראו כי הערכה של חלקים מוכתמים ב- H&E יכולה לספק סמנים ביולוגיים חזקים וכמותיים של גידולים חיסוניים 45,46,47; עם זאת, עדיין קיימות מגבלות שישקפו את נוכחותם בפועל של תת-סוגים ספציפיים.
איכות גבוהה של קטעי רקמות וצביעת IHC היא תנאי מוקדם להערכה מדויקת. רקע גבוה, ממצאים בקצה וצביעה ספציפית אך לא רצויה (למשל, צביעה של תאי אנדותל של חללים סינוסואידים בכבד עם נוגדנים נגד CD4) עלולים להשחית את כל התוצאות. נוגדן CD56 היה הבחירה הראשונה במחקר הנוכחי לזיהוי תאי הרג טבעיים, אך הוחלף בנוגדן NKp46 עקב ביטוי CD56 בצינורות מרה לא בוגרים. בחירת הסמן המתאים ביותר מבחינת ספציפיות, דפוס צביעה חזק ויציבות בגושי FFPE מייצגת נושא נוסף שיש לקחת בחשבון. לדוגמה, CD117 נבחר במקום טריפטאז מכיוון שביטוי טריפטאז עשוי להיות מווסת מאוד, חוץ מזה, תאים שאינם מבטאים CD117 אינם תאי פיטום48.
QuPath נותן את האפשרות להחליק את גבולות החזר ההשקעה מבחוץ ולהסיר כל חפץ, כלי דם גדולים, רקמה נמקית, צביעה לא ספציפית, רקע וצבירה של אריתרוציטים שלא אמורים להיות חלק מההחזר על ההשקעה. המפעיל צריך לבחור את החזר ההשקעה וללחוץ על מקש "Alt" תוך ביאור ממצאים אלה. צביעה לא ספציפית בוטלה במחקר זה כממצאים לפני הכימות כך שלא השפיעה על התוצאות. במקרה של צביעה ספציפית נמוכה באופן שיטתי או רקע גבוה, יש לבדוק את הפרוטוקול כדי למנוע הטיה אפשרית. הסף הותאם לכל מקרה עם כתם חיובי ספציפי חלש. לפני כל שימוש שגרתי, יש לייעל את הפרוטוקול. כל הניתוחים צריכים להיעשות בצורה עיוורת ובאופן אידיאלי, דיוק הסף ראוי להצלבה.
QuPath הוא פתרון קוד פתוח ידידותי למשתמש, אינטואיטיבי, ניתן להרחבה, עבור פתולוגיה דיגיטלית וניתוח תמונות שקופיות שלמות9, נבדק בעבר עבור ניתוח תמונה ב- HCC49 וסוגי סרטן שונים50,51. התפעול הקל של התוכנה עבור WSIs והאפשרויות לביאור אזורי עניין (למשל, אזורים גידוליים או פריטומורליים) הם היתרונות העיקריים.
יישום של סקריפטים קיימים, ששונו או שנוצרו דה נובו עשוי להאיץ באופן משמעותי את הניתוח. הוחל סקריפט ליצירת ביאורים עבור ROIs, מה שאפשר פילוח אזורי מהיר ומדויק במקום תיחום ידני. הסקריפט אינו קבוע, וניתן להתאים אותו בקלות לשוליים של פחות מ- 500 מיקרומטר עבור אזורים עם גבולות רקמה לא מספיקים. ניתן להתאים אישית את רוחב האזור IM, OM או PT באמצעות עורך הסקריפט Automate > Show > התאמת השורה 30 מיקרון מרווח הרחבה כפול = 500 מיקרון לרוחב הזמין > הפעלה. ניתן גם להוסיף או להסיר החזר השקעה. באופן כללי, זרימות העבודה בתוכנה אינן קבועות, והמפעיל חופשי לפתח ולשנות אותן.
שפע של כלי תוכנה זמינים לניתוח תמונות פתולוגיות, כולל CellProfiler, ImageJ, פיג'י, Microscopy Image Browser, ואחרים, זמינים כעת. עם זאת, QuPath מבדילה את עצמה באמצעות שורה של יתרונות כגון ארכיטקטורת קוד פתוח, ממשק ידידותי למשתמש, יכולות התאמה אישית של אלגוריתמים ושילוב של כלי למידת מכונה מתקדמים. תכונות אלה יחד מציבות תוכנת ניתוח תמונה זו כבחירה חזקה לניתוח ניואנסים של רקמות סרטניות בתחום הפתולוגיה הדיגיטלית.
QuPath הראתה את השונות הנמוכה ביותר בהשוואה לתוכנות מסחריות HALO (IndicaLab) ו-QuantCenter (3DHistech) לזיהוי ביטוי Ki67 בסרטן השד52. התוכנה גם בעלת פוטנציאל לקבל הוראה להריץ סקריפט עבור כל תמונות הפרויקט באופן עיבוד אצווה הניתן לשחזור.
QuPath אפשרה לנו ליצור נתונים רציפים כמותיים במקום נתונים סדירים (כמותיים למחצה). נתונים סודרים המתקבלים על ידי ניקוד חזותי טומנים בחובם בעיות הנובעות מסובייקטיביות בפרשנות, שונות בין צופים ויכולת שחזור ירודה53. מהירות הניתוח הנוכחי שופרה על ידי העובדה שאנשים ללא רקע היסטופתולוגי נרחב ומומחיות תכנות יכולים לבצע ניתוח אוטומטי, בתנאי שדיוק הביאורים נבדק על ידי פתולוג. מחקר על גידולי ראש וצוואר הדגים את התאמתו של QuPath להערכה מהירה וניתנת לשחזור של הערך הפרוגנוסטי של לימפוציטים חודרי גידול CD57+50. המחקר הראה גם קונקורדנציה משמעותית בין משקיפים אנושיים לבין QuPath. התאמה גבוהה בין תצפית ידנית להערכה באמצעות QuPath הוצגה גם בסרטן הפה54 ובסרטן השד55. המאמר הנ"ל השווה את כימות IHC של 5 סמנים ביולוגיים קליניים של סרטן השד באמצעות QuPath ו -2 מוצרי תוכנה מסחריים (Definiens Tissue Studio ו- inForm) עם ניקוד ידני על ידי פתולוג. לאורך מחקר זה, QuPath הציגה באופן עקבי את הביצועים הטובים ביותר, כמו גם את הזמן הנמוך ביותר להתקנה ויישום, ובכך הראתה כחלופה עתידית מצוינת לניטור חזותי ותוכנה מסחרית. אפילו בהשוואה ל-ImageJ, תוכנת הקוד הפתוח הידועה ביותר לניתוח תמונות ביו-רפואיות, QuPath מצטיינת בהתמודדות עם WSIs56 גדולים.
קיים פורום מקוון פתוח עבור QuPath שבו משתמשים מפרסמים את שאלותיהם על שיטות פתולוגיה דיגיטלית ומציגים קהילה פעילה ומעורבת לתמיכה בפיתוח כלים לניתוח תמונות (https://forum.image.sc/tag/qupath).
הקבוצה ששימשה במחקר זה הייתה ייחודית ולא ייצגה את האוכלוסייה הכללית עם HCC מכיוון שהיא הקיפה רק חולים שהיו זכאים לכריתת כבד. באופן כללי, מיעוט מהחולים עם HCC (20%-30%) זכאים לכריתת כבד57. זו יכולה להיות גם סיבה לכך שפחות חולים אישרו שחמת הכבד מכיוון שחולים עם אטיולוגיה זו של HCC כנראה היו בעלי ציוני Child-Pugh גבוהים יותר ולא נחשבו לכריתה. הקבוצה הייתה גם קטנה למדי, ולרוב החולים היו שלבים מוקדמים של TNM של המחלה. לכן, אקסטרפולציה של התוצאות לאוכלוסיות אחרות צריכה להיעשות בזהירות.
במחקר הנוכחי, השפע של תאי מערכת החיסון המולדת במיקרו-סביבה HCC הוערך באמצעות הערכה של המיקוד האוטומטי שלהם, שכן ספירה מדויקת של תאי חיסון בעלי צורה לא סדירה כמו תאים דנדריטיים יכולה להיות קשה. מצד שני, חלק השטח של תאי החיסון בדרך כלל מתואם מאוד עם צפיפותם58. תיוג אימונופרוקסידאז מספק נתונים עבור לוקליזציה של האנטיגן, חלק השטח או צפיפות התאים המבטאים אותו, אך עוצמת הצביעה אינה קשורה ליניארית לכמות האנטיגן. לכן, אין להשתמש ב-IHC כדי להעריך כמותית את רמת הביטוי של חלבון מסוים. דיוק השיטה תלוי גם באחידות עובי המקטע, איכות התמונה והרזולוציה שנבחרה לסיווג פיקסלים. כל תוצאה של ניתוח תמונה צריכה להיות מאומתת ומטופלת בזהירות. מאחר שסמן יחיד אינו יכול ללכוד באופן מלא את המורכבות של תאי מערכת החיסון, נדרשים סמני IHC נוספים וצביעת מולטיפלקס כדי לקבל תמונה אמינה של TME החיסון של HCC. שימוש בסמן IHC יחיד בלבד לפנוטיפ תאי מערכת החיסון מהווה קירוב, ויש לפרש את התוצאות בזהירות.
השימוש בתוכנת ניתוח התמונות QuPath להערכת שקופיות מוכתמות ב-IHC אפשר לנו להעריך את הפיזור ואת חלק השטח של iDCs מקומיים, תאי פיטום ו-NKs בגידולים ובגידולים היקפיים של חולי HCC ולאחר מכן לנתח את הקשרים שלהם עם פרוגנוזה. השפע של תאי פיטום בשוליים הפנימיים ובכבד ההיקפי של HCC קשור ל-DFS ומערכת הפעלה ארוכים יותר, מה שמדגיש את ההשפעות האנטי-סרטניות של תאי מערכת החיסון המולדת האלה. תהליך העבודה האנליטי של QuPath ידידותי למשתמש, מהיר וקל לשימוש, עם הגדרות ברירת מחדל מועילות וייצוא נתונים קל. תוכנה זו אושרה כפלטפורמה מבטיחה לניתוח תמונות דיגיטליות, שיכולה לענות על הצורך בשחזור, עקביות ודיוק בפתולוגיה דיגיטלית.

הארגון המרחבי והשפע של תאי חיסון חודרי גידול הוכחו כמשפיעים על הישרדות בסוגי סרטן שונים, קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) כללה 1,2,3,4. המשמעות הפרוגנוסטית של לימפוציטים חודרי גידול בסרטן הודגמה לראשונה על המטוקסילין ואאוזין (H&E) מוכתמיםבסעיפים 5,6. לאחר מכן, מחקר חלוצי שנערך על ידי Galon et al. באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) הדגים קשרים של צפיפות של תאי CD3+ ו- CD8+ T ברקמת סרטן המעי הגס עם פרוגנוזה4.
IHC הוא תקן זהב להדמיה, כימות ומיפוי של תאי מערכת החיסון בתוך רקמת הגידול לצורך קשר נוסף עם תוצאות קליניות7. IHC מציג מספר יתרונות, כגון עלות נמוכה, זמינות נרחבת ותאימות לרקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין (FFPE)8. עם זאת, הערכה מדויקת של תאי מערכת החיסון המוכתמים ב-IHC היא אתגר גדול. ניקוד מסורתי בשדות ראייה מיקרוסקופיים נבחרים גוזל זמן ואינו מספיק עוד כדי להבטיח ניתוח איכותי, ניתן לשחזור ואובייקטיבי החיוני לבחירת סמנים ביולוגיים מועמדים ומתאם קליני אמין9. ניתן להעריך סריקות של שקופיות שלמות כתמונה שלמה או לאחר תת-דגימה10.
הערכה כמותית ממוחשבת של שפע תאי החיסון בדגימות רקמה יכולה להבטיח נתונים מעשיים, מדויקים, אמינים ורלוונטיים קלינית11. QuPath היא תוכנת קוד פתוח חינמית המאפשרת ניתוח תמונה דיגיטלית של שקופיות מוכתמות ב-IHC וממקסמת את כמות המידע המתקבלת מדגימות בודדות12.
מאחר שתאים דנדריטיים לא בשלים (iDCs), תאי הרג טבעי (NK) ותאי פיטום מעורבים בתגובות חיסוניות נגד גידולים והוכחו בקורלציה עם תוצאותהחולים 13,14,15, אנו מציגים כאן פרוטוקול שלב אחר שלב להערכת הפיזור המרחבי שלהם ברקמת FFPE HCC וחקירת ההשפעה הפרוגנוסטית שלהם. CD1a מתבטא בעיקר בקרום של תאים דנדריטיים לא בוגרים, שצפיפותם נקשרה לתוצאות קליניות במגוון גידולים אנושיים16,17. תאי פיטום יכולים למלא תפקיד של פרוטומור או נגד גידולים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME)18. הם יכולים לתמוך באנגיוגנזה ולהקל על גרורות19. לעומת זאת, דווח כי תאי פיטום יכולים לתווך אפופטוזיס של תאי הגידול באמצעות ייצור IL-420. צביעה נגד CD117 משמשת בדרך כלל כדי לדמיין ולכמת תאי פיטום בתוך רקמת הגידול21. תאי NK נחשבים כתורמים למעקב ובקרה של HCC22 על ידי הריגת תאים סרטניים23. ביטוי NKp46 על ידי NK הוא פרמטר מכריע לפעילות האנטי-סרטנית שלהם24. עם זאת, תאי NKp46+ NK היו בקורלציה חיובית עם קוטר הגידול בחולי HCC25. למרות זאת, מעט ידוע על הקשר שלהם עם הישרדות החולה.
מטרתנו הייתה להעריך כמותית את השפע של CD1a+ iDCs, תאי פיטום CD117+ ותאי NK מסוג NKp46+ באזורים שונים של HCC ולהדגיש את המשמעות הפרוגנוסטית שלהם. במחקר הרטרוספקטיבי הנוכחי נכללו במחקר הרטרוספקטיבי הנוכחי 70 חולים רצופים עם אישור פתולוגי של HCC בשלב I-IV, שהיו זכאים לכריתה על פי הנחיות BCLC ועברו כריתת כבד עם כוונת ריפוי בבית החולים האוניברסיטאי פילזן בין השנים 1997 ל-2019. נבדקו דוחות פתולוגיים של החולים. לאף אחד מהחולים שנכללו במחקר זה לא היו גרורות מרוחקות ולא קיבלו טיפול ניאו-אדג'ובנטי כגון כימותרפיה או הקרנות לפני הניתוח. במחקר לא נכללו 3 מטופלים עם דגימות היסטולוגיות באיכות ירודה, ו-67 החולים הנותרים נכללו במחקר (טבלה 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD1a</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PA0235</td>
			<td>Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD117</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>&#160;PA0007</td>
			<td>Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Plus Microscope Slides</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>S21.2113.A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND RXm</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>49.1501</td>
			<td>Fully Automated IHC Stainer&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe Cleaning Kit</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CS9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond&#160;Dewax&#160;Solution</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond&#160;Polymer Refine Detection Kit</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DS9800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Epitope Retrieval 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Primary Antibody Diluent</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BondTM Wash Solution 10X Concentrate</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz&#160;&#160; 3.10 GHz Installed RAM: 128 G</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>14071135636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV Mount</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>14046430011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>149CVTS5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven UN30</td>
			<td>Memmert GmbH&#160;</td>
			<td>UN30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9.0</td>
			<td>GraphPad Software LLC&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Version 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc., United States</td>
			<td>MAB1850</td>
			<td>Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HI1210 - Water Bath</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14041521466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Agilent Dako, United States</td>
			<td>X0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2 or higher versions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;version (QuPath v.0.3.2)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RM2235 Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>149AUTO00C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ST5020 Multistainer Slide Stainer</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DEV-ST5010-CV5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistica</td>
			<td>StatSoft Inc.</td>
			<td></td>
			<td>version 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scan.Z1</td>
			<td>ScienceServices GmbH, Germany</td>
			<td>430038-9000-000&#160;</td>
			<td>Slide scanner&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mast cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma confer favorable prognosis: a retrospective study using qupath image analysis software

התובנות המסופקות על ידי זיהוי ממוקד של תאים חיסוניים בתוך קרצינומה hepatocellular (HCC) עשויים להציג מידע על תוצאות החולים. מחקרים הבוחנים ביטוי ולוקליזציה של תאי מערכת החיסון בתוך רקמות הגידול קשורים למספר אתגרים, כולל היעדר ביאור מדויק לאזורי הגידול ובחירה אקראית של שדות ראייה מיקרוסקופיים. QuPath היא תוכנת קוד פתוח, ידידותית למשתמש שיכולה לענות על הצורך הגובר בפתולוגיה דיגיטלית בניתוח תמונה של שקופיות שלמות (WSI).
החדירה של HCC ורקמות סמוכות על ידי תאים דנדריטיים לא בוגרים CD1a + (iDCs), תאי פיטום CD117+ ותאי הרג טבעיים NKp46+ (NKs) הוערכה באופן אימונוהיסטוכימי בדגימות מייצגות של 67 חולים עם HCC שעברו כריתה מרפאת. מקטע השטח (AF) של תאים מוכתמים באופן חיובי הוערך באופן אוטומטי ב- WSI באמצעות QuPath במרכז הגידול (TC), השוליים הפנימיים (IM), השוליים החיצוניים (OM) והפריטומור (PT). המשמעות הפרוגנוסטית של תאי מערכת החיסון הוערכה עבור זמן להישנות (TTR), הישרדות ללא מחלות (DFS) והישרדות כוללת (OS).
המיקוד האוטומטי של תאי פיטום היה גדול משמעותית מהמיקוד האוטומטי של תאי NK, והמיקוד האוטומטי של iDCs היה נמוך משמעותית בהשוואה ל-NKs בכל אחד מאזורי העניין. AFs גבוהים של תאי פיטום באזורי IM ו- PT היו קשורים ל- DFS ארוך יותר. בנוסף, מיקוד אוטומטי גבוה של תאי פיטום בהודעות מיידיות היה קשור למערכת הפעלה ארוכה יותר.
ניתוח בעזרת מחשב באמצעות תוכנה זו הוא כלי מתאים לקבלת מידע פרוגנוסטי עבור תאי חיסון חודרי גידול (iDCs, תאי פיטום ו- NKs) באזורים שונים של HCC לאחר כריתה. תאי פיטום הציגו את המיקוד האוטומטי הגדול ביותר בכל אזורי העניין (ROI). תאי פיטום באזור הפריטומור ו- IM הראו משמעות פרוגנוסטית חיובית.

The spatial organization and abundance of tumor-infiltrating immune cells have been proven to impact survival in different cancers, hepatocellular carcinoma (HCC) included1,2,3,4. The prognostic significance of tumor-infiltrating lymphocytes in cancers was first shown on hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections5,6. Then, a pioneer study by Galon et al. using immunohistochemistry (IHC) demonstrated associations of the densities of CD3+ and CD8+ T cells in colon cancer tissue with prognosis4.
IHC is a gold standard for visualizing, quantifying, and mapping immune cells within tumor tissue for further association with clinical outcomes7. IHC presents several advantages, such as low cost, widespread availability, and compatibility with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue8. However, accurate assessment of IHC-stained immune cells is a big challenge. Traditional scoring in selected microscopic fields of view is time-consuming and no longer sufficient to ensure the high-quality, reproducible, objective analysis essential for candidate biomarker selection and reliable clinical correlation9. Whole-slide scans can be assessed as a whole image or after subsampling10.
Computerized quantitative assessment of the abundance of immune cells in tissue samples can ensure practical, accurate, reliable, and clinically relevant data11. QuPath is a free, open-source software that enables the digital image analysis of IHC-stained slides and maximizes the amount of information yielded from individual samples12.
Since immature dendritic cells (iDCs), natural killer (NK) cells, and mast cells are involved in anti-tumor immune responses and were shown to correlate with patients&#39; outcomes13,14,15, we here present a step-by-step protocol for assessing their spatial distribution in FFPE HCC tissue and exploring their prognostic impact. CD1a is expressed mainly on the membrane of immature dendritic cells, the density of which has been associated with clinical outcomes in a variety of human tumors16,17. Mast cells can play a protumor or anti-tumor role within the tumor microenvironment (TME)18. They can support angiogenesis and facilitate metastasis19. Conversely, it has been reported that mast cells can mediate tumor cell apoptosis through the production of IL-420. Anti-CD117 staining is commonly used to visualize and quantify mast cells within the tumor tissue21. NK cells are thought to contribute to the surveillance and control of HCC22 by killing cancer cells23. NKp46 expression by NK is a crucial parameter for their anti-tumor activity24. However, NKp46+ NK cells correlated positively with tumor diameter in HCC patients25. Despite this, little is known about their correlation with patient survival.
We aimed to quantitatively assess the abundance of CD1a+ iDCs, CD117+ mast cells, and NKp46+ NK cells in different regions of HCC and highlight their prognostic significance. A total of 70 consecutive patients with pathologically confirmed stage I-IV HCC, who were eligible for resection according to BCLC guidelines and underwent curative-intent liver resection at Pilsen University Hospital between 1997 and 2019, were included in the current retrospective study. Pathology reports of the patients were reviewed. None of the patients included in this study had distant metastases nor had received neoadjuvant therapy such as chemotherapy or radiotherapy before surgery. A total of 3 patients with poor-quality histological specimens were excluded, and the remaining 67 patients were included in the study (Table 1).

Author Spotlight: Investigating Immune Cell Dynamics in the Tumor Microenvironment &amp;#8212; Challenges and Innovations in Cancer Prognosis

תאי פיטום במיקרו-סביבה של קרצינומה הפטוצלולרית מעניקים פרוגנוזה חיובית: מחקר רטרוספקטיבי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה QuPath 

הנתונים הדמוגרפיים והמאפיינים הקליניים של החולים מוצגים בלוח 1. הגיל החציוני של החולים היה 69 שנים, ורובם היו גברים (77.6%). לגבי האטיולוגיה של HCC, דלקת כבד כרונית לא נגיפית הייתה מחלת הרקע השכיחה ביותר, עם שכיחות של סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) (23.9%). רק 15 חולים (22.4%) חלו בשחמת הכבד כמחלת רקע. לרוב החולים (68.7%) היה TNM שלב I. ממצאים קליניים ופתולוגיים מפורטים יותר תוארו בעבודתנו הקודמת 2,26.
תוצאות במעקב האחרון נצפתה הישנות הגידול ב-29 (41.8%) חולים, מתוכם 89.7% עם הישנות מקומית ו-38 (56.7%) חולים נפטרו. ב-5 שנים לאחר הניתוח, שיעור ה-DFS היה 33.2%, שיעור ה-OS היה 49.4%, והשיעור ללא הישנות (RFP) היה 48.7% (טבלה 2).
התפלגות תאי החיסון באזורי עניין שונים חלבון CD117 נמצא בעיקר בקרום הציטופלזמי של תאים מעוגלים (איור 5A). ב- TC וב- IM, הם היו ממוקמים בעיקר בסטרומה ובחלל הפריווסקולרי. באזורי OM ו- PT, תאי CD117+ נצפו בכמוסת הגידול ובחלל הפריווסקולרי.
חלבון NKp46 נמצא בעיקר בקרום הציטופלזמי של תאים מעוגלים, שהיו נוכחים בתוך חללים דמויי סינוסואידים ב-TC וב-IM, כמו גם קשורים לסטרומה (איור 5B). באזור OM ו-PT נצפו תאי +NKp46 בקפסולות סביב קיני גידולים ובסטרומה של דרכי הפורטל.
חלבון CD1a נמצא ב-TC וב-IM, בעיקר בקרום הציטופלזמי של תאים מעוגלים (מפוזרים או באגרגטים) בסטרומה, בתוך ולאורך הגבולות של חללים דמויי סינוסואידים (איור 5C). באזור PT, CD1a+ DC נצפה בתוך ולאורך גבולות הסינוסואידים ובתוך אפיתל המרה בדרכי הפורטל.
המיקוד האוטומטי של תאי פיטום היה גדול משמעותית מהמיקוד האוטומטי של תאי NKp46+ (p < 0.001) (איור 6). CD1a+ iDCs בכל החזר השקעה הראו את המיקוד האוטומטי הנמוך ביותר בהשוואה לתאי פיטום ותאי NK (p < 0.001) (איור 6). המיקוד האוטומטי של תאי CD117+ ו-NKp46+ ב-TC או IM היה קטן משמעותית מאלה שבאזור ה-PT וה-OM (p <-0.001) (איור 6). עבור תאי CD1a+ , המיקוד האוטומטי לא היה שונה באופן משמעותי בין אזורים.
קשרים משמעותיים בין תאי חיסון בודדים בין כל ה-ROI מוצגים בטבלה 3. איור 7 מראה את מפת החום של קשרים משמעותיים בין תאי חיסון שונים באזורים שונים. המיקוד האוטומטי של CD117 + תאי פיטום ב-TC נמצא בקורלציה משמעותית עם המיקוד האוטומטי של CD1a ב-TC וב-IM.
ערך פרוגנוסטי של משתנים קליניים ופתולוגיים מבין המשתנים הקליניים והפתולוגיים, רק גיל צעיר יותר היה קשור לסיכון גבוה יותר להישנות המחלה (HR = 0.96, CI: 0.93-0.99, p = 0.007), בעוד שאף משתנה לא היה קשור ל-DFS ול-OS (טבלה 4).
ערכים פרוגנוסטיים של חדירת תאי מערכת החיסון מיקוד אוטומטי גבוה של תאי פיטום CD117+ ב-IM היה קשור ל-DFS ארוך יותר (HR = 0.48, CI: 0.241 - 0.935, p = 0.031) ולמערכת ההפעלה (HR = 0.34, CI: 0.167 - 0.703, p = 0.004) (איור 8, טבלה 5). בנוסף, מיקוד אוטומטי גבוה של תאי פיטום CD117+ באזור PT היה קשור ל-DFS ארוך יותר (HR = 0.48, CI: 0.247 - 0.945, p = 0.034) (איור 8, טבלה 5). לעומת זאת, ה-AFs של תאי iDC ו-NK לא היו קשורים לאף אחת מהתוצאות. תאי פיטום CD117+ בשוליים הפנימיים שמרו על קשרים משמעותיים עם DFS (HR = 0.46, CI: 0.23-0.91, p = 0.027) ומערכת ההפעלה (HR = 0.33, CI: 0.16-0.68, p = 0.003) לאחר התאמה לשלב TNM (טבלה 6). באשר לתאי פיטום באזור PT, גם הקשר עם DFS נותר מובהק (HR = 0.47, CI: 0.24-0.93, p = 0.029) (טבלה 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig01.jpg"> איור 1: סכמה מייצגת של השיטות. תרשים סכמטי של זרימת העבודה לזיהוי התפקיד הפרוגנוסטי של תאי פיטום, תאים דנדריטיים ותאי הרג טבעיים ב- HCC. קיצורים: FFPE, פרפין קבוע פורמלין מוטבע; H&E, Hematoxylin ו Eosin; ROIs, אזורי עניין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig02.jpg"> איור 2: צילום מסך של חלון התוכנה. צילום מסך תיאורי המציג את השלב של ייבוא תמונות לפרויקט בתוכנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig03.jpg"> איור 3: צילום מסך של האפשרות של שבר שטח. צילום מסך מהתוכנה המציג את הפרמטרים שנבחרו כדי לכמת את חלק השטח של צביעה חיובית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig04.jpg"> איור 4: צילום מסך של האפשרות של סיווג פיקסלים. צילום מסך מהתוכנה המציג את התאים החיוביים של DAB לפני ואחרי סיווג פיקסלים. צביעת DAB החומה הומרה לצבע אדום לאחר סיווג פיקסלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig05.jpg"> איור 5: צביעה חיסונית מייצגת של תאי מערכת החיסון המולדת בחולי HCC. אימונוסטיין מייצג של (A) CD117+, (B) NKp46+ ו-(C) תאי CD1a+ בתאי TC (400x) ו-TIM (200x) של HCC. קיצורים: HCC, קרצינומה hepatocellular; TC, מרכז הגידול; TIM, שוליים פולשניים של גידול, עם שוליים פנימיים (IM) ושוליים חיצוניים (OM). הקו המקווקו מייצג גבול בין הגידול לבין רקמה שאינה גידולית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig06.jpg"> איור 6: נתונים סטטיסטיים המתארים את חלק השטח של תאי מערכת החיסון המולדת בחולי HCC. סטטיסטיקה עבור חלק השטח של תאים דנדריטיים CD1a+, תאי פיטום CD117+ ותאי NK NKp46+) באזורי TC, IM, OM ו- PT של HCC. קווים שחורים הם חציונים. מבחן הזוגות התואם של וילקוקסון עם תיקון בונפרוני שימש להשוואות. קיצורים: HCC, קרצינומה hepatocellular; TC, מרכז הגידול; IM, שוליים פנימיים; OM, שוליים חיצוניים; PT, אזור פריטומור. עמ' <0.001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>:
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig07.jpg"> איור 7: מפת חום של מתאמים משמעותיים בין שברי שטח של תאי פיטום, DCs ו-NKs באזורי עניין שונים. מפת חום של מתאמים משמעותיים בין שברי שטח של תאי פיטום CD117+, DCs CD1a+ ו- NKp46+NKs ב- TC, IM, OM ו- PT (Spearman ρ, p < 0.05). קיצורים: TC, מרכז הגידול; IM, שוליים פנימיים; OM, שוליים חיצוניים; PT, אזור peritumor; DC, תאים דנדריטיים; NK, תאי הרג טבעיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig08.jpg"> איור 8: עקומות קפלן-מאייר DFS ומערכת הפעלה עבור תאי פיטום חודרי גידול בחולי HCC. ניתוח קפלן-מאייר של DFS ו-OS לפי מיקוד אוטומטי נמוך לעומת גבוה של תאי פיטום חודרי גידול בשוליים הפנימיים (A, C) ו-PT (B) של HCC. קיצורים: HCC, קרצינומה hepatocellular; DFS, הישרדות ללא מחלות; IM, פולשנית פנימית; PT, אזור פריטומור. האיור הותאם באישור עלי ואחרים 26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: רקע קליני של חולי קרצינומה הפטוצלולרית שנרשמו. רקע קליני של מקרים רשומים של קרצינומה hepatocellular. קיצורים: NAFLD, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: הסתברות משוערת לתוצאות בניתוח קפלן-מאייר. ההסתברות המשוערת של RFP, DFS ומערכת הפעלה בניתוח קפלן-מאייר. קיצורים: RFP, פרופורציה ללא הישנות; DFS, הישרדות ללא מחלות; מערכת הפעלה, הישרדות כוללת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: מתאם בין מקטע השטח של תאי פיטום חודרי גידול, תאים דנדריטיים ותאי הרג טבעיים ב-ROI שונים. מתאם ספירמן (ρ) בין חלק השטח של תאי פיטום חודרי גידול, תאים דנדריטיים ותאי הרג טבעיים ב- ROI שונים, p < 0.038. קיצורים: TC, מרכז הגידול; IM, שוליים פנימיים; OM, שוליים חיצוניים; PT, אזור peritumor; ROIs, אזורי עניין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 4: ניתוח חד-משתני של משתנים קליניים ופתולוגיים הקשורים לזמן להישנות (TTR), הישרדות ללא מחלה (DFS) והישרדות כוללת (OS). " לא", מין נקבה או "A" היו קטגוריות הייחוס למשתנים דיכוטומיים. ערכים מודגשים מצביעים על מובהקות סטטיסטית ברמת p < 0.05. קיצורים: HR, יחס סיכון; CI, רווח בר-סמך; TTR, זמן להישנות; DFS, הישרדות ללא מחלות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%204.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 5: ניתוח חד-משתני של הקשר בין חלק שטח של תאי פיטום CD117+, תאים דנטריטיים CD1a + תאי הרג טבעיים ותאי הרג טבעיים מסוג NKp46+, עם TTR, DFS ומערכת הפעלה לכל אזור עניין בודד באמצעות רגרסיה של קוקס (67 חולי HCC). מקטע השטח של תאי החיסון לכל אזור (mm2) הומר לאחוזונים ולאחר מכן סווג לאחוזון נמוך (0-25) לעומת גבוה (אחוזון 25-100). יחסי סיכון מראים את הסיכון היחסי בהשוואה ל-1 עבור מיקוד אוטומטי נמוך. ערכים מודגשים מצביעים על מובהקות סטטיסטית ברמת p < 0.05. קיצורים: AF, שבר שטח; DFS, הישרדות ללא מחלות; מערכת הפעלה, הישרדות כוללת; HR, יחס סיכון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%205.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 6: חלק השטח של תאי פיטום CD117+ לכל החזר השקעה בודד הקשור להישרדות ללא מחלות והישרדות כוללת (ניתוח רב-משתני). ניתוח רב-משתני של הקשר של חלק השטח של תאי פיטום CD117+ עם DFS ומערכת הפעלה באזור IM ו- PT באמצעות רגרסיה של קוקס (67 חולי HCC). מקטע השטח של תאי החיסון לכל קטע שטח (מ"מ2) הומר לאחוזונים ולאחר מכן סווג לאחוזון נמוך (0-24) לעומת גבוה (אחוזון 25-100). יחסי סיכון מראים את הסיכון היחסי בהשוואה ל-1 עבור מיקוד אוטומטי נמוך. ערכים מודגשים מצביעים על מובהקות סטטיסטית ברמת p > 0.05. קיצורים: AF, שבר שטח; DFS, הישרדות ללא מחלות; מערכת הפעלה, הישרדות כוללת; HR, יחס סיכון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%206.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: סקריפט ליצירת החזר השקעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Supplemental%20File%20(Script%20for%20ROI).zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software at JoV

נוכחותם של תאי פיטום בשוליים הפנימיים ובאזורי הגידול של קרצינומה הפטוצלולרית לאחר כריתה מעניקה פרוגנוזה חיובית. מחקר זה תומך בתוכנת ניתוח התמונות QuPath כפלטפורמה מבטיחה שיכולה לענות על הצורך בשחזור, עקביות ודיוק בפתולוגיה דיגיטלית.

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies ...

התמקדנו בהערכת התפלגות תאי החיסון בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. ראשית, אנו מסייעים לחדירה של תאי מערכת החיסון לדגימת הגידול ולרקמות סמוכות שאינן סרטניות, ולאחר מכן אנו קובעים את ההשפעה הפרוגנוסטית שלהם בקרצינומה הפטוצלולרית. האתגר הראשון הוא מורכבות מבני הגידול, מה שהופך את ההפרדה בין רקמה גידולית לרקמה שאינה גידולית למאתגרת.בנוסף, טילים ידניים להסמכה הם זמן רב. כמו כן, צביעה לא ספציפית היא בעיה תורשתית עבור כל שיטות האימונוהיסטוכימיה. חיזוק הפרוגנוזה המוענקת על ידי תאי אב באזור הגידול הקבור והשוליים הפנימיים טוען למחקר רחוק יותר על תאי אב בקרצינומה הפטוצלולרית ובסוגי סרטן אחרים.ניתוח כזה ירוויח משימוש בתוכנת ניתוח אנרגיה לביאור מדויק של האזור המעניין ולכימות נכון של תאי החיסון.

mast-cells-microenvironment-hepatocellular-carcinoma-confer-favorable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software

830 Views.  Charles University. התמקדנו בהערכת התפלגות תאי החיסון בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. ראשית, אנו מסייעים לחדירה של תאי מערכת החיסון לדגימת הגידול ולרקמות סמוכות שאינן סרטניות, ולאחר מכן אנו קובעים את ההשפעה הפרוגנוסטית שלהם בקרצינומה הפטוצלולרית. האתגר הראשון הוא מורכבות מבני הגידול, מה שהופך א...

Video: Author Spotlight: Investigating Immune Cell Dynamics in the Tumor Microenvironment &#8212; Challenges and Innovations in Cancer Prognosis

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies investigating the expression and localization of immune cells within tumor tissues are associated with several challenges, including a lack of precise annotation for tumor regions and random selection of microscopic fields of view. QuPath is an open-source, user-friendly software that could meet the growing need for digital pathology in whole-slide image (WSI) analysis.
The infiltration of HCC and adjacent tissues by CD1a+ immature dendritic cells (iDCs), CD117+ mast cells, and NKp46+ natural killer cells (NKs) cells was assessed immunohistochemically in representative specimens of 67 patients with HCC who underwent curative resection. The area fraction (AF) of positively stained cells was assessed automatically in WSIs using QuPath in the tumor center (TC), inner margin (IM), outer margin (OM), and peritumor (PT) area. The prognostic significance of immune cells was evaluated for time to recurrence (TTR), disease-free survival (DFS), and overall survival (OS).
The AF of mast cells was significantly greater than the AF of NKs, and the AF of iDCs was significantly lower compared to NKs in each region of interest. High AFs of mast cells in the IM and PT areas were associated with longer DFS. In addition, high AF of mast cells in IM was associated with longer OS.
Computer-assisted analysis using this software is a suitable tool for obtaining prognostic information for tumor-infiltrating immune cells (iDCs, mast cells, and NKs) in different regions of HCC after resection. Mast cells displayed the greatest AF in all regions of interest (ROIs). Mast cells in the peritumor region and IM showed a positive prognostic significance.

The presence of mast cells in the inner margin and peritumor areas of hepatocellular carcinoma after resection confers a favorable prognosis. This study endorses QuPath image analysis software as a promising platform that could meet the need for reproducibility, consistency, and accuracy in digital pathology.