Name: a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לצוות הטכני של Translational יחידת המחקר; מרי Economou, José Galván, קרוליין האמר, דומיניק מילר, ליליאן Schöni והקבוצות מידענות במכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן.

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בית החולים Insel, ברן, שוויץ (07-10-13). רקמות התקבלו מבנק הגידול ברן, המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן. .1 תכנון ועיצוב (ייעוץ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחשוב על שאלת המחקר להיות ענה. החלט על סוגי הרקמות להיכלל בפרויקט. לקבוע מה מבנים היסטולוגית חשובים לענות על השאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברר את קוטר הליבה השימושי ביותר ואת מספר הליבות לחולה לפרויקט. החלט על מספר העותקים של מערך מיקרו רקמות של הדור הבא (ngTMA) המבוססים על הסכום של סמנים ביולוגיים להיחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול היבטים סטטיסטיים כגון גודל מדגם וניתוח לאחר microarray הרקמות (TMA) בנוי. לקבוע את מספרם של חולים להכללה במחקר ולהקים רקמות שליטה למערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את היסטולוגית (אוהאבחון) Haematoxylin וEosin (H &amp; E) שקופיות של כל מטופל. תסקור בקצרה את השקופיות ולזהות את אלה המכילים מידע רלוונטי והיסטולוגיה לפרויקט. הערה: הפוך קטעים חדשים של בלוקים פרפין, אם כתם מיוחד או שקופיות אימונוהיסטוכימיה הוא רצויים לסריקת שקופיות והסברים, במקום שקופיות H &amp; E </li></ol> סריקת .2 החלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מחשב וסורק שקופיות ותוכנת סריקה פתוחה. בחר באפשרות &quot;מצב אוטומטי&quot; לסריקת שדה בהירה מהמסך התצוגה המקדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;אפשרויות סריקה&quot; כדי להתאים את הפרמטרים איכות שקופיות. בשלב זה, לבחור אם שקופיות לסריקה ישירות לפלטפורמה הדיגיטלית נגישה על ידי אינטרנט או בכונן מקומי (או כונן חיצוני) ולהגדיר את סוגי סריקה ומספר נקודות פוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;פרמטרי שרת&quot; כדי לסרוק ל&quot; מרכז המקרה &quot;. בשלב זה, להוסיף עוד מגזינים, לתייג כל השקופיות ולהגדירהתיקייה במקרה שבו מרכז צריכים להיות מאוחסנות השקופיות. כל מגזין מכיל עד 25 שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות בדיקה / ניקיון של שקופיות היסטולוגית בפועל לסריקה. אם שקופיות הדרושות, נקיות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 25 שקופיות למגזין עם התוויות מצביעות פנימה (איור 3 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגזין בסורק. למגזין אחד או יותר, מניח אותם על גבי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לסרוק שקופיות על ידי לחיצה על החץ הירוק (איור 3 ב). כאשר כל השקופיות נסרקות, לפרוק את המגזינים וסגר את סורק תכנית, מחשב ושקופיות. </li></ol> .3 החלק דיגיטלי ביאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הכתובת של הדפדפן למרכז דיגיטלי ניהול שקופיות ולהוריד את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית החופשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית ובחר את התיקייה המכילה את השקופיות הדיגיטליות (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הערות, לסדר מחדש ולנהל את digitaתיקיית l שקופיות או להמחות את זכויות משתמש עמיתים או להוסיף קבצים מצורפים לתיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על שקופית דיגיטלית רצויה שמופיעה בתצוגה השקופיות הדיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי הגדלה, להעריך את השקופית ולמצוא את תחומי העניין להשתלבות ngTMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות &#39;כלי ביאור TMA&#39;, בחר את הגודל של הליבה הרצויה ואת הצבע של הביאור. הנח את הביאור בשקופית הדיגיטלית על ידי לחיצה עליו (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הביאור למבנים היסטולוגית הרצויים לשילובם בngTMA (איור 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה של ביאור שוב על ידי שימוש בכלי הביאור, בחירת גודל ליבה וצבע ביאור רצוי. חזור על הצפייה השקופיות והסברים על כל השקופיות בתיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, למקם את ליבות רקמה לPCR ל0.2 מ&quot;ל צינורות במקום השתלבות TMA. סמן בשקופיות באמצעות צבע שונה לזיהויכתמים אלה לניתוח מולקולרי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשימה של כל המקרים עם הביאורים המקבילים שלהם ובצבעים. </li></ol> בניית Microarray .4 רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את לוקי רקמות פרפין המתאימים לכל שקופיות הדיגיטליות המבואר, למיין בלוקים לפי הסדר הרצוי לmicroarraying רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לי לוקי הרקמות מינימליים של עובי 4 מ&quot;מ. אם לא, reembedding של רקמה יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב &quot;ON&quot; ומכשיר microarrayer רקמות אוטומטיות. פתח את תוכנת microarrayer הרקמה ולספק שם לפרויקט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;כלי שינוי&quot; ובחר את קוטר כלי הנדרש לפרויקט (כלומר, 0.6, 1.0, 1.5, או 2.0 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 12 לוקים &#39;הנמען&#39; TMA לתוך המכונה. תן תעודת זהות לכל אחד מהלוקים 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור פריסת TMA עבור כל בלוק נמען. שים לב עיצוב TMA עם מספר שורות, עמודות, ולרומם אתקווי y כמו גם מרחק בין ליבות. ליצור פריסה חדשה עבור כל בלוק נמען או להשתמש באותה הפריסה שוב ושוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב את הסמן על פריסת בלוק הנמען לקחת הליבה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, לטעון עד 60 לוקי תורם לmicroarrayer הרקמה (איור 5A). הנח עשרה בלוקים בכל שורה לפ תן לכל בלוק זיהוי תורם. שים לב תמונות של כל בלוק תורם על מסך המחשב שנרכש באופן אוטומטי על ידי microarrayer הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהבלוק הראשון, לחץ על &quot;Slide&quot;. שים לב לשקופית המבואר הדיגיטלית המאוחסנת במרכז הדיגיטלי ניהול שקופיות (או על הכונן החיצוני) שימוש בתצוגת השקופיות הדיגיטלית. הצג את התמונה של בלוק התורם וצד Side-by-שקופיות דיגיטליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודות התייחסות בחרו בתמונת הבלוק כדי להרכיב את תמונת בלוק תורם עם השקופיות הדיגיטליות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לחיצה על &quot;הבא&quot;, להתבונן ההסברים על תמונה מוגדלת של הבלוק. (איור 5 ב &lt;/ Strong&gt;). לחץ על חלקו העליון של ההסברים כדי לאשר ולחץ על &quot;התחל&quot;. הערה: זו מבקשת microarrayer הרקמה להתחיל קידוח חור של 0.6 מ&quot;מ קוטר בבלוק הנמען בנקודת המוצא שנבחרה. לאחר מכן, בשלב שני, תוך שימוש בכלי הניקוב, מכשיר אגרופים חור ברקמה מגוש התורם שנבחר באזור המבואר ואישר המדויק. אז ליבות מועברות מהתורם לבלוק הנמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 500 ליבות, לנקות את כלי הקידוח וחבטות באמצעות ספוגית של קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ליבות רקמה רצויה (ולא אגרופים לתוך ngTMA), לחץ על האפשרות &quot;PCR&quot; לבלוק, לאשר עד 4 הסברים ופגעו &quot;התחל&quot;. זה אגרוף ולהעביר את הליבות לתוך צינור 0.2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה חזור 4.9-4.11 עם בלוק התורם השני, וכן הלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שימוש בכל אבני התורם, להיכנס לסיבוב שני של בלוקים תורם (61-120) לmicroarray הרקמותאה ותמשיך לבצע צעדים 4.8-4.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן תמונות תורם ולחסום נמען תוך התקדמות הפרויקט בזמן קידוח והניקוב מתרחשים (איור 5 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;יצוא&quot; לאחר השלמת הפרויקט. אתר את קובץ .xslx עם תעודות הזהות של התורם ומקבל בלוק, הלוקליזציה של כל האגרופים בתוך TMA כמו גם פריסת TMA / העיצוב, בתיקייה מיוצאת. שמור את כל תמונות בלוק התורם עם כל הסברים על גבי כתמונות jpg בתיקייה מיוצאת (איור 5D). בלוק TMA הסופי הוא אז מוכן. </li></ol>

<ol>
	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

במאמר זה, פרוטוקול לngTMA מתואר. ngTMA הוא מושג חדש שהוקם לmicroarraying הרקמה מעורב בתכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית וביאור שקופיות, כמו גם אוטומטי microarraying הרקמה 12. בהשוואה לmicroarraying רקמה הקונבנציונלית, ngTMA מציע יתרונות רבים. בשלב ראשון, שלב תכנון והעיצוב הוא קריטי. הדגש הוא על מענה לשאלת מחקר ממוקד. זה צריך לקחת בחשבון את הנושאים היסטולוגית (למשל, שאזורים וכמה כתמים אני רוצה לכלול?), תכנון הסטטיסטי (למשל, גודל מדגם? כיצד לנתח הדגימות שלי מאוחר יותר?) ושיקולים לוגיסטיים (למשל, איך סמנים ביולוגיים רבים ולכן כמה עותקי ngTMA רבים?). NgTMA ספציפי הוא עשה עבור הצרכים ספציפיים, בין אם זה להקרנת סמן ביולוגי ותפוקה גבוהה או מיועד ללמוד היבטים היסטולוגית ספציפיים על רק cas נבחר גם כמהes. אחת, אם לא, חסרון החשוב ביותר של microarraying רקמה הקונבנציונלית הוא הדיוק הנמוך שבה סימונים על השקופיות היסטולוגית נעשים. המחקר של ספציפיים מבנים, תאים או אזורים היסטולוגית נעשה כמעט בלתי אפשרי. ngTMA מאפשר רמת דיוק גבוהה, כי הסברים מונחים ישירות על השקופיות הדיגיטליות. זה מאפשר לחוקר לבחור דווקא האזורים לחטוף מכות, כולל תאים ספציפיים. בדוגמא זו, אזורים שונים בתוך אותו גוש הרקמה נחתכים החוצה לarraying, כגון מרכז הגידול, מול הפלישה ותחומים של אינטראקציה הגידול / stroma המודגש על ידי הנוכחות של צבירי תאים סרטניים קטנים או אפילו תאים בודדים. דיוק זו יכול להיות מושגת רק באמצעות ngTMA. שלישית, משום ששקופיות נסרקות על גבי פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט, החלק את הצפייה והוספת הערות יכולות להתבצע דרך המחשב ולא עם מיקרוסקופ. תוכנת arraying הרקמה מספקת ידידותי למשתמשממשק עם רמה גבוהה של גמישות, פריסות שונות ולכן ועיצוב ngTMA יכול להיות מושגת. מאז בניית TMA מתבצעת באופן אוטומטי על ידי קידוח, יש צורך קטן לידות על תמרון ואת משך זמן לבנייה מצטמצמת משמעותית. הזמן לבניית TMA בדוגמא כאן הוא בין 24 שעות. שימוש בגישה TMA קונבנציונלית והערכת 15 אגרופים לשעה, הפרויקט הזה היה לוקח כ 304 שעה. יכול להיות מיושם ngTMA ללמוד ביטוי חלבון, mRNA או DNA, כמו גם שילובים של אלה. איור 9 ממחיש כמה של יישומים אלה לסמנים ביולוגיים פוטנציאליים. אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית יכולה להיות מיושמת על מנת לקבוע את מדד ההתפשטות של סרטן באמצעות קי 67. גישה משולבת לחקור ביטוי חלבון והגברת DNA לגנים כגון HER2 ניתן להשתמש. יכולות להיות שנאספו רקמות יחד על ngTMA אחד כדי להפחית את העלויות, שימוש ברקמות ומשאבים אחריםים. בנוסף, mRNA chromogenic הכלאה באתר לHER2 וגנים אחרים ניתן לבצע כדי לזהות תעתיקי mRNA בודדים במספר רב של מקרים תוך שימוש במספר מינימאלי של שקופיות רקמות. אימונוהיסטוכימיה של סמנים חיסוניים כגון CD8 ניתן דמיין בהקשר של microenvironment הגידול. גם אימונוהיסטוכימיה זוגית יכולה לשמש כדי להדגיש אזורים מסוימים של עניין, כגון יחסי גומלין בין תאי מערכת חיסון (שכותרת באדום) ותאים סרטניים (שכותרתו בחום) בחזית הפלישה של סרטן. כגון אזור של עניין לא ניתן היה נתפס באמצעות microarraying רקמה קונבנציונלית. עם זאת, פרוטוקול זה מכיל כמה מגבלות. האתגר החשוב ביותר הוא החפיפה בין בלוק תורם ושקופיות דיגיטליות. מספר גורמים יכולים להשפיע על שלב זה. ראשית, הסעיף האחרון מהבלוק צריך לשמש לסריקת שקופיות. במקרים רבים, H &amp; E היא לא החלק האחרון של בלוק תורם, rather זה immunohistochemical או אחר כתם. במקרה זה, גם שקופיות מוכתמות יכולות לשמש עוד ככתם האחרון נסרק ומבואר או H &amp; E חדשים צריך להיעשות. צריכה גם להיזהר בעת סעיפי רקמות נעשים כרקמות עשויות להתרחב באמבט המים שמוביל להתאמה מאתגרת של שקופיות ובלוק. שנית, ברגע פרויקטים מוגבלים ללוקי TMA נמען 12 מעובד בכל פעם אחת. פרויקטים גדולים העולים על 12 TMAs יש להקצות לשם פרויקט שני. שלישית, בלוקים התורם חייבים להיעשות באמצעות תבניות סטנדרטי וקלטות כמכשיר לא יכול להתאים את עצמו לגדלים שונים. לבסוף, בלוקים תורם חייבים לעלות על הגובה המינימלי (4 מ&quot;מ) כדי להשיג קידוח אופטימלי. בחלק מהמקרים, זה דורש reembedding של רקמות. מאות פרסומים בשנים האחרונות להדגיש את TMA ככלי רב ערך למחקר סמן ביולוגי. TMAs היה בשימוש ללמוד ריאות 13, מעי גס 7, BREAST 14, ערמונית 15, לבלב 16, שלפוחית ​​השתן 17, ו18 סרטן הקיבה, עד כמה שם. מספר גדל והולך של סופרים שילבו השימוש בTMAs עם ניתוח תמונה וצעדים משמעותיים שנעשים בכיוון זה 19-21. עם זאת, לצד קומץ קבוצות מחקר שפרסמו את רעיונות TMA חדשניים 22-24, מעט תשומת לב ניתנה כדי לייעל את טכניקת TMA עצמו. microarrayers רקמה אוטומטית, כגון ATA-27 ידי Estigen / יצ&#39;ר לעשות מספק עיצוב פריסה וחבטות רקמה רצויות ואוטומטיות. זה מייצג זאת היבט 1 בלבד של מושג ngTMA. ngTMA הוא שיפור משמעותי על פני שיטות microarraying הרקמה קונבנציונליות. היא משלבת מומחיות בהיסטולוגיה ועיצוב TMA עם הגמישות של הפתולוגיה דיגיטלית והדיוק של הסברים דיגיטליים עם המהירות ואמינות של בניית TMA אוטומטית. השילוב של ngTMוניתוח תמונה להערכת סמנים ביולוגיים חלבון ומולקולרי יהיו כלי רב עוצמה כדי לשפר את איכות המחקר קליני וtranslational בעתיד עוד יותר.

במהלך שני העשורים האחרונים, microarrays רקמות (TMAs) יש לו השפעה יוצאת דופן על מחקרי חקירת סמן ביולוגי. TMAs הוא בעצם &quot;ארכיון&quot; המיוצר על ידי ההעברה החוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות, בדרך כלל החל בגודל .6-2.0 מ&quot;מ קוטר רקמה, מקוביות &quot;תורם&quot; פרפין המוטבע לתוך בלוק אחד TMA &#39;נמען&#39; (איור 1) 1. שימוש בגודל ליבה קטן, כ 500 כתמי רקמות שונים מחולים שונים מעט או רבים יכולים להיות ערוך לאחד TMA 2. השימוש בTMAs ללימודי סמן ביולוגי פרוגנוסטיים או חזוי יש יתרונות רבים. קחו למשל את הדוגמא שבה ביטוי של סמנים ביולוגיים חלבון על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא להיות מוערך על 450 חולים. במקום ביצוע 450 כתמי immunohistochemical על 450 שקופיות מטופל מחולק מאותו מספר בלוקים, ניתן ערוכות ליבות קטנות מכל מדגם על T בודדבלוק MA. גם אם ליבות מרובות לקוחים מכל מטופל באופן אישי, מספר מינימאלי של בלוקים מיוצר. יש לכך ההשפעה הניכרת של אופן דרסטי פוחת עלויות ומשאבים אחרים, כמו גם הפחתת הרס רקמות. מחקרים בנוסף זה מאפשר מופעל כראוי באמצעות מספר רב של רקמות כדי להיות מוערכים באותם תנאי הניסוי. יש לי TMAs יישומים רבים ושונים. לדוגמא, הם יכולים לשמש כדי לחקור מורפולוגיה, ביטוי חלבון, ביטוי RNA וסטיות DNA הבא צביעה עם צבעים שונים, או לאחר אימונוהיסטוכימיה או chromogenic ואפילו הקרינה הכלאה באתר 3-7. גם מחקרים שנעשו לאחרונה שימוש TMAs לבדוק וריאציה הפנים ומעבדתיות בפרוטוקולים מכתים, להקים סגוליות או רגישות של נוגדנים למוטציות גנטיות ספציפיות, ולקבוע את שחזור interobserver של ביטוי חלבון בשיתופי פעולה בינלאומי <sup&gt; 8-11. הבנייה של TMAs המסורתי באמצעות רקמות המופק ממטופל היא הליך צעד רב ארוך (איור 2). זה מתחיל בחיפוש אחר מקרים מתאימים אפשריים ובחירה של שקופיות אבחון מהארכיונים במכון לפתולוגיה, או מוסד אחר, מהמקום שבו הם תוחזר. פתולוג מעריך כל שקופית לכל מקרה ובוחר את השקופית המייצגת ביותר למטרות המחקר. בשלב הבא, את האזור של עניין מסומן באמצעות עט ישירות מתחת למיקרוסקופ. זה הוא לעתים קרובות מאתגר ולא מדויק ותוצאות רק ב&quot; הערכה &quot;של איפה יש לנקוט אגרופים רקמה מ. בשלב בא, בלוקים פרפין המתאימים לשקופיות מסומנות אלה שנאספו מהארכיון. השוואה מהירה בין הבלוק והשקופיות נעשתה. באמצעות arrayer רקמה חצי אוטומטי או תוצרת בית, בלוק תורם אגרוף באזור המשוער של ריבית והועבר לגוש TMA נמען. בנייה של TMAs באמצעות טכניקת arraying זו היא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, לא מדויקת, ולא גמישה. הכנת TMA של 475 נקודות ב 3 עותקים היא מוערכת לקחת על 84 שעות של עבודה. גישה חדשה לבנייה של TMAs הוצגה לאחרונה על ידי המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן שמסתמכת על שלושה מרכיבים: תכנון ועיצוב (או ייעוץ), פתולוגיה הדיגיטלית בשילוב עם מומחיות בהיסטולוגיה וTMA האוטומטי arraying 12. יחד, מושג זה נקרא רקמות הדור הבא Microarray (ngTMA). להלן, פרוטוקול לngTMA מתואר מבוסס על דוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי. כאן, גידולים ראשוניים, כמו גם גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד יש ערוכים לngTMAs לניתוח סמן ביולוגי שלאחר מכן. בנוסף, ליבות רקמה קטנות מכל מטופל הן רצויים להפקת חומצת גרעין עתיד.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

מחקר סמן ביולוגי מסתמך על microarrays רקמות (TMA). TMAs מיוצר על ידי העברה חוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות מבלוק &#39;תורם&#39; לגוש &#39;נמען&#39; ולאחר מכן משמש למגוון רחב של יישומי סמן ביולוגי. הבנייה של TMAs הקונבנציונלי היא עבודה אינטנסיבית, לא מדויק, וגוזל זמן. הנה, פרוטוקול באמצעות מערכי רקמות הדור הבא (ngTMA) מתואר. ngTMA מתבסס על תכנון TMA ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, וmicroarraying רקמות אוטומטית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי באמצעות דוגמא של 134 חולי סרטן מעי גס גרורתי. היבטים היסטולוגית, סטטיסטיים ולוגיסטיים נחשבים, כגון סוג הרקמה, אזורים היסטולוגית ספציפיים, וסוגי תאים לצורך ההכללה בTMA, מספר כתמי רקמה, גודל מדגם, ניתוח סטטיסטי, ומספר עותקי TMA. שקופיות היסטולוגית לכל מטופל נסרקות והועלו פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט. שם, הם נתפסים ואןotated (מסומן) באמצעות כלי קוטר .6-2.0 מ&quot;מ, מספר פעמים תוך שימוש בצבעים שונים כדי להבחין אזורי רקמות. בלוקים תורם ו12 לוקים &#39;נמען&#39; נטענים לתוך המכשיר. שקופיות דיגיטליות אחזור והתאמה לתמונות בלוק תורם. arraying חוזר ונשנה של אזורים מבואר באופן אוטומטי מתבצע וכתוצאה מכך ngTMA. בדוגמא זו, שש ngTMAs מתוכננים מכיל שישה סוגים שונים של רקמות / אזורים היסטולוגית. שני עותקים של ngTMAs הם רצויים. שלוש עד ארבע שקופיות לכל מטופל נסרקים; 3 ריצות סריקה נחוצות ובוצע בין לילה. כל השקופיות מבוארת; צבעים שונים משמשים כדי לייצג את הרקמות / אזורים השונים, כלומר מרכז גידול, מול פלישה, גידול / סטרומה, גרורות בלוטה לימפה, גרורות בכבד, ורקמות נורמליות. 17 הסברים / מקרה נעשים; זמן להסברים הוא 2-3 דק &#39;/ מקרה. 12 ngTMAs מיוצר מכיל 4,556 נקודות. Arraying זמן הוא 15-20 שעה. בשל הדיוק, הגמישות והמהירות שלו, ngTMA היא רב עוצמהכלי לשיפור איכות TMAs נוסף המשמש במחקר קליני וtranslational.

תכנון ועיצוב הנה הדוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי, כי הם נחקרים בחשד לסדרה מסוימת של סמנים ביולוגיים הייתה בשימוש. לא רק ngTMA מתוכנן לחולים אלה, אך מיצוי DNA ואחריו ניתוח מוטאציות לכמה גנים שצוינו. במהלך שלב תכנון ועיצוב של ngTMA, ההיבטים הבאים כבר החליטו. כל אחד מחולים, 6 אזורים היסטולוגית שונים ייחקרו: מרכז גידול, מול פלישת גידול, אזורים של גידול הצפוף ניצנים (גידול / stroma אינטראקציה), רקמה נורמלית, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד. שלושה כתמי גידול לאזור רקמת גידול ושני כתמים נורמלים רקמה הם להיכלל בפרויקט (n = 17 נקודות לחולה). מאז זה מתוכנן כי יותר מ -50 סמנים ביולוגיים להיחקר על חומר החולה הזה, שני עותקים של ngTMA הסופי רצויים. בשל גודלו הקטן האפשרי של בלוטה לימפה וdistanגרורות t, קוטר ליבה קטן של 0.6 מ&quot;מ לבניית TMA לכל הרקמות נבחרה. בנוסף, הוא מתוכנן כי כל אזור יהיה ערוך בנפרד, כך ש6 ngTMAs המכיל אזורים היסטולוגית שונים יופק: ngTMA המכיל רקמות ממרכז הגידול), ב) מול פלישה, אזורי ג) גידול ניצנים, ד) רקמה נורמלית , ה) גרורות בלוטות לימפה, וו) גרורות בכבד. לעיצוב TMA באמצעות כלי 0.6 מ&quot;מ, מרחק נוח של 0.4 מ&quot;מ בין האגרופים ייבחר. בגלל ההערכה של נקודות רקמות בשורות ובטורים ארוכות היא לעתים קרובות מייגע, שני עיצובים שונים שנבחרו. עבור בלוקים גידול עם 3 אגרופים לכל אזור רקמה, עיצוב המכיל שישה חלקים נוצר. זה מוביל למספר כולל של 402 אגרופים רקמה. לאגרופי רקמה נורמלים, 2 אגרופים לכל מקרה יש לכלול. פריסה המתאימה 432 אגרופים בסך הכל נבחרה. יתר על כן, לכל מקרה ומקרה, עד 4ליבות ב0.6 מ&quot;מ תהיה בנוסף להיות חבטו החוצה והניחו לתוך 0.2 צינורות מ&quot;ל. ליבות רקמות אלה תהיינה גם מבוארת. לסיכום, 6 ngTMAs של רקמות שונות יופק (5 מערכי גידול x 3 אגרופים x 134 חולים; 1 מערך רקמות נורמלי x 2 אגרופים x 134 חולים) בנוסף ל4 ליבות לכל מטופל לצינורות. יחדיו, 2,814 הסברים ייעשו. בשלב בא, שקופיות H &amp; E המתאימות מחולים שנבחרו שנאספו מארכיון השקופיות. כל מקרה נבחן לזמן קצר על ידי פתולוג, ורוב שקופיות נציג של כל אחד מסוגי רקמות נבחרות. סריקה שקופיות דיגיטליות של כל סעיף היסטולוגית נעשות ליאור עתיד. לצורך המחקר, 3-4 שקופיות רקמה הן לסריקה בכל מקרה, כלומר, סרטן מעי גס ראשוני, עם או בלי רקמות סמוכות נורמליות, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד ואולי קון שקופית נוסףTaining רירית נורמלית. ניתן לטעון עד 10 מגזינים שונים במלואו לתוך סורק השקופיות; לכן ניתן לסרוק 250 שקופיות בטווח אחת. זמן לסריקה ולגודל שקופיות דיגיטלי משתנה עם הממדים של הרקמות וגורם האיכות רצויה. טווחי גורם האיכות בין 0 ל 100. כאן, גורם איכות של 60 נבחר, שכן הוא מייצר גודל קובץ סריקה קטן יותר ללא אובדן ניכר של איכות סריקה. ניתן לסרוק בביופסיות קטנות מתחת 30 שניות בזמן שחלקים שלמות של רקמות, כמו אלה המשמשים בדוגמא זו עשויה להימשך בין 2 ו10 דקות. גודל שקופיות דיגיטלי יכול גם לנוע בין 2 MB 2 GB. שימוש בגורם איכות של 60, סורק בין 600 MB ו1 GB מיוצרים. בין 402 ו536 שקופיות נדרשות לפרויקט זה בהיקף של 3 ריצות סריקה. כל ריצה מתבצעת בין לילה. כ 500 GB של שטח אחסון דרוש. שקופיות נסרקות ישירות על גבי פלטפורמה דיגיטלית בשם קייס מרכז (ngtma.unibe.pathcasecenter). מקרה המרכז הוא נגיש מכל מקום עם גישה לאינטרנט על ידי הזנת שם המשתמש וסיסמא הייעודיים. ביאור לביאור, שני היבטים יש לשקול: 1) יש לתת אזורי רקמות שונים בצבעים שונים וביאור 2) מספר ההסברים צריך לשקף את מספר העותקים הרצויים של ngTMA הסופי. במקרה זה, 3 נקודות לאזור גידול לעותק יחיד שנבחרו. ל2 עותקים, כל אזור יש מבואר באמצעות 6 נקודות. השימושי הם בצבע ירוק לרקמות נורמליות, כחולים למרכז הגידול, צהובים לחזית פלישת גידול, אדומים לאזורים של גידול ניצני אינטראקציה (גידול / סטרומה), שחורה לגרורות בלוטה לימפה, טורקיז לגרורות מרוחקות ולבנה סוף סוף לאזורים להיות המשמש לצינורות. ביאור של כל מקרה ומקרה דורש 2-3 דק &#39;. בניית ngTMA מחקר זה דורש 6 t לוקי ngTMAo יוקם ב2 עותקים, וכתוצאה מכך 12 לוקים סופיים. המספר המרבי של בלוקים נמען שיכול להיות נתמך על ידי arrayer הוא 12. כל בלוק גידול יכיל 402 כתמי רקמה וכל בלוק רקמה נורמלי יכיל 268 כתמים, בהיקף של 4,556 נקודות בכל הפרויקט. פריסת TMA נוצרה עבור כל בלוק נמען והפרויקט נשמר (6A דמויות, 6B). ניתן לטעון 60 לוקי רקמה לתוך microarrayer הרקמה במקביל; תמונה של כל בלוק תורם נלקחה. החל מבלוק התורם הראשון, השקופיות הדיגיטליות המבואר המקבילות מאוחזר מקייס המרכז. התאמת שקופיות מתבצעת, אשר יכול לקחת בין 1-3 דק &#39;. הסברים הם אישרו וarrayer מתבקש להתחיל חבטות (איור 7). זמן חבטות והעברת ליבה הוא כ 12 שניות. הפסד של ליבות במהלך הליך זה הוא מינימאלי. סה&quot;כ זמן לarraying פרויקט זה הוא כ 24 שעות, כולל זמן לSLIדה / התאמת בלוק וטעה מחדש של המכשיר. כמה דוגמאות של ngTMA מומחשות ב8A איור. יכולות להיות גם חבטו החוצה ליבות לניתוח מולקולרי שלאחר מכן בשלב זה (איור 8 ב). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 בלוק) &#39;תורם&#39;. ליבות מגוש התורם חבטו החוצה ומועברות לתוך B) בלוק נמען, או microarray רקמות (TMA). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 זרימת העבודה microarray רקמות הקונבנציונלית.) שקופיות היסטולוגית תאוחזרנה מהארכיון וארוחת בוקר) הניתן לf פתולוג<html> או סקירה. הסברים CD) נעשים בשקופיות המציינות את האזור &quot;המוערך&quot; להעברה. E) בלוקים הרקמה המקביל תאוחזרנה. F) בלוק ושקופיות בהשוואה להתאמה, אשר יכולים G) לפעמים להיות משימה מאתגרת. HJ ליבות) microarraying רקמות ואז לוקח מקום. K) מועברות שוב ושוב וL) TMA סופי בנוי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3) עד 25 שקופיות יכול להיות ממוקם בכל מגזין לסריקה. B) התאמות לגורם האיכות וגודל יכול להתבצע. ניתן לנטר את התקדמות סריקה. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 51893 / &quot;width =&quot; 51893fig4highres.jpg 600 &quot;/&gt; ניתן להעלות שקופיות איור 4) סרוק על גבי הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, Case המרכז. ב &#39;) ניתן לצפות בשקופיות דיגיטליות. כלי ביאור TMA מאפשר למשתמש לבחור את גודל הליבה וצבע הנדרש להסברים. C) ניתן להציב הערות ישירות על גבי השקופיות הדיגיטליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5) עד 60 לוקים יכול נטען לתוך microarrayer הרקמות, כלומר 10 לוקי תורם לשורה ו12 לוקי המקבלים כמו גם. B) תמונה של כל בלוק תורם נלקח, digitaאני מחליק מאוחזר. התאמה של בלוק ושקופיות נעשה וביאורים המשמשים לחבטות בלוק. C) ההתקדמות של arraying ניתן לנטר בזמן שמכשיר החבטות. ד) לאחר הניקוב מתבצע, יצוא של המיקום של כל נקודה בפריסה אבל גם תמונה של כל בלוק תורם עם ביאורים מקביל הוא עשה. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. פריסות TMA אלו שמשו לarraying בלוקים) גידול וארוחת בוקר) ברקמות נורמליות. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. מסך של תוכנת microarrayer הרקמה. משמאל, 12 מחדשניתן להציב בלוקים cipient במכשיר. בתחתית, תמונות של כל בלוק תורם נלקחות. במרכז, פריסת TMA, ההתקדמות של החבטות, כמו גם תמונות מוגדלות של כל בלוק תורם עם ביאורים נמצאת. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8) כמה דוגמאות של בלוקים ngTMA חדשים שנוצרו. B) אגרופים רקמות נוספים שניתן לנקוט לצורך הניתוח מולקולרי שלאחר מכן. ליבות אלה חבטו החוצה והניחו ב0.2 צינורות מ&quot;ל. <img alt="איור 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> איור 9 דוגמאות של יישומי סמן ביולוגי ngTMA. מכתים) אימונוהיסטוכימיה של Ki67 בסרטן מעי גס. הכפול HEאימונוהיסטוכימיה R2 / באתר assay ההכלאה מראה B) ביטוי נמוך של חלבון (חום) ולא הגברה של גן Her2 (שחור) ביחס לcentromere (אדום); C) ביטוי גבוה של החלבון (חום) והגברת גן Her2 ( ) ביחס שחור לcentromere (אדום). D) Chromogenic הכלאה באתר של HER2 מראה תעתיקי mRNA בודדים בסרטן שד ngTMA. E) אימונוהיסטוכימיה לCD8 בסרטן מעי גס. F) כתם אימונוהיסטוכימיה זוגי לסמן הפאן cytokeratin AE1 / AE3 (חום; תאי גידול) וCD68 (אדום;. מקרופאגים) הדגשת microenvironment גידול בסרטן מעי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">גס, אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית.

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

a-next-generation-tissue-microarray-ngtma-protocol-for-biomarker

Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Views.  University of Bern.  הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית. 

Video: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

בנייה ידנית של מיקרו-מערך רקמות בשיטת הקלטת ובמיקרו-מערך כף יד

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Cancer Research

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Bioengineering

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

Immunology and Infection

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biology

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

מידול החיסונית חזוי של גידולים מוצקים

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...