המחברים מבקשים להודות לצוות הטכני של Translational יחידת המחקר; מרי Economou, José Galván, קרוליין האמר, דומיניק מילר, ליליאן Schöni והקבוצות מידענות במכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן.

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בית החולים Insel, ברן, שוויץ (07-10-13). רקמות התקבלו מבנק הגידול ברן, המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן. .1 תכנון ועיצוב (ייעוץ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחשוב על שאלת המחקר להיות ענה. החלט על סוגי הרקמות להיכלל בפרויקט. לקבוע מה מבנים היסטולוגית חשובים לענות על השאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברר את קוטר הליבה השימושי ביותר ואת מספר הליבות לחולה לפרויקט. החלט על מספר העותקים של מערך מיקרו רקמות של הדור הבא (ngTMA) המבוססים על הסכום של סמנים ביולוגיים להיחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול היבטים סטטיסטיים כגון גודל מדגם וניתוח לאחר microarray הרקמות (TMA) בנוי. לקבוע את מספרם של חולים להכללה במחקר ולהקים רקמות שליטה למערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את היסטולוגית (אוהאבחון) Haematoxylin וEosin (H &amp; E) שקופיות של כל מטופל. תסקור בקצרה את השקופיות ולזהות את אלה המכילים מידע רלוונטי והיסטולוגיה לפרויקט. הערה: הפוך קטעים חדשים של בלוקים פרפין, אם כתם מיוחד או שקופיות אימונוהיסטוכימיה הוא רצויים לסריקת שקופיות והסברים, במקום שקופיות H &amp; E </li></ol> סריקת .2 החלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מחשב וסורק שקופיות ותוכנת סריקה פתוחה. בחר באפשרות &quot;מצב אוטומטי&quot; לסריקת שדה בהירה מהמסך התצוגה המקדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;אפשרויות סריקה&quot; כדי להתאים את הפרמטרים איכות שקופיות. בשלב זה, לבחור אם שקופיות לסריקה ישירות לפלטפורמה הדיגיטלית נגישה על ידי אינטרנט או בכונן מקומי (או כונן חיצוני) ולהגדיר את סוגי סריקה ומספר נקודות פוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;פרמטרי שרת&quot; כדי לסרוק ל&quot; מרכז המקרה &quot;. בשלב זה, להוסיף עוד מגזינים, לתייג כל השקופיות ולהגדירהתיקייה במקרה שבו מרכז צריכים להיות מאוחסנות השקופיות. כל מגזין מכיל עד 25 שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות בדיקה / ניקיון של שקופיות היסטולוגית בפועל לסריקה. אם שקופיות הדרושות, נקיות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 25 שקופיות למגזין עם התוויות מצביעות פנימה (איור 3 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגזין בסורק. למגזין אחד או יותר, מניח אותם על גבי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לסרוק שקופיות על ידי לחיצה על החץ הירוק (איור 3 ב). כאשר כל השקופיות נסרקות, לפרוק את המגזינים וסגר את סורק תכנית, מחשב ושקופיות. </li></ol> .3 החלק דיגיטלי ביאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הכתובת של הדפדפן למרכז דיגיטלי ניהול שקופיות ולהוריד את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית החופשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת הצופה שקופיות הדיגיטלית ובחר את התיקייה המכילה את השקופיות הדיגיטליות (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הערות, לסדר מחדש ולנהל את digitaתיקיית l שקופיות או להמחות את זכויות משתמש עמיתים או להוסיף קבצים מצורפים לתיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על שקופית דיגיטלית רצויה שמופיעה בתצוגה השקופיות הדיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי הגדלה, להעריך את השקופית ולמצוא את תחומי העניין להשתלבות ngTMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות &#39;כלי ביאור TMA&#39;, בחר את הגודל של הליבה הרצויה ואת הצבע של הביאור. הנח את הביאור בשקופית הדיגיטלית על ידי לחיצה עליו (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הביאור למבנים היסטולוגית הרצויים לשילובם בngTMA (איור 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה של ביאור שוב על ידי שימוש בכלי הביאור, בחירת גודל ליבה וצבע ביאור רצוי. חזור על הצפייה השקופיות והסברים על כל השקופיות בתיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, למקם את ליבות רקמה לPCR ל0.2 מ&quot;ל צינורות במקום השתלבות TMA. סמן בשקופיות באמצעות צבע שונה לזיהויכתמים אלה לניתוח מולקולרי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשימה של כל המקרים עם הביאורים המקבילים שלהם ובצבעים. </li></ol> בניית Microarray .4 רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את לוקי רקמות פרפין המתאימים לכל שקופיות הדיגיטליות המבואר, למיין בלוקים לפי הסדר הרצוי לmicroarraying רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לי לוקי הרקמות מינימליים של עובי 4 מ&quot;מ. אם לא, reembedding של רקמה יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב &quot;ON&quot; ומכשיר microarrayer רקמות אוטומטיות. פתח את תוכנת microarrayer הרקמה ולספק שם לפרויקט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;כלי שינוי&quot; ובחר את קוטר כלי הנדרש לפרויקט (כלומר, 0.6, 1.0, 1.5, או 2.0 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 12 לוקים &#39;הנמען&#39; TMA לתוך המכונה. תן תעודת זהות לכל אחד מהלוקים 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור פריסת TMA עבור כל בלוק נמען. שים לב עיצוב TMA עם מספר שורות, עמודות, ולרומם אתקווי y כמו גם מרחק בין ליבות. ליצור פריסה חדשה עבור כל בלוק נמען או להשתמש באותה הפריסה שוב ושוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב את הסמן על פריסת בלוק הנמען לקחת הליבה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, לטעון עד 60 לוקי תורם לmicroarrayer הרקמה (איור 5A). הנח עשרה בלוקים בכל שורה לפ תן לכל בלוק זיהוי תורם. שים לב תמונות של כל בלוק תורם על מסך המחשב שנרכש באופן אוטומטי על ידי microarrayer הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהבלוק הראשון, לחץ על &quot;Slide&quot;. שים לב לשקופית המבואר הדיגיטלית המאוחסנת במרכז הדיגיטלי ניהול שקופיות (או על הכונן החיצוני) שימוש בתצוגת השקופיות הדיגיטלית. הצג את התמונה של בלוק התורם וצד Side-by-שקופיות דיגיטליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודות התייחסות בחרו בתמונת הבלוק כדי להרכיב את תמונת בלוק תורם עם השקופיות הדיגיטליות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לחיצה על &quot;הבא&quot;, להתבונן ההסברים על תמונה מוגדלת של הבלוק. (איור 5 ב &lt;/ Strong&gt;). לחץ על חלקו העליון של ההסברים כדי לאשר ולחץ על &quot;התחל&quot;. הערה: זו מבקשת microarrayer הרקמה להתחיל קידוח חור של 0.6 מ&quot;מ קוטר בבלוק הנמען בנקודת המוצא שנבחרה. לאחר מכן, בשלב שני, תוך שימוש בכלי הניקוב, מכשיר אגרופים חור ברקמה מגוש התורם שנבחר באזור המבואר ואישר המדויק. אז ליבות מועברות מהתורם לבלוק הנמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 500 ליבות, לנקות את כלי הקידוח וחבטות באמצעות ספוגית של קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ליבות רקמה רצויה (ולא אגרופים לתוך ngTMA), לחץ על האפשרות &quot;PCR&quot; לבלוק, לאשר עד 4 הסברים ופגעו &quot;התחל&quot;. זה אגרוף ולהעביר את הליבות לתוך צינור 0.2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה חזור 4.9-4.11 עם בלוק התורם השני, וכן הלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שימוש בכל אבני התורם, להיכנס לסיבוב שני של בלוקים תורם (61-120) לmicroarray הרקמותאה ותמשיך לבצע צעדים 4.8-4.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן תמונות תורם ולחסום נמען תוך התקדמות הפרויקט בזמן קידוח והניקוב מתרחשים (איור 5 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע &quot;יצוא&quot; לאחר השלמת הפרויקט. אתר את קובץ .xslx עם תעודות הזהות של התורם ומקבל בלוק, הלוקליזציה של כל האגרופים בתוך TMA כמו גם פריסת TMA / העיצוב, בתיקייה מיוצאת. שמור את כל תמונות בלוק התורם עם כל הסברים על גבי כתמונות jpg בתיקייה מיוצאת (איור 5D). בלוק TMA הסופי הוא אז מוכן. </li></ol>

<ol>
	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

במאמר זה, פרוטוקול לngTMA מתואר. ngTMA הוא מושג חדש שהוקם לmicroarraying הרקמה מעורב בתכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית וביאור שקופיות, כמו גם אוטומטי microarraying הרקמה 12. בהשוואה לmicroarraying רקמה הקונבנציונלית, ngTMA מציע יתרונות רבים. בשלב ראשון, שלב תכנון והעיצוב הוא קריטי. הדגש הוא על מענה לשאלת מחקר ממוקד. זה צריך לקחת בחשבון את הנושאים היסטולוגית (למשל, שאזורים וכמה כתמים אני רוצה לכלול?), תכנון הסטטיסטי (למשל, גודל מדגם? כיצד לנתח הדגימות שלי מאוחר יותר?) ושיקולים לוגיסטיים (למשל, איך סמנים ביולוגיים רבים ולכן כמה עותקי ngTMA רבים?). NgTMA ספציפי הוא עשה עבור הצרכים ספציפיים, בין אם זה להקרנת סמן ביולוגי ותפוקה גבוהה או מיועד ללמוד היבטים היסטולוגית ספציפיים על רק cas נבחר גם כמהes. אחת, אם לא, חסרון החשוב ביותר של microarraying רקמה הקונבנציונלית הוא הדיוק הנמוך שבה סימונים על השקופיות היסטולוגית נעשים. המחקר של ספציפיים מבנים, תאים או אזורים היסטולוגית נעשה כמעט בלתי אפשרי. ngTMA מאפשר רמת דיוק גבוהה, כי הסברים מונחים ישירות על השקופיות הדיגיטליות. זה מאפשר לחוקר לבחור דווקא האזורים לחטוף מכות, כולל תאים ספציפיים. בדוגמא זו, אזורים שונים בתוך אותו גוש הרקמה נחתכים החוצה לarraying, כגון מרכז הגידול, מול הפלישה ותחומים של אינטראקציה הגידול / stroma המודגש על ידי הנוכחות של צבירי תאים סרטניים קטנים או אפילו תאים בודדים. דיוק זו יכול להיות מושגת רק באמצעות ngTMA. שלישית, משום ששקופיות נסרקות על גבי פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט, החלק את הצפייה והוספת הערות יכולות להתבצע דרך המחשב ולא עם מיקרוסקופ. תוכנת arraying הרקמה מספקת ידידותי למשתמשממשק עם רמה גבוהה של גמישות, פריסות שונות ולכן ועיצוב ngTMA יכול להיות מושגת. מאז בניית TMA מתבצעת באופן אוטומטי על ידי קידוח, יש צורך קטן לידות על תמרון ואת משך זמן לבנייה מצטמצמת משמעותית. הזמן לבניית TMA בדוגמא כאן הוא בין 24 שעות. שימוש בגישה TMA קונבנציונלית והערכת 15 אגרופים לשעה, הפרויקט הזה היה לוקח כ 304 שעה. יכול להיות מיושם ngTMA ללמוד ביטוי חלבון, mRNA או DNA, כמו גם שילובים של אלה. איור 9 ממחיש כמה של יישומים אלה לסמנים ביולוגיים פוטנציאליים. אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית יכולה להיות מיושמת על מנת לקבוע את מדד ההתפשטות של סרטן באמצעות קי 67. גישה משולבת לחקור ביטוי חלבון והגברת DNA לגנים כגון HER2 ניתן להשתמש. יכולות להיות שנאספו רקמות יחד על ngTMA אחד כדי להפחית את העלויות, שימוש ברקמות ומשאבים אחריםים. בנוסף, mRNA chromogenic הכלאה באתר לHER2 וגנים אחרים ניתן לבצע כדי לזהות תעתיקי mRNA בודדים במספר רב של מקרים תוך שימוש במספר מינימאלי של שקופיות רקמות. אימונוהיסטוכימיה של סמנים חיסוניים כגון CD8 ניתן דמיין בהקשר של microenvironment הגידול. גם אימונוהיסטוכימיה זוגית יכולה לשמש כדי להדגיש אזורים מסוימים של עניין, כגון יחסי גומלין בין תאי מערכת חיסון (שכותרת באדום) ותאים סרטניים (שכותרתו בחום) בחזית הפלישה של סרטן. כגון אזור של עניין לא ניתן היה נתפס באמצעות microarraying רקמה קונבנציונלית. עם זאת, פרוטוקול זה מכיל כמה מגבלות. האתגר החשוב ביותר הוא החפיפה בין בלוק תורם ושקופיות דיגיטליות. מספר גורמים יכולים להשפיע על שלב זה. ראשית, הסעיף האחרון מהבלוק צריך לשמש לסריקת שקופיות. במקרים רבים, H &amp; E היא לא החלק האחרון של בלוק תורם, rather זה immunohistochemical או אחר כתם. במקרה זה, גם שקופיות מוכתמות יכולות לשמש עוד ככתם האחרון נסרק ומבואר או H &amp; E חדשים צריך להיעשות. צריכה גם להיזהר בעת סעיפי רקמות נעשים כרקמות עשויות להתרחב באמבט המים שמוביל להתאמה מאתגרת של שקופיות ובלוק. שנית, ברגע פרויקטים מוגבלים ללוקי TMA נמען 12 מעובד בכל פעם אחת. פרויקטים גדולים העולים על 12 TMAs יש להקצות לשם פרויקט שני. שלישית, בלוקים התורם חייבים להיעשות באמצעות תבניות סטנדרטי וקלטות כמכשיר לא יכול להתאים את עצמו לגדלים שונים. לבסוף, בלוקים תורם חייבים לעלות על הגובה המינימלי (4 מ&quot;מ) כדי להשיג קידוח אופטימלי. בחלק מהמקרים, זה דורש reembedding של רקמות. מאות פרסומים בשנים האחרונות להדגיש את TMA ככלי רב ערך למחקר סמן ביולוגי. TMAs היה בשימוש ללמוד ריאות 13, מעי גס 7, BREAST 14, ערמונית 15, לבלב 16, שלפוחית ​​השתן 17, ו18 סרטן הקיבה, עד כמה שם. מספר גדל והולך של סופרים שילבו השימוש בTMAs עם ניתוח תמונה וצעדים משמעותיים שנעשים בכיוון זה 19-21. עם זאת, לצד קומץ קבוצות מחקר שפרסמו את רעיונות TMA חדשניים 22-24, מעט תשומת לב ניתנה כדי לייעל את טכניקת TMA עצמו. microarrayers רקמה אוטומטית, כגון ATA-27 ידי Estigen / יצ&#39;ר לעשות מספק עיצוב פריסה וחבטות רקמה רצויות ואוטומטיות. זה מייצג זאת היבט 1 בלבד של מושג ngTMA. ngTMA הוא שיפור משמעותי על פני שיטות microarraying הרקמה קונבנציונליות. היא משלבת מומחיות בהיסטולוגיה ועיצוב TMA עם הגמישות של הפתולוגיה דיגיטלית והדיוק של הסברים דיגיטליים עם המהירות ואמינות של בניית TMA אוטומטית. השילוב של ngTMוניתוח תמונה להערכת סמנים ביולוגיים חלבון ומולקולרי יהיו כלי רב עוצמה כדי לשפר את איכות המחקר קליני וtranslational בעתיד עוד יותר.

במהלך שני העשורים האחרונים, microarrays רקמות (TMAs) יש לו השפעה יוצאת דופן על מחקרי חקירת סמן ביולוגי. TMAs הוא בעצם &quot;ארכיון&quot; המיוצר על ידי ההעברה החוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות, בדרך כלל החל בגודל .6-2.0 מ&quot;מ קוטר רקמה, מקוביות &quot;תורם&quot; פרפין המוטבע לתוך בלוק אחד TMA &#39;נמען&#39; (איור 1) 1. שימוש בגודל ליבה קטן, כ 500 כתמי רקמות שונים מחולים שונים מעט או רבים יכולים להיות ערוך לאחד TMA 2. השימוש בTMAs ללימודי סמן ביולוגי פרוגנוסטיים או חזוי יש יתרונות רבים. קחו למשל את הדוגמא שבה ביטוי של סמנים ביולוגיים חלבון על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא להיות מוערך על 450 חולים. במקום ביצוע 450 כתמי immunohistochemical על 450 שקופיות מטופל מחולק מאותו מספר בלוקים, ניתן ערוכות ליבות קטנות מכל מדגם על T בודדבלוק MA. גם אם ליבות מרובות לקוחים מכל מטופל באופן אישי, מספר מינימאלי של בלוקים מיוצר. יש לכך ההשפעה הניכרת של אופן דרסטי פוחת עלויות ומשאבים אחרים, כמו גם הפחתת הרס רקמות. מחקרים בנוסף זה מאפשר מופעל כראוי באמצעות מספר רב של רקמות כדי להיות מוערכים באותם תנאי הניסוי. יש לי TMAs יישומים רבים ושונים. לדוגמא, הם יכולים לשמש כדי לחקור מורפולוגיה, ביטוי חלבון, ביטוי RNA וסטיות DNA הבא צביעה עם צבעים שונים, או לאחר אימונוהיסטוכימיה או chromogenic ואפילו הקרינה הכלאה באתר 3-7. גם מחקרים שנעשו לאחרונה שימוש TMAs לבדוק וריאציה הפנים ומעבדתיות בפרוטוקולים מכתים, להקים סגוליות או רגישות של נוגדנים למוטציות גנטיות ספציפיות, ולקבוע את שחזור interobserver של ביטוי חלבון בשיתופי פעולה בינלאומי <sup&gt; 8-11. הבנייה של TMAs המסורתי באמצעות רקמות המופק ממטופל היא הליך צעד רב ארוך (איור 2). זה מתחיל בחיפוש אחר מקרים מתאימים אפשריים ובחירה של שקופיות אבחון מהארכיונים במכון לפתולוגיה, או מוסד אחר, מהמקום שבו הם תוחזר. פתולוג מעריך כל שקופית לכל מקרה ובוחר את השקופית המייצגת ביותר למטרות המחקר. בשלב הבא, את האזור של עניין מסומן באמצעות עט ישירות מתחת למיקרוסקופ. זה הוא לעתים קרובות מאתגר ולא מדויק ותוצאות רק ב&quot; הערכה &quot;של איפה יש לנקוט אגרופים רקמה מ. בשלב בא, בלוקים פרפין המתאימים לשקופיות מסומנות אלה שנאספו מהארכיון. השוואה מהירה בין הבלוק והשקופיות נעשתה. באמצעות arrayer רקמה חצי אוטומטי או תוצרת בית, בלוק תורם אגרוף באזור המשוער של ריבית והועבר לגוש TMA נמען. בנייה של TMAs באמצעות טכניקת arraying זו היא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, לא מדויקת, ולא גמישה. הכנת TMA של 475 נקודות ב 3 עותקים היא מוערכת לקחת על 84 שעות של עבודה. גישה חדשה לבנייה של TMAs הוצגה לאחרונה על ידי המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן שמסתמכת על שלושה מרכיבים: תכנון ועיצוב (או ייעוץ), פתולוגיה הדיגיטלית בשילוב עם מומחיות בהיסטולוגיה וTMA האוטומטי arraying 12. יחד, מושג זה נקרא רקמות הדור הבא Microarray (ngTMA). להלן, פרוטוקול לngTMA מתואר מבוסס על דוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי. כאן, גידולים ראשוניים, כמו גם גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד יש ערוכים לngTMAs לניתוח סמן ביולוגי שלאחר מכן. בנוסף, ליבות רקמה קטנות מכל מטופל הן רצויים להפקת חומצת גרעין עתיד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic 250 Flash II</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TMA Grandmaster</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tissue Microarrayer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic Viewer</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;">free</td>
			<td>Slide viewing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Case Center</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital slide platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

מחקר סמן ביולוגי מסתמך על microarrays רקמות (TMA). TMAs מיוצר על ידי העברה חוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות מבלוק &#39;תורם&#39; לגוש &#39;נמען&#39; ולאחר מכן משמש למגוון רחב של יישומי סמן ביולוגי. הבנייה של TMAs הקונבנציונלי היא עבודה אינטנסיבית, לא מדויק, וגוזל זמן. הנה, פרוטוקול באמצעות מערכי רקמות הדור הבא (ngTMA) מתואר. ngTMA מתבסס על תכנון TMA ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, וmicroarraying רקמות אוטומטית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי באמצעות דוגמא של 134 חולי סרטן מעי גס גרורתי. היבטים היסטולוגית, סטטיסטיים ולוגיסטיים נחשבים, כגון סוג הרקמה, אזורים היסטולוגית ספציפיים, וסוגי תאים לצורך ההכללה בTMA, מספר כתמי רקמה, גודל מדגם, ניתוח סטטיסטי, ומספר עותקי TMA. שקופיות היסטולוגית לכל מטופל נסרקות והועלו פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט. שם, הם נתפסים ואןotated (מסומן) באמצעות כלי קוטר .6-2.0 מ&quot;מ, מספר פעמים תוך שימוש בצבעים שונים כדי להבחין אזורי רקמות. בלוקים תורם ו12 לוקים &#39;נמען&#39; נטענים לתוך המכשיר. שקופיות דיגיטליות אחזור והתאמה לתמונות בלוק תורם. arraying חוזר ונשנה של אזורים מבואר באופן אוטומטי מתבצע וכתוצאה מכך ngTMA. בדוגמא זו, שש ngTMAs מתוכננים מכיל שישה סוגים שונים של רקמות / אזורים היסטולוגית. שני עותקים של ngTMAs הם רצויים. שלוש עד ארבע שקופיות לכל מטופל נסרקים; 3 ריצות סריקה נחוצות ובוצע בין לילה. כל השקופיות מבוארת; צבעים שונים משמשים כדי לייצג את הרקמות / אזורים השונים, כלומר מרכז גידול, מול פלישה, גידול / סטרומה, גרורות בלוטה לימפה, גרורות בכבד, ורקמות נורמליות. 17 הסברים / מקרה נעשים; זמן להסברים הוא 2-3 דק &#39;/ מקרה. 12 ngTMAs מיוצר מכיל 4,556 נקודות. Arraying זמן הוא 15-20 שעה. בשל הדיוק, הגמישות והמהירות שלו, ngTMA היא רב עוצמהכלי לשיפור איכות TMAs נוסף המשמש במחקר קליני וtranslational.

תכנון ועיצוב הנה הדוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי, כי הם נחקרים בחשד לסדרה מסוימת של סמנים ביולוגיים הייתה בשימוש. לא רק ngTMA מתוכנן לחולים אלה, אך מיצוי DNA ואחריו ניתוח מוטאציות לכמה גנים שצוינו. במהלך שלב תכנון ועיצוב של ngTMA, ההיבטים הבאים כבר החליטו. כל אחד מחולים, 6 אזורים היסטולוגית שונים ייחקרו: מרכז גידול, מול פלישת גידול, אזורים של גידול הצפוף ניצנים (גידול / stroma אינטראקציה), רקמה נורמלית, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד. שלושה כתמי גידול לאזור רקמת גידול ושני כתמים נורמלים רקמה הם להיכלל בפרויקט (n = 17 נקודות לחולה). מאז זה מתוכנן כי יותר מ -50 סמנים ביולוגיים להיחקר על חומר החולה הזה, שני עותקים של ngTMA הסופי רצויים. בשל גודלו הקטן האפשרי של בלוטה לימפה וdistanגרורות t, קוטר ליבה קטן של 0.6 מ&quot;מ לבניית TMA לכל הרקמות נבחרה. בנוסף, הוא מתוכנן כי כל אזור יהיה ערוך בנפרד, כך ש6 ngTMAs המכיל אזורים היסטולוגית שונים יופק: ngTMA המכיל רקמות ממרכז הגידול), ב) מול פלישה, אזורי ג) גידול ניצנים, ד) רקמה נורמלית , ה) גרורות בלוטות לימפה, וו) גרורות בכבד. לעיצוב TMA באמצעות כלי 0.6 מ&quot;מ, מרחק נוח של 0.4 מ&quot;מ בין האגרופים ייבחר. בגלל ההערכה של נקודות רקמות בשורות ובטורים ארוכות היא לעתים קרובות מייגע, שני עיצובים שונים שנבחרו. עבור בלוקים גידול עם 3 אגרופים לכל אזור רקמה, עיצוב המכיל שישה חלקים נוצר. זה מוביל למספר כולל של 402 אגרופים רקמה. לאגרופי רקמה נורמלים, 2 אגרופים לכל מקרה יש לכלול. פריסה המתאימה 432 אגרופים בסך הכל נבחרה. יתר על כן, לכל מקרה ומקרה, עד 4ליבות ב0.6 מ&quot;מ תהיה בנוסף להיות חבטו החוצה והניחו לתוך 0.2 צינורות מ&quot;ל. ליבות רקמות אלה תהיינה גם מבוארת. לסיכום, 6 ngTMAs של רקמות שונות יופק (5 מערכי גידול x 3 אגרופים x 134 חולים; 1 מערך רקמות נורמלי x 2 אגרופים x 134 חולים) בנוסף ל4 ליבות לכל מטופל לצינורות. יחדיו, 2,814 הסברים ייעשו. בשלב בא, שקופיות H &amp; E המתאימות מחולים שנבחרו שנאספו מארכיון השקופיות. כל מקרה נבחן לזמן קצר על ידי פתולוג, ורוב שקופיות נציג של כל אחד מסוגי רקמות נבחרות. סריקה שקופיות דיגיטליות של כל סעיף היסטולוגית נעשות ליאור עתיד. לצורך המחקר, 3-4 שקופיות רקמה הן לסריקה בכל מקרה, כלומר, סרטן מעי גס ראשוני, עם או בלי רקמות סמוכות נורמליות, גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד ואולי קון שקופית נוסףTaining רירית נורמלית. ניתן לטעון עד 10 מגזינים שונים במלואו לתוך סורק השקופיות; לכן ניתן לסרוק 250 שקופיות בטווח אחת. זמן לסריקה ולגודל שקופיות דיגיטלי משתנה עם הממדים של הרקמות וגורם האיכות רצויה. טווחי גורם האיכות בין 0 ל 100. כאן, גורם איכות של 60 נבחר, שכן הוא מייצר גודל קובץ סריקה קטן יותר ללא אובדן ניכר של איכות סריקה. ניתן לסרוק בביופסיות קטנות מתחת 30 שניות בזמן שחלקים שלמות של רקמות, כמו אלה המשמשים בדוגמא זו עשויה להימשך בין 2 ו10 דקות. גודל שקופיות דיגיטלי יכול גם לנוע בין 2 MB 2 GB. שימוש בגורם איכות של 60, סורק בין 600 MB ו1 GB מיוצרים. בין 402 ו536 שקופיות נדרשות לפרויקט זה בהיקף של 3 ריצות סריקה. כל ריצה מתבצעת בין לילה. כ 500 GB של שטח אחסון דרוש. שקופיות נסרקות ישירות על גבי פלטפורמה דיגיטלית בשם קייס מרכז (ngtma.unibe.pathcasecenter). מקרה המרכז הוא נגיש מכל מקום עם גישה לאינטרנט על ידי הזנת שם המשתמש וסיסמא הייעודיים. ביאור לביאור, שני היבטים יש לשקול: 1) יש לתת אזורי רקמות שונים בצבעים שונים וביאור 2) מספר ההסברים צריך לשקף את מספר העותקים הרצויים של ngTMA הסופי. במקרה זה, 3 נקודות לאזור גידול לעותק יחיד שנבחרו. ל2 עותקים, כל אזור יש מבואר באמצעות 6 נקודות. השימושי הם בצבע ירוק לרקמות נורמליות, כחולים למרכז הגידול, צהובים לחזית פלישת גידול, אדומים לאזורים של גידול ניצני אינטראקציה (גידול / סטרומה), שחורה לגרורות בלוטה לימפה, טורקיז לגרורות מרוחקות ולבנה סוף סוף לאזורים להיות המשמש לצינורות. ביאור של כל מקרה ומקרה דורש 2-3 דק &#39;. בניית ngTMA מחקר זה דורש 6 t לוקי ngTMAo יוקם ב2 עותקים, וכתוצאה מכך 12 לוקים סופיים. המספר המרבי של בלוקים נמען שיכול להיות נתמך על ידי arrayer הוא 12. כל בלוק גידול יכיל 402 כתמי רקמה וכל בלוק רקמה נורמלי יכיל 268 כתמים, בהיקף של 4,556 נקודות בכל הפרויקט. פריסת TMA נוצרה עבור כל בלוק נמען והפרויקט נשמר (6A דמויות, 6B). ניתן לטעון 60 לוקי רקמה לתוך microarrayer הרקמה במקביל; תמונה של כל בלוק תורם נלקחה. החל מבלוק התורם הראשון, השקופיות הדיגיטליות המבואר המקבילות מאוחזר מקייס המרכז. התאמת שקופיות מתבצעת, אשר יכול לקחת בין 1-3 דק &#39;. הסברים הם אישרו וarrayer מתבקש להתחיל חבטות (איור 7). זמן חבטות והעברת ליבה הוא כ 12 שניות. הפסד של ליבות במהלך הליך זה הוא מינימאלי. סה&quot;כ זמן לarraying פרויקט זה הוא כ 24 שעות, כולל זמן לSLIדה / התאמת בלוק וטעה מחדש של המכשיר. כמה דוגמאות של ngTMA מומחשות ב8A איור. יכולות להיות גם חבטו החוצה ליבות לניתוח מולקולרי שלאחר מכן בשלב זה (איור 8 ב). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 בלוק) &#39;תורם&#39;. ליבות מגוש התורם חבטו החוצה ומועברות לתוך B) בלוק נמען, או microarray רקמות (TMA). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 זרימת העבודה microarray רקמות הקונבנציונלית.) שקופיות היסטולוגית תאוחזרנה מהארכיון וארוחת בוקר) הניתן לf פתולוג<html> או סקירה. הסברים CD) נעשים בשקופיות המציינות את האזור &quot;המוערך&quot; להעברה. E) בלוקים הרקמה המקביל תאוחזרנה. F) בלוק ושקופיות בהשוואה להתאמה, אשר יכולים G) לפעמים להיות משימה מאתגרת. HJ ליבות) microarraying רקמות ואז לוקח מקום. K) מועברות שוב ושוב וL) TMA סופי בנוי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3) עד 25 שקופיות יכול להיות ממוקם בכל מגזין לסריקה. B) התאמות לגורם האיכות וגודל יכול להתבצע. ניתן לנטר את התקדמות סריקה. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 51893 / &quot;width =&quot; 51893fig4highres.jpg 600 &quot;/&gt; ניתן להעלות שקופיות איור 4) סרוק על גבי הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, Case המרכז. ב &#39;) ניתן לצפות בשקופיות דיגיטליות. כלי ביאור TMA מאפשר למשתמש לבחור את גודל הליבה וצבע הנדרש להסברים. C) ניתן להציב הערות ישירות על גבי השקופיות הדיגיטליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5) עד 60 לוקים יכול נטען לתוך microarrayer הרקמות, כלומר 10 לוקי תורם לשורה ו12 לוקי המקבלים כמו גם. B) תמונה של כל בלוק תורם נלקח, digitaאני מחליק מאוחזר. התאמה של בלוק ושקופיות נעשה וביאורים המשמשים לחבטות בלוק. C) ההתקדמות של arraying ניתן לנטר בזמן שמכשיר החבטות. ד) לאחר הניקוב מתבצע, יצוא של המיקום של כל נקודה בפריסה אבל גם תמונה של כל בלוק תורם עם ביאורים מקביל הוא עשה. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. פריסות TMA אלו שמשו לarraying בלוקים) גידול וארוחת בוקר) ברקמות נורמליות. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. מסך של תוכנת microarrayer הרקמה. משמאל, 12 מחדשניתן להציב בלוקים cipient במכשיר. בתחתית, תמונות של כל בלוק תורם נלקחות. במרכז, פריסת TMA, ההתקדמות של החבטות, כמו גם תמונות מוגדלות של כל בלוק תורם עם ביאורים נמצאת. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8) כמה דוגמאות של בלוקים ngTMA חדשים שנוצרו. B) אגרופים רקמות נוספים שניתן לנקוט לצורך הניתוח מולקולרי שלאחר מכן. ליבות אלה חבטו החוצה והניחו ב0.2 צינורות מ&quot;ל. <img alt="איור 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> איור 9 דוגמאות של יישומי סמן ביולוגי ngTMA. מכתים) אימונוהיסטוכימיה של Ki67 בסרטן מעי גס. הכפול HEאימונוהיסטוכימיה R2 / באתר assay ההכלאה מראה B) ביטוי נמוך של חלבון (חום) ולא הגברה של גן Her2 (שחור) ביחס לcentromere (אדום); C) ביטוי גבוה של החלבון (חום) והגברת גן Her2 ( ) ביחס שחור לcentromere (אדום). D) Chromogenic הכלאה באתר של HER2 מראה תעתיקי mRNA בודדים בסרטן שד ngTMA. E) אימונוהיסטוכימיה לCD8 בסרטן מעי גס. F) כתם אימונוהיסטוכימיה זוגי לסמן הפאן cytokeratin AE1 / AE3 (חום; תאי גידול) וCD68 (אדום;. מקרופאגים) הדגשת microenvironment גידול בסרטן מעי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">גס, אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית.

פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

a-next-generation-tissue-microarray-ngtma-protocol-for-biomarker

Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Views.  University of Bern.  הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית. 

Video: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

מבחן הלחץ החברתי טרייר פרוטוקול גרימת לחץ פסיכולוגי

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

קרנית התורם רקמות הכנה Keratoplasty האנדותל

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that cause tissue degeneration during ageing. Cancer, with incidence rates greatly increasing with age, is characterized by short telomere lengths and high telomerase activity. To study the roles of telomere dysfunction and telomerase reactivation in ageing and cancer, the protocol shows how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) and Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). The protocol describes the procedures to induce telomere dysfunction and reactivate telomerase activity in mTERT-ER and LSL-mTERT mice in vivo. The representative data show that reactivation of telomerase activity can ameliorate the tissue degenerative phenotypes induced by telomere dysfunction. In order to determine the impact of telomerase reactivation on tumorigenesis, we generated prostate tumor model G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L and thymic T-cell lymphoma model G4 Atm-/- mTERTER/ER. The representative data show that telomerase reactivation in the backdrop of genomic instability induced by telomere dysfunction can greatly enhance tumorigenesis. The protocol also describes the procedures used to isolate neural stem cells (NSCs) from mTERT-ER and LSL-mTERT mice and reactivate telomerase activity in NSCs in vitro. The representative data show that reactivation of telomerase can enhance the self-renewal capability and neurogenesis in vitro. Finally, the protocol describes the procedures for performing telomere FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) on both mouse FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) brain tissues and metaphase chromosomes of cultured cells.

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

פרוטוקול מפורט עבור ניטור זיעה באמצעות רומן, קטן, מכשיר אלחוטי

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

ניתוח מועיל אפקטים של תוספי תזונה על פונקציות מעיים אפיתל מכשול במהלך ניסיוני קוליטיס

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...