המחברים מודים לתוכנית H2020 של האיחוד האירופי (פרויקט GAIN4CROPS, GA מס' 862087). מרכז המצוינות AgroCropFuture Agroecology וגידולים חדשים באקלים עתידי ממומן על ידי משרד החינוך והמחקר, אסטוניה. ברצוננו להודות לפרופסור אוולין לויט-הארו על אספקת זרעים של T. aestivum ו-Z. mays, פאולה פלמט ו-Vaiko Vainola על עזרתם בהכנת חתכי עלים, ולז'ואאו פאולו דה סילבה סוזה על הסיוע בניתוח. כל התמונות התקבלו מיחידת המיקרוסקופ של האוניברסיטה האסטונית למדעי החיים תחת פרויקטים שונים.

1. תנאי גידול הצמח
<ol><li>בחר חיטה (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") ותירס (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") כצמחים מייצגים C3 ו- C4 , בהתאמה. לגדל את שני מיני הצמחים בתא גידול מבוקר סביבה מזרעים.</li>
	<li>שמור על לחות יחסית ב 55% עם טמפרטורת האוויר ב 25 °C / 18 °C (יום/לילה) עם תקופת אור 12 שעות. שמור על צפיפות שטף פוטונים פוטוסינתטי (Q) על פני השטח של הצמח ב 1200 μmol/m2/s כדי לייצג את תנאי הגידול הטבעיים שלהם. לגדל את כל הצמחים בריכוזCO2 סביבתי של 400 μmol/mol.</li>
	<li>השקו צמחיםכל יומיים במים מזוקקים ודישנו עם התמיסה של Hoagland 10 ימים לאחר הופעת השתילה. לגדל את הצמחים בתנאים הנתונים במשך 60 יום ולהשתמש עלים מורחבים לחלוטין לניתוחים מיקרוסקופיים.</li>
</ol>2. הכנה וצפייה בקטעים ביד חופשית
<ol><li>בחרו 3 עלים בוגרים שאינם מזדקנים מכל צמח ושמרו אותם במים מזוקקים. באמצעות סכין גילוח חד-צדדי חדש, בצע חיתוך פילוס אחד כדי ליצור זווית ישרה עם משטח העלה כדי להבטיח שהחתכים יהיו חתכים רוחביים המאונכים לפני השטח של העלה.</li>
	<li>הניחו את דגימת העלה על צלחת זכוכית על פיסת שעווה דנטלית כדי לייצב את הדגימה ולמנוע החלקה. חותכים על ידי הזזת הלהב ישר למטה על דגימת העלה כדי לחתוך בצורה נקייה דרך תאים. שמור את חתכי הרוחב במים מזוקקים.</li>
	<li>הרכיבו את הדגימות על מגלשת זכוכית על ידי הנחתן על טיפת מים וכיסוין בכיסוי זכוכית לצפייה והדמיה מיקרוסקופית. הימנעו מלכידת בועות אוויר.</li>
	<li>הצג את השקופית תחת מיקרוסקופ אור מורכב בהגדלה של 10x ו- 20x. שמור תמונות לפי מדריך התוכנה, יחד עם קנה המידה הרלוונטי.</li>
</ol>3. הכנת חלקים דקים למחצה
<ol><li>חתכו קטעים בגודל של כ-3X5 מ"מ מאזורים בין-קוסטליים לצד הצלע האמצעית מעלים של Z. mays ו-T. aestivum על צלחת זכוכית כמו בשלב 2.2. ודא שאורך החלק החתוך עובר לאורך גרגר העלה.</li>
	<li>מניחים את החומר הצמחי במזרק עם 1 מ"ל של חיץ קיבוע (4% אלדהיד גלוטרי בחיץ פוספט 0.1 M, pH = 6.9, טבלה 1).</li>
	<li>החזיקו את המזרק במאונך, הוציאו את האוויר, ובהחזקת אצבע על קצהו, שאבו את המזרק ליצירת ואקום. חזור על הפעולה עד שהדגימות שוכבות בתחתית המזרק, דבר המצביע על חדירה מוצלחת.</li>
	<li>העבירו את תכולת המזרק לבקבוקון זכוכית מסומן ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות לפני השלב הבא (טבלה 2).</li>
	<li>עבור כל בקבוקון, להסיר בעדינות את הקיבוע עם פיפטה ולהוסיף את חיץ פוספט עד הדגימה מכוסה. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה 3x.</li>
	<li>הסר את חיץ הפוספט עם פיפטה והוסף את האוסמיום טטרוקסיד (זהירות) עד לכיסוי הדגימה. דגימות וחומר אורגני אחר יהפכו שחורים. יש להשתמש בכפפות כפולות. להשאיר למשך שעה.</li>
	<li>הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם מים מזוקקים. השאירו למשך 30 דקות חזור על שלב זה 3 פעמים והשתמש בכפפות כפולות.</li>
	<li>הסר את התמיסה הקודמת עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 50/50 מים מזוקקים אתנול פתרון. להשאיר למשך 30 דקות. חזור על שלב זה עם תמיסות מים-אתנול מזוקקות בסדרות הבאות: 30/70, 20/80, 10/90 ו-2x ב-100% אתנול. דגימות בכל אחד מתמיסות אלה ניתן להשאיר לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>הסר את הפתרון הקודם עם פיפטה ולכסות את הדגימות עם 1/3 תמיסת שרף-אתנול. מניחים את הדגימות על צלחת מיקסר ומשאירים למשך שעתיים. חזור על שלב זה עם תמיסות שרף-אתנול בסדרות הבאות: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 ו-2x ב-100% שרף. דגימות בכל אחד מתמיסות אלה ניתן להשאיר לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>מכסים את החללים של תבנית הטבעה שטוחה (16 חללים, מידות חלל: 14 L x 4.8 W x 3 D (מ"מ)) בשרף 100% ומניחים את הדגימות בקצה אחד של החלל. הכינו תוויות נייר כתובות בעיפרון לכל דגימה והניחו אותן בקצה השני של החלל.</li>
	<li>מלאו לחלוטין את כל החללים ב-100% שרף ויישרו את הדגימות והתוויות אם הן זזו. מכסים את התבנית בסרט הטבעה ועושים פולימריזציה בתנור בהתאם להנחיות מוצר שרף אקרילי.</li>
	<li>הגדר את הבלוק הפולימרי עם הדגימה במחזיק הדגימה של האולטרה-מיקרוטום. חותכים את הבלוק באמצעות סכין זכוכית מחוספסת עד שהרקמה הופכת גלויה ועודף שרף מסולק.</li>
	<li>חותכים חלקים דקים למחצה לרוחב (1 מיקרומטר) באמצעות סכין זכוכית או יהלום. אספו את המקטעים באמצעות לולאת חיסון מתכתית מפני המים והניחו אותם על מגלשת זכוכית. יבשו את המגלשה על פלטה חמה (60°C) כדי לקבע את החלקים על הזכוכית.</li>
	<li>צובעים את החלקים הקבועים בכחול טולוידין (תמיסה מימית 1%) למשך 5 שניות לפני שטיפה במים מזוקקים ומייבשים שוב על הפלטה החשמלית. הערה: יש לוודא שתהליך הקיבוע הכימי מתבצע תחת מכסה אדים. יש להחליף סכיני זכוכית מעת לעת כדי להבטיח חתכים חדים המאפשרים חתכים ללא קרעים או עיוותים.</li>
</ol>4. הדמיה של דגימות
<ol><li>הדמיה של קטעי עלים טריים<ol><li>הגדר את מיקרוסקופ האור המורכב עם התוכנה הנלווית בהתאם למדריך.</li>
		<li>הניחו את מגלשת הזכוכית על הבמה. התאם את העינית והצג את המקטע ב- 10x כדי לקבל סקירה, ולאחר מכן ביעדים של 20x ו- 40x.</li>
		<li>בכל מטרה, נווט בערוץ החי, התמקד בתחום העניין ואתר את תאי מעטפת הצרור סביב הווריד.</li>
		<li>לאחר ההתמקדות, לחץ על לחצן הקפא והוסף את קנה המידה על-ידי לחיצה על לחצן סרגל קנה המידה בכרטיסיה כלים. שמור את התמונה ב- . פורמט TIF לניתוח תמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה של חתכים שחדרו לשרף<ol><li>הגדר את מיקרוסקופ האור האוטומטי בקשר עם התוכנה הנלווית במחשב.</li>
		<li>טען את הערוץ השקוף והנח את השקופית על במת המיקרוסקופ. התמקד במקטע באמצעות הגדלה אובייקטיבית של 40x וכוונן את הבהירות כדי להבטיח שכל מבני התאים גלויים.</li>
		<li>הגדר את אזור המיקום של המקטע באמצעות פונקציית הנווט כדי לוודא שהמקטע כולו מצולם ולחץ על הלחצן תפר .</li>
		<li>לחץ על סיום ולאחר מכן על התחל כדי לאפשר למיקרוסקופ לצלם את המקטע כולו. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ופתח את האריחים שצולמו במיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות התכונה 'יישור', ודא שהאריחים אינם חופפים. לאחר יצירת התמונה, התאם את המיקום, הבהירות והסיבוב באמצעות הכרטיסייה התאמה.</li>
		<li>הדפס את קנה המידה על התמונה לפני השמירה ב- . פורמט TIF.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידות אנטומיות באמצעות תוכנת ImageJ<ol><li>פתח את תוכנת ImageJ וטען את התמונה על ידי גרירתה לחלון.</li>
		<li>בעזרת הכלי קו, כיילו את קנה המידה באופן הבא: ציירו קו מעל סרגל קנה המידה, בחרו 'נתח' >'קבע קנה מידה', שנו את המרחק הידוע לאורך סרגל קנה המידה ושנו את יחידת האורך ליחידה הנכונה.</li>
		<li>מדוד את התכונה הפוטנציאלית על-ידי בחירה בכלי קו, ציור קו לרוחב אזור העניין והקשה על מקש M .</li>
		<li>למדידות שטח, בחרו בכלי בחירת מצולע וציירו מסביב לרקמה המעניינת. סיים בלחיצה על מקש M . המדידות מופיעות כחלון מוקפץ, שניתן להעתיק לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נתונים נוסף.</li>
	</ol></li>
</ol>

אנליזה מיקרוסקופית לשיפור יעילות פוטוסינתטית בגידולי C4

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

במאמר זה נדון הן בשיטות הכמותיות והן בשיטות האיכותיות למדידת אנטומיה של עלים ובדרכים שבהן ניתן לייעל אותן. יתר על כן, המתודולוגיה מיושמת על מיני יבולים מייצגים כדי לקבוע אילו תכונות אנטומיות הן השימושיות ביותר בהבחנה בין חתכי C3 ו- C4 . הבנת תכונות אלה חיונית ככל שמינים היברידיים...

פוטוסינתזה היא תהליך בסיסי שבו אנרגיית האור מומרת לאנרגיה כימית, ומשמשת כאבן הפינה של רשתות טרופיות יבשתיות. רוב הצמחים עוקבים אחר מסלול C3 של פוטוסינתזה, שבו המוצר הפוטוסינתטי העיקרי הוא תרכובת שלושת הפחמן גליצראט 3-פוספט. פוטוסינתזה C3 התפתחה לפני יותר מ-2 מיליארד שנה באטמוספירה השופעתCO2 ונמוכה ב-O21. האנזים הפוטוסינתטי העיקרי ריבולוז 1,5 ביספוספט קרבוקסילאז/אוקסיגנאז (רוביסקו), שהתפתח בתנאים אלה, אינו אופטימלי לתנאי CO2 גבוהים O2 הנוכחיים מכיוון שהוא מגיב באופן תחרותי עם O2, ומתחיל פוטו-נשימה2. פוטו-נשימה היא מסלול בזבזני שצורך אנרגיה במקום לייצר אותה ולשחררCO2 כתוצר לוואי. כתוצאה מכך, חיוני לשמור על ריכוז CO2 גבוה סביב רוביסקו בכלורופלסטים כדי למנוע חמצון 3,4. בשל חוסר היכולת של צמחי C3 לרכז CO2, יש משיכה משמעותית של CO2 מאוויר הסביבה לכלורופלסטים, מה שמרסן את הפוטוסינתזה ומשפיע על צמיחת הצמחים וייצור ביומסה 2,5,6.
בצמחי C3, הפוטוסינתזה מוגבלת על ידי כניסתCO2 דרך פיוניות, דיפוזיה שלו דרך מזופיל, והפעילות הביוכימית של אנזימים פוטוסינתטיים. כניסתCO2 מוגבלת תחילה על ידי מוליכות סטומטלית, הנשלטת על ידי תנאים סביבתיים כגון טמפרטורת אוויר ולחות. לאחר מכןCO2 מתפזר דרך הפאזה הגזית והנוזלית הפנימית של העלה לרוביסקו7. בצמחי C3, כל שלבי הפוטוסינתזה מתרחשים בכלורופלסטים של תאי מזופיל, וצמחים צריכים לשמור על זרימה קבועה שלCO2 מהאטמוספרה לכלורופלסטים. התלות של זמינותCO2 בכלורופלסטים בפתיחות סטומטלית, ארכיטקטורת מזופיל ומאפיינים בודדים של תאים וכלורופלסטים מותירה צמחים רגישים לאילוצים סביבתיים שבסופו של דבר משפיעים על הפוטוסינתזה, כמו זמינות מים נמוכה וטמפרטורות גבוהות 7,8,9,10, במיוחד מדגישות את פגיעותם לתנאי שינוי האקלים 11.
בהתחשב באתגרים שמציב חוסר היעילות של מסלול C3, כמו גם מגבלות בשמירה על רמות CO2 אופטימליות ורגישות לגורמים סביבתיים, בצמחים מסוימים, התפתח מסלול אחר, מסלול פוטוסינתזה C4. באופן אופייני, לצמחי C4 יש שני מסלולים ביוכימיים מופרדים מרחבית; קיבועCO2 הראשוני מתרחש בתאי מזופיל על ידי פוספונולפירובט קרבוקסילאז, שיש לו זיקה גבוהה יותר ל-CO2 מאשר רוביסקו וגם חסר פעילות חמצון. תוצר C4 שנוצר מועבר עוד יותר לתאי מעטפת צרור, שם הוא עובר דה-קרבוקסילציה, ו-CO2 משתחרר שוב ומקובע על ידי רוביסקו (C3 פוטוסינתזה)12,13,14. הזיקה הגדולה יותר של PEP carboxylase ל-CO2 ודפנות תאים עבות של תאי מעטפת צרור מאפשרת ריכוזCO2 בתאי מעטפת צרור, ולכן, צמחי C4 ממזערים את הפוטו-נשימה על ידי הפרדה מרחבית של קיבוע CO2 ומחזור קלווין. אימוץ מסלול C4 מציג את התגובה האדפטיבית של הטבע לאילוצים סביבתיים, ומציע תובנות לגבי אסטרטגיות אפשריות לשיפור פריון היבול ועמידותו בתנאי אקלים משתנים15.
האנטומיה המיוחדת של מבנה העלה בצמחי C4 מאופיינת בורידים המוקפים בתאי מעטפת צרור וסקולריים מוגדלים המכילים כלורופלסטים ובסידור רדיאלי של תאי מזופיל בטבעת חיצונית המעוצבת סביב תאי מעטפת צרור. תאי המזופיל נמצאים בסמיכות לתאי מעטפת הצרור, מה שמאפשר מעבר מהיר ורציף של מטבוליטים בין שני סוגי התאים. סידור התא אופייני לצמחי C4 ומכונה אנטומיה16 של קרנץ. במינים מסוג C3, ההתמחות והנטייה של תאי מזופיל יכולות להשתנות, אך תאי מעטפת צרור קטנים יותר באופן מובהק ויש בהם מעט כלורופלסטים או ללא כלורופלסטים כלל. אנטומיה ספציפית של Kranz מאפשרת ריכוזCO2 בכלורופלסטים בתאי מעטפת צרור שבהם נמצא האנזים C 3-carboxylating Rubisco ומעכבת למעשה את הנשימה הפוטו-רספירטיבית 4,17,18. למרות הסידור המורכב לכאורה, שינויים אלה התרחשו באופן עצמאי מספר פעמים באבולוציה של אנגיוספרם, מה שמצביע על כך שמדובר במסלול אבולוציוני אפשרי יחסית 19,20,21, וטקסות שונות הוכחו כנמצאות בשלב ביניים בין מטבוליזם פחמן C3 ו- C 4, המכונה C3-C 4 או C2, בעל יכולות ריכוז והטמעה מחדש של CO2 22,23,24,25.
צמחי C4 רבים הם גידולים בעלי חשיבות כלכלית גבוהה, והנדסה גנטית של גידולי C3, כמו אורז, כדי לשפר את החוסן האקלימי שלהם ולהבטיח את היבול הייתה נושא מעניין בעשורים האחרונים26,27. עם זאת, מאמצי ההנדסה דורשים הבנה מפורטת של האנטומיה המיוחדת של C4 וכיצד היא שולטת בפוטוסינתזה 2,28.
ביסוס האנטומיה של C4 Kranz הוא תנאי מוקדם להשגת היעד השאפתני של הנדסת פוטוסינתזה C4 לתוך C3 גידולים25. עם זאת, ההבנה הנוכחית של ויסות האנטומיה של קרנץ ושיטות לסינון מהיר של תכונותיו האנטומיות העיקריות מוגבלת, מה שמקשה על זיהוי מינים היברידיים. מחקרים קודמים הראו כי תכונות מפתח המווסתות את היעילות הפוטוסינתטית בצמחי C3 ו- C4 כוללות את המרחק הבין-ורידי, קוטר קומפלקס מעטפת הצרור וגודל תאי מעטפת הצרור14,29. ניתן לסנן תכונות אלה בקלות באמצעות חתכים חופשיים ולנתח כמותית באמצעות חתכים דקים למחצה. במאמר זה נתאר את שיטת הערכת התכונות המאפשרות אבחון התמיינות אנטומית C3 ו-C4 באמצעות מיקרוסקופ הצלבה ואור ביד חופשית, כלומר אזור מעטפת הצרור, המרחק הבין-ורידי ותדירות הוורידים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td>
			<td>ACLAR, US</td>
			<td>10501-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td>
			<td>Chem-Lab NV, BE</td>
			<td>CL00.0505.1000</td>
			<td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td>
			<td>PELCO, US</td>
			<td>10501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial 2 ml</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>548-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>23H2856331</td>
			<td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo diamond knife</td>
			<td>Diatome, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA EM UC7</td>
			<td>Leica Vienna, AT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin hard grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, US</td>
			<td>14383</td>
			<td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Normax, PT</td>
			<td>5470308A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td>
			<td>Nikon Corporation, JP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Agar Scientific Ltd, GB</td>
			<td>R1019</td>
			<td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific, FI</td>
			<td>KJ16047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 ml</td>
			<td>Ecoject, DE</td>
			<td>20010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue, general purpose grade</td>
			<td>Fisher Scientific, GB</td>
			<td>2045836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

היעילות המשופרת של פוטוסינתזה C4 , בהשוואה למנגנון C3 , נובעת מיכולתו לרכזCO2 בתאי מעטפת צרור. היעילות של פוטוסינתזה C4 ויעילות השימוש הפנימי במים קשורות ישירות לחלקם של תאי עלי מזופיל וצרור, גודל וצפיפות של נדן צרור, וגודל, צפיפות ועובי דופן התא של תאי מעטפת צרור. ניתוח מיקרוסקופי מהיר של תכונות אלה יכול להתבצע על מקטעים חופשיים ודקים למחצה באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונלי, ומספק מידע רב ערך על יעילות פוטוסינתטית בגידולי C4 באמצעות זיהוי ובחינה של סוגי תאים ספציפיים. בנוסף, מוצגות טעויות בהכנת חתך חופשי וחצי דק המשפיעות על מדידות אנטומיות ואבחנות סוג התא, כמו גם כיצד להימנע משגיאות אלה. גישה מיקרוסקופית זו מציעה אמצעי יעיל לאיסוף תובנות על הסתגלות פוטוסינתטית לשונות סביבתית ומסייעת בסינון מהיר של יבולים לאקלים עתידי.

Photosynthesis is a fundamental process where light energy is converted into chemical energy, serving as the cornerstone of terrestrial trophic networks. The majority of plants follow the C3 pathway of photosynthesis, where the primary photosynthetic product is the three-carbon compound glycerate 3-phosphate. C3 photosynthesis evolved over 2 billion years ago in the atmosphere abundant in CO2 and low in O21. The key photosynthetic enzyme ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which evolved under these conditions, is suboptimal for current low CO2 high O2 conditions as it competitively reacts with O2, initiating photorespiration2. Photorespiration is a wasteful pathway that consumes energy instead of producing it and releasing CO2 as a byproduct. Consequently, it is crucial to maintain high CO2 concentration around Rubisco in chloroplasts to prevent oxygenation3,4. Due to the inability of C3 plants to concentrate CO2, there is a significant CO2 drawdown from ambient air to chloroplasts, curbing photosynthesis and affecting plant growth and biomass production2,5,6.
In C3 plants, photosynthesis is limited by the entrance of CO2 through stomata, its diffusion through the mesophyll, and the biochemical activity of photosynthetic enzymes. The entry of CO2 is first limited by stomatal conductance, which is controlled by environmental conditions such as air temperature and humidity. Then CO2 diffuses through the leaf&#39;s internal gaseous and liquid phase to Rubisco7. In C3 plants, all stages of photosynthesis occur in the chloroplasts of mesophyll cells, and plants need to maintain a constant influx of CO2 from the atmosphere into chloroplasts. The dependence of CO2 availability in chloroplasts on stomatal openness, mesophyll architecture, and individual cell and chloroplast characteristics leaves plants susceptible to environmental constraints that eventually affect photosynthesis, like low water availability and high temperatures7,8,9,10, particularly highlighting their vulnerability to climate change conditions11.
Given the challenges posed by the inefficiencies of the C3 pathway, as well as limitations in maintaining optimal CO2 levels and susceptibility to environmental factors, in certain plants, another pathway, the C4 photosynthesis pathway, has evolved. Characteristically, C4 plants have two spatially separated biochemical pathways; the initial CO2 fixation occurs in mesophyll cells by phosphoenolpyruvate carboxylase, which has a higher affinity for CO2 than Rubisco and also lacks oxygenation activity. The formed C4 product is further transported to bundle sheath cells, where it is decarboxylated, and CO2 is again released and fixed by Rubisco (C3 photosynthesis)12,13,14. The greater affinity of PEP carboxylase to CO2 and thick cell walls of bundle sheath cells allows CO2 concentration in bundle sheath cells, and thus, C4 plants minimize the photorespiration by spatially segregating CO2 fixation and the Calvin cycle. The adoption of the C4 pathway showcases nature&#39;s adaptive response to environmental constraints, offering insights into potential strategies for improving crop productivity and resilience in changing climate conditions15.
The specialized anatomy of the leaf structure in C4 plants is characterized by veins surrounded by enlarged vascular bundle sheath cells containing chloroplasts and with a radial arrangement of mesophyll cells in an outer ring patterning around bundle sheath cells. The mesophyll cells are in close proximity to the bundle sheath cells, which enables a rapid and continuous transport of metabolites between the two cell types. This cell&#39;s arrangement is typical of C4 plants and is referred to as Kranz anatomy16. In C3 species, mesophyll cell specialization and disposition can vary, but bundle sheath cells are distinctly smaller and have a few chloroplasts or no chloroplasts at all. Specific Kranz anatomy allows concentrating CO2 in chloroplasts in bundle sheath cells where the C3-carboxylating enzyme Rubisco is located, effectively hindering photorespiration4, 17, 18. Despite its seemingly complex arrangement, these changes have occurred independently multiple times in the evolution of angiosperms, indicating that it is a relatively feasible evolutionary pathway19,20,21, and various taxa have been shown to be at an intermediate stage between C3 and C4 carbon metabolism, referred to as C3-C4 or C2, having abilities to concentrate and re-assimilate CO222,23,24,25.
Many C4 plants are crops with high economic importance, and genetically engineering C3 crops, like rice, to improve their climate resilience and secure the yield has been a topic of interest in the last decades26,27. However, the engineering efforts call for a detailed understanding of C4 specialized anatomy and how it controls photosynthesis2,28.
Establishing the C4 Kranz anatomy is a prerequisite to achieving the ambitious goal of engineering C4 photosynthesis into C3 crops25. However, the current understanding of the regulation of Kranz anatomy and methods for quickly screening its key anatomical traits is limited, making it difficult to identify hybrid species. Previous studies have shown that key traits regulating photosynthetic efficiency in C3 and C4 plants include the interveinal distance, the diameter of the bundle sheath complex, and the size of bundle sheath cells14,29. These traits can be easily screened using free-hand sections and quantitatively analyzed using semi-thin sections. Here, we describe the method of assessing the traits that allow for C3 and C4 anatomical differentiation diagnostics through free-hand cross and light microscopy, namely bundle sheath area, interveinal distance, and vein frequency.

מחבר זרקור: גישות חדשניות להבנת יחסי מבנה-תפקוד של צמחים עבור גידולים עמידים לאקלים

הערכת תכונות מבניות ב- Triticum aestivum ו - Zea mays עבור התמיינות פוטוסינתטית C3 ו- C4 באמצעות חתכים חופשיים ודקים למחצה

Our research focuses on plant structure, function relationships. We aim to better understand the limitations to photosynthesis across plant functional types and how they can be improved for climate-resilient crops. New technology and software are expensive and often inaccessible, which requires a degree of trial and innovation to accomplish the same resolutions in imaging different plant functional types.The identification of anatomical structures that differentiate C3 and C4 leaves, particularly in as well as troubleshooting the preparative steps for microscopy.

איור 1A מראה את הכיוון הנכון לחיתוך העלה הן עבור חתך טרי והן עבור מיקרוסקופ אור. את השיטה לחיתוך מקטעים טריים באמצעות סכין גילוח חד-צדדי ויריעת שעווה דנטלית ניתן לראות באיור 1B. המקטעים המתקבלים מוצגים באיור 1C.
איור 2...

הערכת ההבדלים האנטומיים בין חתכי העלים C3 ו- C4 מסייעת להבין את יעילות הפוטוסינתזה. מאמר זה מתאר הכנה ובדיקה של חתכי עלים חופשיים ודקים למחצה, יחד עם האזהרות בהכנה למיני היבול Triticum aestivum ו-Zea mays.

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

522 Views.  Estonian University of Life Sciences. המחקר שלנו מתמקד במבנה הצמח, יחסי תפקוד. אנו שואפים להבין טוב יותר את מגבלות הפוטוסינתזה בין סוגי צמחים פונקציונליים וכיצד ניתן לשפר אותן עבור גידולים עמידים לאקלים. טכנולוגיה ותוכנה חדשות הן יקרות ולעתים קרובות אינן נגישות, מה שדורש מידה של ניסוי וחדשנו...

Video: מחבר זרקור: גישות חדשניות להבנת יחסי מבנה-תפקוד של צמחים עבור גידולים עמידים לאקלים

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The effectiveness of C4 photosynthesis and intrinsic water use efficiency are directly linked to the share of mesophyll and bundle leaf cells,&#160;size and density of bundle sheaths, and size, density, and cell wall thickness of bundle sheath cells. Rapid microscopical analysis of these traits can be performed on free-hand and semi-thin sections using conventional light microscopy, providing valuable information about photosynthetic efficiency in C4 crops by means of identifying and examining specific cell types. Additionally, errors in freehand and semi-thin section preparation that affect anatomical measurements and cell type diagnoses are shown, as well as how to avoid these errors. This microscopical approach offers an efficient means of gathering insights into photosynthetic acclimation to environmental variation and aids in the rapid screening of crops for future climates.

Assessing the anatomical differences between C3 and C4 leaf cross sections helps understand photosynthesis efficiency. This paper describes free-hand and semi-thin leaf cross sections preparation and examination, along with the caveats in the preparation for the crop species Triticum aestivum and Zea mays.

Preparation and Imaging of Free-Hand Leaf Sections for Assessing the Anatomical Differences Between C3 and C4 Leaf

To begin, grow wheat and maize plant species in an environment controlled growth chamber. Select three mature non-senescent leaves from the wheat plant and keep them in distilled water. Then place the leaf specimen on a glass plate on a piece of dental wax to stabilize the sample and avoid slipping.Move the blade straight down on the leaf specimen to cut cleanly through cells, and keep the cross sections in distilled water. To mount the samples on a glass slide, place them on a water droplet and cover them with a glass cover slip for microscopic imaging. Now view the slide under a compound light microscope at 10X and 20X magnification.Save images as per the software guide along with the relevant scale. Freehand sections of leaves from the C3 plant Triticum aestivum and the C4 plant Zm Maize revealed that maize's bundle sheath cells are rounder and greener, indicating a higher chloroplast presence.

הכנה והדמיה של קטעי עלה ביד חופשית להערכת ההבדלים האנטומיים בין עלה C3 לעלהC 4

Preparation of Semi-Thin Leaf Sections to Understand Photosynthesis Efficiency Based on Anatomical Differences

Begin by cutting sections from intercostal areas alongside the midrib of leaves from Triticum aestivum on a glass plate. Ensure that the length of the cut section runs along the grain of the leaf. Then place the plant material in a syringe with one milliliter of fixation buffer.Hold the syringe vertically. Remove the air and pump the syringe to create a vacuum holding a finger on the tip. After performing the complete infiltration protocol, as per the resin manufacturer's instructions, cover the cavities of a flat embedding mold with 100%resin, and place the samples on one end of the cavity.Prepare pencil written paper labels for each sample and place them on the other end of the cavity. Straighten the samples and labels if they moved. Cover the mold with the embedding film and polymerize in an oven as per acrylic resin product guidelines.Then set the polymerized block with the sample in the ultra microtome specimen holder. Using a rough glass knife, trim the block until the tissue becomes visible and excess resin is eliminated. Next, using a glass or diamond knife cuts semi thin sections transversely.With a metal inoculation loop, collect the sections from the water surface and place them on a glass slide. Dry the slide on a hot plate to fix the sections onto the glass. Stain the fixed sections with toluidine blue for five seconds.Semi thin cross sections of Triticum aestivum and Zea mays showed that all leaf tissues were visible and measurable. Zea mays exhibited crans anatomy with mesophyll cells around veins and chloroplast-filled bundle sheaths facilitating rapid metabolite exchange.

הכנת חתכי עלים דקים למחצה להבנת יעילות הפוטוסינתזה על בסיס הבדלים אנטומיים

Imaging Resin-Infiltrated Leaf Sections for Understanding Anatomical Differences Between Triticum aestivum and Zea mays

After staining the Triticum aestivum leaf section with toluidine blue, place the slide on the microscope stage. Using a 40x objective magnification, focus on the section and adjust the brightness to ensure all cell structures are visible. Then use the navigator function to set the sections location area to ensure the entire section is imaged, then click the stitch button.After that, click done and run to allow the microscope to image the entire section. Open the image analysis software and the tiles taken by the microscope. Using the align feature, ensure that the tiles do not overlap.After generating the image, adjust the positioning, brightness, and rotation using the adjust tab. Then print the scale on the image before saving it in TIF format. Open ImageJ software and drag the image into the window to load it.Using the line tool, draw a line over the scale bar. Choose analyze and click set scale. Change the known distance to the scale bar's length and the unit of length to the correct unit.To measure the prospective trait, select the line tool, draw a line across the area of interest and press the M key. For area measurements, use the polygon selection tool to outline the tissue of interest. Then press the M key to conclude.A pop-up window displaying the measurements will appear, which can be copied to a spreadsheet for further data analysis. Box plots illustrated significant anatomical differences between Triticum aestivum and ZMAs, particularly in interveinal distances, bundle sheath diameter, the fraction of bundle sheath cells, non-photo synthetic material, and vein frequency reflecting expected C3 and C4 leaf anatomy distinctions.