שפעת חיסונית עקיפה מאפשרת לזהות חלבונים לתיקון דנ"א, תמונות של גיוס מרחבי וזמן והיא מסייעת לחקור אינטראקציות פרוטאין-פרוטאין באתר של נזק לדנ"א. בעקבות נזק לדנ"א, חלבונים לתיקון דנ"א מגויסים לעלבון הדנ"א בזמן שהריכוז שלהם עולה באופן מקומי, והם יוצרים קבוצות הנקראות מוקדים שניתן לדמיין על ידי כשל חיסוני עקיף על דגימות קבועות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוקדי חלבון, כמו גם לכמת קולוקליזציה של ההווה בתאים.
זה יכול לעזור להסביר את רצף האירועים הנדרשים להיווצרות מורכבת ולתיקון DNA. אינטראקציות חלבון פרוטאין מסוימות יכולות להיות כרוכות בניסויים כאלה. הדגמת ההליך תהיה ברברה דה לה פנה, תמונה פוסטדוק מוכשר מאוד מהמעבדה שלי בגין על ידי גידול 40, 000 תאי HeLa בכל גם מעל 12 צלחת גם עם כיסוי זכוכית עגול 18 מילימטר ל 80% confluency.
לאחר חשיפת התאים לארבעה הקרנה גמא אפורה, לשטוף אותם פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן להסיר את PBS לחלוטין ולהוסיף 200 microliters של NDB לכל באר. דגירה התאים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר את NDB.
זכור כי זמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם לקו התא, אבל בדרך כלל לא יעלה על שתי דקות. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן להסיר את PBS לחלוטין ולהוסיף 200 microliters של 4%PFA לכל באר עבור קיבוע התא.
דגירה התאים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את PFA ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS לכל באר. הסר PBS לחלוטין ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של פתרון חסימה לכל באר דגירה התאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
מדללים את מאגר הנוגדנים והדילול העיקרי ומערבבים אותו עד שהוא מעורבב היטב בתיבת לחות וכאן חתיכת פרפילם ומוסיפים 10 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני בירידה אחת. ליישר קצה אחד של כיסוי מן באר עם טיפה לאט להוריד אותו על parafilm להפיץ את הנוזל. הדגירה את הכיסויים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים PBS במשך דקה אחת לכל לשטוף. מדללים את מאגר הנוגדנים והדילול המשני ואת המערבולת עד לערבב היטב להחיל 10 microliters של נוגדן משני על כל coverslip כפי שתואר קודם לכן דגירה זה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם PBS ופעם אחת עם מים במשך דקה אחת לכל לשטוף.
לאחר מכן הרם אותם על מגלשות זכוכית עם מדיית הרכבה מבוססת גליצרול המכילה מחליק כיסוי חותם DAPI עם לק שקוף ולתת להם להתייבש במשך 20 דקות. מניחים טיפה של שמן טבילה על עדשת המטרה 60 x ולהשתמש DAPI כדי לאתר את הגרעינים דרך העין עבור רכישת תמונה XYZ, לפתוח את תוכנת הרכישה ולהגדיר את סוג הסורק כמו galvano סוג הסורק כמו הלוך ו 512 על ידי 512 גודל התמונה. בחלונית PMT מוגדר מצב לממוצע VBM למסגרת וסריקה רציפה לקו.
לאחר מכן, גלאי הצבע והחום קבעו את ערוץ 1 ל-DAPI ו-SD 1, ערוץ 2 לאלכספלור 488 ו-HSD 3, וערוץ 3 לאלכספלור ב-647 ו-HSD ארבעה בוחרים ב-Z.To מתאימים את התמונה החיה, לוחצים על הכפתור החי בחלון החי ומתאימים את המוקד. לאחר מכן השתמשו בחלון הכלי PMT להגדרה של רגישות לעוצמת לייזר, רווח והיסט לערימות z, בחרו 'התחלה-סיום' ו'15 פרוסות'. בחר את התיקיה לשמירת תמונות ולחץ על לחצן התחל של LSM כדי להתחיל ברכישה.
לאחר שתסיים, לחץ על לחצן סיום הסדרה כדי להשלים את רכישת התמונה. פתח את תוכנת הניתוח ולאחר מכן לחץ על חלון כלי האצווה ובחר את התמונות לניתוח. עבור אל חלון כלי הניתוח ובחר הקרנה, שתוצג הקרנה בעוצמה מרבית מ- 15 פרוסות.
תחת הגדרת פלט הקלט, בחר את תיקיית האצווה והפלט שנוצרה. לחץ על תהליך לעיבוד תמונות וייצוא התמונות כקבצי TIFF. בצע כימות גרעיני עם cellprofiler על פי הוראות כתב היד.
תאים שלא טופלו עם הקרינה התערוכה מעט מאוד גמא H2AX סימן אקספו. בהיעדר חלבונים חיוניים לתיקון DNA, הצטברות גמא H2AX ניתן לראות בהפסקות DNA. הצטברות של הפסקות לא מפוספרות יכולה להוביל תאים להיות טרום היפוטוני מסומן על ידי גרעיני גמא H2AX מוצק.
לאחר הקרנה, גרעינים מציגים מספר רב של הפסקות תקועות כפולות שאליהן גאמא H2AX לוקליזציה היא מהירה מאוד. בעוד שמעטים אם נצפו מוקדים בהיעדר קרינה, מספר המוקדים כומת באחת שתיים וארבע ו-16 שעות לאחר קרינה ולבקרת קרינת ה-NOA. בהתאם לשאלה הביולוגית שהועלתה ולסוג הנתונים הנדרשים, אפשרויות התוויה שונות צריכות להיחשב קולוקליזציה ניתן לחקור על ידי נוגדנים ראשוניים multiplexing גדל במין בעלי חיים שונים באמצעות נוגדנים משניים, מסומנים עם פלואורופורים ברורים.
סופרפוזיציה של ירוק ואדום, מעוררת נקודות חמות צהובות, שני חלבונים מעניינים נמצאים באותם פיקסלים. ניתוח כמותי של קולוקליזציה יכול להיות מושגת על ידי גישה מבוססת אובייקט או על ידי גישה סטטיסטית המבצעת ניתוחים מבוססי מקדם מתאם אינטנסיביות. שילוב של נוגדנים ראשוניים שגדלו במין בעלי חיים שונים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה.
ודאו שהנוגדנים תואמים ולא יפריעו זה לזה. אתה צריך להגדיר כראוי את הנוגדן המשני לשמש נגד כל אחד הנוגדנים העיקריים ולשקול חפיפה ספקטרלית מסוימת בעת בחירת פחות כוח לשימוש. קולוקליזציה או חלבונים מצביעים על אינטראקציות ישירות אפשריות.
זה יכול להיות מאומת על ידי משקעים פרטניים בתאים, או על ידי ירידה ישירה באמצעות חלבונים מטוהרים במבחנה.
