ברצוננו להודות למכון הלאומי להזדקנות (K99/R00 AG055683 ל-JMR), למכון ג'ורג' ואן ריאן למדעי המוח (EP, GC, JMR), למכללה לרוקחות באוניברסיטת רוד איילנד (EP, GC, JMR) ול-Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). אנו מודים לדוקטורנטית רבקה סנפט, בהכשרתה עם פרופ' סוזן דימצקי, המחלקה לגנטיקה, בית הספר לרפואה של הרווארד, על שהכירה לנו את שיטת הציפה החופשית. חלק מהתמונות ששימשו באיור 1 התקבלו ממקורות "חופשיים לשימוש, לשיתוף או לשינוי, אפילו מסחריים": עכבר ושפופרת מיקרוצנטריפוגה (Pixabay), מוח עכבר (Jonas Töle, Wikimedia Commons), אזור מוח קריוסטט ועכבר (מרכז DataBase למדעי החיים, ויקישיתוף), מיכל זכוכית (OpenClipart, FreeSvg.org) ומיקרוסקופ (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. הכנת רקמות להקפאה
<ol><li>הטמיעו רקמות קבועות בתבנית הטבעה מתאימה (ראו טבלת חומרים) ליצירת גוש דגימה באמצעות מטריצת דגימות מתאימה (ראו טבלת חומרים) והקפיאו על קרח יבש. אחסנו את גושי הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לחתוך. הערה: רקמות קבועות מוכנות בדרך כלל על ידי ניקוב מכרסמים בוגרים (בני 2.5 עד 30 חודשים) זכרים או נקבות (עכבר או חולדה)34, בהתאם להיתר אתי זמין, עם קיבוע מתאים (למשל 10% פורמלין), ואחריו רקמות לאחר קיבוע באותו קיבוע במשך 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, שטיפת רקמות שלוש פעמים עם PBS 1x, והנחת רקמות ב-15% ולאחר מכן 30% סוכרוז ב-1x PBS למשך הלילה או עד שהרקמות שוקעות35. חוקרים עשויים לנסות להתאים את הפרוטוקול הכללי הזה לשלבי התפתחות שונים.</li>
</ol>2. Cryosectioning
<ol><li>כאשר מוכנים לחתך, אקלום דגימות בהקפאה לפחות 1-2 שעות לפני החתך כדי למנוע ריסוק של רקמה.</li>
	<li>בעזרת הקפאה, חותכים רקמות למקטעים (20-50 מיקרומטר) ואוספים פנימה 6 או 12 תוספות באר (ראה טבלת חומרים) מלאות בתמיסת PBS אחת. הערה: בהתאם לעובי המקטע, כמות הרקמה שיש לאסוף ומספר תוספות הבאר בהן נעשה שימוש, כל באר תכיל מספר משתנה של חתכים המשתרעים על פני כ-10 עד 40 פרוסות לבאר. לדוגמה, אם מוח שלם נחתך ב-40 מיקרומטר, ייאספו כ-18-24 מקטעים בכל באר באמצעות תוספות של 12 בארות. כמו כן, חתכים של 20 מיקרומטר יכולים להיות מעט מאתגרים לטיפול, ולכן 40 מיקרומטר מומלץ לצביעה בתפזורת (ראה דיון).</li>
</ol>3. אחסון חלקים
<ol><li>לאחר האיסוף, לשטוף את החלקים עם 1x PBS מוכן טרי במשך 5 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.</li>
	<li>מעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל מלאים בתמיסת אחסון של 1-1.5 מ"ל (עבור 250 מ"ל, מערבבים 70 גרם סוכרוז, 75 מ"ל אתילן גליקול, ומביאים לנפח עם חיץ פוספט 0.1 M).</li>
	<li>יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד להכנה לצביעה.</li>
</ol>4. יום הכתמה I
<ol><li>מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומאזנים אותן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 - 20 דקות.</li>
	<li>יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד פתרון אחסון מקטעים.</li>
	<li>העבירו את הכנסת הבאר לבאר אחרת המכילה כ-6 מ"ל של 1x TBS. שטפו 3 פעמים עם 1x TBS במשך 5 דקות כל אחת בשייקר מסלול במהירות נמוכה ב-RT.</li>
	<li>בזמן שהמקטעים שוטפים, הכינו 7 מ"ל (לדגימה) של תמיסה חודרת-חוסמת המורכבת מ-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-3% סרום רגיל (למשל, נסיוב סוסים רגיל). חסום קטעים למשך 30 דקות ב- RT בשייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה. הערה: חסימה באמצעות סרה מונעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לרקמות או קולטני Fc לא ספציפיים – מומלץ להשתמש בסרום התואם את מין הנוגדן המשני, אך אם אינו זמין, ניתן להשתמש בכל סרום רגיל ממין שונה מהחיה המארחת של הנוגדנים הראשוניים. חומר הניקוי Triton X-100 מאפשר חדירת נוגדנים טובה יותר על ידי חדירת הרקמה.</li>
	<li>הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים ראשונית המורכבת מנוגדנים ראשוניים נבחרים (מדוללים כראוי) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (ראו שלב 4.4 הערה). מעבירים קטעים מבאר מוכנסים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להיקשר לאנטיגן(ים) המעניין. הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים (שנוצרו במינים מארחים שונים).</li>
	<li>מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל עם חלקים על מיקסר מסתובב במהירות נמוכה (למשל, מהירות 7 סל"ד) ודגרים למשך לילה במשך 12-16 שעות ב-4°C.</li>
</ol>5. יום הצביעה II
<ol><li>למחרת, יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים ראשונית. הערה: ניתן לאסוף תמיסת נוגדנים ולעשות בה שימוש חוזר; הוסף 0.02% (w/v) נתרן אזיד כדי לעכב צמיחה מיקרוביאלית.</li>
	<li>יש לכבס את המקטעים 3 פעמים עם 1x TBS ב-RT (30 שניות עבור 2 השטיפות הראשונות ו-10 דקות עבור השטיפה הסופית).</li>
	<li>הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים משנית המורכבת מנוגדן משני מתאים (מדולל בהתאם) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (תמיסת מגן מפני אור). הערה: תיוג עקיף עם נוגדן משני מצומד מגביר את האות ומאפשר הדמיה קולורימטרית או פלואורסצנטית של מטרת החלבון.</li>
	<li>העברת קטעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים משנית. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT על שייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה (תמיסת מגן מפני אור).</li>
	<li>יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים משנית.</li>
	<li>כדי להמשיך להגן על הדגימות מפני אור, שטפו פעמיים עם 1x TBS במשך 30 שניות ב-RT. לאחר מכן שטפו במשך 15 דקות בכף אחת, הוסיפו DAPI (1-0.1 מיקרוגרם/מ"ל) אם רוצים.</li>
</ol>6. הרכבה
<ol><li>יוצקים חלקים לתוך תא היסטולוגי זכוכית, מלבני מלא שלושה רבעים עם 1x TBS.</li>
	<li>השקיעו שקופית זכוכית ב-1x TBS והשתמשו במברשת צבע עדינה כדי לשדל את המקטעים לכיוון השקופית.</li>
	<li>הקש בעדינות על המקטעים על השקופית, וודא שאין קמטים או קפלים.</li>
	<li>חזור על הפעולה עד שכל המקטעים יוטענו בשקופיות. הערה: כאשר מוח שלם, למשל, נחתך ב 40 מיקרומטר, נאסף ב 12 תוספות באר עם aliquot אחד המכיל 18-24 חלקים; פרוסות מותקנות בדרך כלל על 1-2 שקופיות, אך ניתן גם להרכיב פחות מקטעים בכל שקופית, בהתאם להעדפת החוקר.</li>
</ol>7. כיסויים
<ol><li>לאחר ייבוש המקטעים על המגלשה(ים), כ-10-15 דקות ב-RT או עד שהמקטעים נראים אטומים (זכרו להגן על שקופיות מפני אור), מרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים (התקשות או אי-התקשות). אנטי-דהייה עדיפה אם משתמשים בנוגדן משני מצומד פלואורסצנטי. הערה: איכות הפלואורסצנטיות עשויה להיות פחותה בעת שימוש באמצעי הרכבה מתקשה, אך שקופיות אמורות להחזיק מעמד זמן רב יותר.</li>
	<li>בעזרת פינצטה, מניחים כיסוי על גבי המדיום. כסו בנייר סינון ולחצו בחוזקה כלפי מטה כדי להסיר אמצעי הרכבה עודפים. הערה: אם אתם משתמשים בתושבת שאינה מתקשה, צבעו את קצוות השקופית המכוסה בלק שקוף לאיטום.</li>
	<li>קטעי תמונה באמצעות מיקרוסקופ מתאים. יש לאחסן בקופסת שקופיות חשוכה בטמפרטורה של 4°C. הערה: ניתן לצלם מקטעים באמצעות מגוון מיקרוסקופים, כגון סריקת לייזר פלואורסצנטית קונפוקלית והפוכה או זקופה, בהגדלות (למשל, 10x, 20x, 40x) בהתאם לצרכי החוקר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV:+Techniques+in+Experimental+Pathology.">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group.">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+indispensable+tools+for+biomedical+research.">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li><li>Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Antibodies:+A+Laboratory+Manual.">Using Antibodies: A Laboratory Manual.</a> The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Hermersd&#246;rfer, H., Beesley, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).</li><li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+Immunohistochemistry.">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Review+of+Cytology.">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li><li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections.">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).</li><li>H&#246;kfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues.">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons.">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin.">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focus+on+fixation.">A focus on fixation.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li><li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry.">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections.">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fos:+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections.">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li><li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides.">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li><li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation.">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat.">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li><li>L&#246;nnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney.">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li><li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+and+Pro-GnRH,+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain.">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li><li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue.">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li><li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity.">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li><li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain:+a+light+and+electron+microscopic+study.">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li><li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum.">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li><li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury:+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers.">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li><li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology.">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li><li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry.">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry.">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li><li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papel+da+imuno-histoqu&#237;mica+no+diagn&#243;stico+do+c&#226;ncer+de+pulm&#227;o.">Papel da imuno-histoqu&#237;mica no diagn&#243;stico do c&#226;ncer de pulm&#227;o.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).</li><li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures.">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).</li><li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cresyl+violet:+A+red+fluorescent+Nissl+stain.">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li></ol>

אין מה לחשוף

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה רב-תכליתית שהפכה לחיונית בזיהוי ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. בדיקה זו משמשת ברחבי הקהילה המדעית כדי להבין עוד יותר מאפיינים של רקמה משלבים של תפקוד תקין למצבי מחלה. IHC מועסק במגוון תחומים, החל מאבחון קליני של מחלות כגון סרטן ועד תגליות ראשוניות...

Immunostaining היא פרקטיקה מחקרית פופולרית שהחלה לפני 130 שנה עם גילוי נוגדנים בסרום בשנת 1890 על ידי Von Behring1. בתחילת המאהה-20 הוצמדו צבעים לאנטיגנים ומאוחר יותר לנוגדנים כדרך לכמת ולדמיין תגובות1, ובשנת 1941 פיתח אלברט קונס את תוויות הנוגדנים הפלואורסצנטיות הראשונות, תגלית שחוללה מהפכה במיקרוסקופ אור 2,3. המונח "immunostaining" מקיף טכניקות רבות שפותחו באמצעות עיקרון זה, כולל כתם מערבי, ציטומטריית זרימה, ELISA, אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה 3,4. כתם מערבי מזהה נוכחות של חלבונים ספציפיים מתמציות רקמות או תאים5. חלבונים מופרדים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, מועברים לקרום ונבדקים באמצעות נוגדנים. טכניקה זו מצביעה על נוכחות של חלבון וכמה חלבון קיים; עם זאת, הוא אינו חושף מידע על לוקליזציה של החלבון בתוך תאים או רקמות. שיטה אחרת, אימונוציטוכימיה (ICC), מסמנת חלבונים בתוך תאים, בדרך כלל תאים המעובדים במבחנה. ICC מראה הן ביטוי חלבונים והן לוקליזציה בתוך תאים6. כדי לזהות ולדמיין חלבון מסוים ברמת הרקמה, נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (IHC).
IHC היא שיטה שחוקרים משתמשים בה כדי להתמקד באנטיגנים ספציפיים בתוך רקמות, תוך ניצול התכונות הכימיות של מערכת החיסון 7,8. על ידי יצירת נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים הקשורים לאנזים או לצבע פלואורסצנטי, אנטיגנים בעלי עניין יכולים להיות מסומנים ומתגלים ברוב הרקמות (כפי שנסקר ב- Mepham ו- Britten)9. המונח "אימונוהיסטוכימיה" כשלעצמו אינו מפרט את שיטת הסימון המשמשת לחשיפת האנטיגן המעניין; לפיכך, מינוח זה משולב לעתים קרובות עם טכניקת הזיהוי כדי להגדיר בבירור את שיטת התיוג: אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (CIH) כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לאנזים, כגון פרוקסידאז; או IHC פלואורסצנטי כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לפלואורופור, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או טטרמתילרודאמין (TRITC). הסלקטיביות של IHC מאפשרת לרופאים ולחוקרים לדמיין ביטוי ופיזור חלבונים ברקמות, במצבי בריאות ומחלות שונים10. בתחום הקליני, IHC משמש בדרך כלל לאבחון סרטן, כמו גם לקביעת הבדלים בסוגים שונים של סרטן. IHC שימש גם כדי לאשר סוגים שונים של זיהומים מיקרוביאליים בגוף, כגון הפטיטיס B או C11. במחקר ביו-רפואי, IHC משמש לעתים קרובות למיפוי ביטוי חלבונים ברקמות והוא חשוב בזיהוי חלבונים חריגים הנראים במצבי מחלה. לדוגמה, ניוון עצבי מלווה לעתים קרובות בהצטברות של חלבונים חריגים במוח, כגון פלאקים Αβ וסבכים נוירופיברילריים במחלת אלצהיימר. מודלים של בעלי חיים מפותחים לעתים קרובות כדי לחקות מצבים פתולוגיים אלה, ו-IHC היא שיטה אחת שבה משתמשים החוקרים כדי לאתר ולכמת את החלבונים המעניינים 10,12,13. בתורו, אנו יכולים ללמוד יותר על הגורמים למחלות אלה, ואת הסיבוכים המתעוררים איתם.
ישנם שלבים רבים הכרוכים בביצוע IHC. ראשית, רקמת העניין נאספת ומוכנה להכתמה. ניתן לטעון שרוב החוקרים מכינים דגימות רקמה קבועות, כאשר זילוח של הקיבוע באמצעות מערכת הדם הוא אופטימלי מכיוון שהוא משמר מורפולוגיה14,15. ניתן להשתמש גם לאחר קיבוע של דגימות רקמה אך עשוי להניב תוצאות פחות מאידיאליות16. קיבוע צולב, כגון פורמלדהיד, פועל על ידי יצירת קשרים כימיים בין חלבונים ברקמה17. לאחר מכן פורסים רקמות קבועות לשכבות או מקטעים דקים מאוד באמצעות מיקרוטום, כאשר חוקרים רבים מעדיפים לאסוף חלקים קפואים באמצעות הקפאה. משם הרקמה נאספת ומורכבת ישירות על מגלשת מיקרוסקופ (שיטת החלקה על החלקה), או תלויה בתמיסה (שיטת ציפה חופשית), כגון מלח חוצץ פוספט (PBS)18. שיטת האיסוף בה נעשה שימוש נקבעת מראש על פי צרכי החוקר, כאשר כל אחת משתי שיטות אלה מציגה יתרונות וחסרונות משלה.
השיטה המותקנת בהחלקה היא ללא ספק הנפוצה ביותר, כאשר יתרון חשוב הוא שניתן להכין חלקים דקים מאוד (10-14 מיקרומטר), מה שחשוב, למשל, לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. יש גם טיפול מינימלי בדגימה, מה שמקטין את הנזק הפוטנציאלי לשלמות המבנית של הרקמה19. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בטכניקה זו עם רקמה קפואה טרייה (רקמה שמוקפאת מיד באמצעות קרח יבש, איזופנטאן וכו '), שהיא עדינה מאוד בהשוואה לרקמה קבועה ויש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע הפשרה של הדגימה. יתרון נוסף של שימוש בחלקים המותקנים על שקופיות הוא שבדרך כלל אין צורך בכמויות גדולות של פתרונות לצביעה4. לכן, חוקרים יכולים להשתמש בכמות קטנה יותר של נוגדנים יקרים או כימיקלים אחרים כדי להשלים את הכתם. בנוסף, ניתן להעלות קטעים ממספר קבוצות ניסוי שונות על אותה שקופית, מה שיכול להיות יתרון, במיוחד במהלך רכישת תמונה. מצד שני, ישנם כמה חסרונות בשימוש במקטעים המותקנים על שקופיות, ובראשם שקטע הרקמה מוצמד לשקופית ובכך מגביל את חדירת הנוגדנים לצד אחד של המקטע, מה שמגביל את עובי הקטע ואת הייצוג התלת ממדי של הרקמה. זה יכול לקרות גם כי במהלך שטיפות, הקצוות של הרקמה וחלקים שלמים עשויים להתנתק מן השקופית, מה שהופך את הניסוי כולו חסר תועלת. יתר על כן, IHC בדרך כלל צריך להתבצע במהירות יחסית בעת שימוש בגישה המותקנת על שקופיות כדי למנוע השפלה של אפיטופ האנטיגן 20,21 עם שקופיות לא מעובדות המאוחסנות בדרך כלל ב -20 או -80 ° C, לעתים קרובות מכוסה ומאוחסן אופקית או בתיבות שקופיות, וכתוצאה מכך טביעת רגל אחסון גדולה יחסית. לבסוף, טכניקת ההרכבה על שקופיות יכולה גם לקחת זמן רב אם החוקרים צריכים לטפל במספר רב של שקופיות כדי לעבד מספר גדול של קטעי רקמות.
בשל חלק מהאתגרים הללו באמצעות שיטת ההרכבה על השקופיות, שינוי שנקרא שיטת הציפה החופשית הפך לחלופה פופולרית. טכניקה זו נכנסה לספרות בשנות ה-60-70 22,23,24, צברה פופולריות בשנות ה-80 25,26,27,28,29, וכיום היא שיטה מבוססת היטב הכוללת ביצוע הכתם על הקטעים שנאספו בהשעיה ולא היצמדה לשקופית 12,30,31 . שיטת הציפה החופשית אינה מומלצת כאשר קטעי הרקמה הם פחות מ -20 מיקרומטר; עם זאת, מניסיוננו זוהי הגישה הנבחרת כאשר חלקים עבים יותר (40-50 מיקרומטר) להיות מוכתם. יתרון מובהק אחד הוא שנוגדנים יכולים לחדור חלקים צפים חופשיים מכל הזוויות וליצור פחות צביעת רקע הודות לשטיפה יעילה יותר, כל זאת וכתוצאה מכך איתות טוב יותר בעת ההדמיה. בנוסף, החלקים מותקנים על השקופיות לאחר העיבוד, ובכך מבטלים את האפשרות של ניתוק רקמות, כמו גם מפחיתים את הזמן התופס את ההקפאה. שיטת הציפה החופשית יכולה גם להיות הרבה פחות אינטנסיבית עבודה, במיוחד עבור מחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. למשל, ניתן להכתים חלקים רבים (18-40) מאותה דגימה יחד באותה באר, מה שחוסך זמן בביצוע שלבי השטיפה והדגירה של הנוגדנים. יתר על כן, מכיוון שניתן להרכיב מספר גדול יותר (12-16) של מקטעים בכל שקופית באמצעות גישה זו, לעתים קרובות נוח ומהיר יותר לחוקר להציג ולצלם קטעים. יש לציין כי במהלך הרכבה של פרוסות רקמות על השקפים, ניתן לחבר ולנתק חלקים עד לקבלת הכיוון הרצוי. החוקרים גם משתמשים לעתים קרובות בריכוזים מעט נמוכים יותר של נוגדנים בשיטת הציפה החופשית, ומכיוון שהדגירות מבוצעות בצינורות מיקרוצנטריפוגות, ניתן לאסוף את הנוגדנים בקלות ולשמר אותם עם נתרן אזיד לשימוש חוזר (ראה שלב 5.1). יתרון נוסף הוא שניתן לאחסן את המקטעים ישירות ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות עם תמיסה קריופרוטקגנטית32, ובכך למזער את שטח האחסון ולמקסם את תוחלת החיים של הדגימות33. החיסרון בשימוש בטכניקה זו הוא שהקטעים מטופלים הרבה, ולכן הם נוטים לפגוע. עם זאת, ניתן להקל על כך על ידי שימוש בטלטול נמוך ובמהירויות סיבוב נמוכות, כמו גם הכשרה נכונה של החוקרים כיצד להעביר את הדגימות ולהרכיב את המקטעים על השקפים.
יחד, IHC הוא כלי מבוסס וחיוני להדמיה וללוקליזציה של ביטוי חלבונים הן בתחום המחקר הקליני והן בתחום המחקר הביו-רפואי. IHC צף חופשי היא שיטה יעילה, גמישה, כמו גם כלכלית, במיוחד בעת ביצוע מחקרים היסטולוגיים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מציגים פרוטוקול IHC פלואורסצנטי אמין וצף חופשי עבור הקהילה המדעית שניתן להתאים בהתאם לכתמים כרומוגניים של IHC וכתמים אחרים כגון המטוקסילין ואאוסין או צביעה סגולה קרזיל.

<table><tbody><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide boxes</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rectangular staining dish</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Round artist paintbrush #2</td><td>Princeton Select Series</td><td>3750R</td><td>Brand not important</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Specimen matrix for embedding</td><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stain tray &amp;ndash; slide staining system</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71396-B</td><td>Use dark lid</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Non-hardening</td></tr><tr><td>Well inserts for 12-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Well inserts for 6-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לדמיין מבני רקמות ספציפיים, כמו גם ביטוי חלבונים ולוקליזציה. שתי גישות חלופיות נמצאות בשימוש נרחב לטיפול בקטעי הרקמה במהלך הליך הצביעה, גישה אחת כוללת הרכבה ישירה של החלקים על שקופיות זכוכית, ואילו גישה שנייה, הציפה החופשית, מאפשרת לשמור על חלקים קבועים ולהכתים אותם כשהם תלויים בתמיסה. למרות שגישות המותקנות על שקופיות וצפות חופשיות עשויות להניב תוצאות דומות, טכניקת הציפה החופשית מאפשרת חדירת נוגדנים טובה יותר ולכן צריכה להיות השיטה המועדפת כאשר חלקים עבים יותר ישמשו לשחזור תלת-ממדי של הרקמות, למשל כאשר מוקד הניסוי הוא להשיג מידע על הקרנות דנדריטיות ואקסונליות באזורי מוח. בנוסף, מכיוון שהסעיפים נשמרים בתמיסה, אליציטוט יחיד יכול להכיל בקלות 30 עד 40 חלקים, שהטיפול בהם פחות מייגע, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. במאמר זה נמחיש כיצד ליישם את שיטת הציפה החופשית על צביעה פלואורסצנטית של אימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בעיקר במקטעי מוח. נדון גם כיצד ניתן לשנות בקלות את טכניקת הציפה החופשית כך שתתאים לצרכים האישיים של החוקרים ותותאם לרקמות אחרות, כמו גם לכתמים היסטוכימיים אחרים, כגון המטוקסילין ואאוזין וקרסיל סגול, כל עוד דגימות הרקמה קבועות כראוי, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד או פורמלין.

התוכנית הכוללת של השימוש בשיטת הציפה החופשית לביצוע בדיקה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מודגמת באיור 1. דוגמה מייצגת של IHC פלואורסצנטי המשתמש בשיטת הציפה החופשית במוח עכבר הבוחן ביטוי חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מוצגת באיור 2 בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections at JoVE.com

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

18.3K Views.  University of Rhode Island. טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, ...

Video: Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medicine

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Neuroscience

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Bioengineering

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Immunology and Infection

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Histological Staining of Neural Tissue

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this technique, a tissue of interest is preserved using chemical fixatives and sectioned, or cut into very thin slices. A variety of staining techniques are then applied to provide contrast to the visually uniform sections. In the study of neuroanatomy, histological techniques are frequently applied to visualize and study nervous system tissue. This video focuses on histological staining techniques for neural tissue. An overview of common brain stains is provided, including those that specifically mark neuronal cell bodies, like Nissl stains, and those that selectively highlight myelinated axons, like the Luxol Fast blue stain. Immunohistological techniques, which take advantage of the specific interaction between antibodies and unique cellular proteins, are also discussed. Next, the preparation of brain samples for staining is described, including the basic steps for fixation, embedding, sectioning, and rehydration of the tissue. The presentation also provides a step-by-step procedure for immunohistological staining followed by a Nissl stain, in addition to practical applications of these techniques.

Brain Stains: Histological Staining of Neural Tissue

כתמים היסתולוגיים של רקמה עצבית

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

הכנת מדגם היסתולוגי למיקרוסקופיה קלה

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Basic Biology

General Laboratory Techniques

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www.jove.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.