אנו מודים משתפי הפעולה שלנו לספק דגימות חלבון בעל ערך, אשר תרמו חלק מניסיוננו שיטות ותצפיות בנושא. גינטר Schmalzing חביב סיפק את ההזדמנות FR להצטרף לפרויקט. ברברה Armbruster, יעקב ברינק ו Deryck מילס הם הודו על העזרה מצטיינים שלהם קלט על ציוד. המימון ניתן על ידי NIH מענק HL090630.

1. רשת הכנה לניסויים התגבשות 2D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פחמן מצופה 400-EM רשת רשתות נחושת מוכנים על ידי כתם שלילי. אצטט Uranyl משמש לעתים קרובות ומספק לטווח ארוך כתם במונחים של אחסון של הפתרון במשך כמה חודשים לפני השימוש, כמו גם התאמה עבור אחסון לטווח ארוך של רשתות. לעומת זאת, כתמים שליליות אחרות כגון formate uranyl, תוך מתן מכתים מעולה, צריכים להיות טריים 1. עבור הכנה מהירה של מספר רב של רשתות לשמש ההקרנה של ניסויים התגבשות 2D, בגרסה אחרת של מכתים שלילי משמש. נפח של 2 μL של המדגם הוא pipetted על גבי רשת פחמן מכוסה EM וטופחו במשך 60 s. זה ואחריו סופג מהקצה עם חתיכת קרועות Whatman # 4 נייר פילטר (איור 1; וידאו) ולאחר מכן 2 μL של אצטט uranyl 1% מוחלים מיד, אשר שוב מחק מן הקצה של הרשת לאחר 30 s. נגיעה ברשת על שפת עם קצה נייר קרועות המסנן מבטיח הסרת אופטימלי של נוזל ללא הסרת proteoliposomes. יתר על כן, ייבוש בקצה הרשת מבטיחה שימור משופר של הסרט פחמן. יש להקפיד בהכנה וטיפול של רשתות, כמו שבירה של הסרט פחמן עדין מונע הידבקות מדגם יכול לגרום ייצוג מדויק של המדגם. בעוד כרכים מדגם באופן מסורתי יותר של μL 5 היו משמשים באופן שגרתי להכנת הרשת, דגימות יקרות ניתן לשמור על ידי הקטנת נפח μL 2 או פחות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר את הממברנות הגדול ביותר האפשרי, כמה דגימות שלנו דורשים הריכוזים הגבוהים של גליצרול או סוכרוז (10-20%) להיות נוכח למאגר דיאליזה. זו יכולה להיות השפעה שלילית על הכנת רשת, כמו גליצרול או סוכרוז היא צמיגה מאוד ומונע אצטט מתוך uranyl שצריך לחדור למאגר, ובכך חלקי מכתים את הקרומים. כתוצאה מכך סריג אפשרי יהיה מוסתר. או החיץ ניתן להחליף על ידי צנטריפוגה של דגימות והחלפת על ידי חיץ גליצרול / סוכרוז נקי (לא מוצג), או רשתות ניתן לכבס עם חיץ או גליצרול / סוכרוז ללא חיץ אחד מחזורים ספורים לפני מכתים שלילי דומה טכניקה המשמשת עבור cryo-EM 3,4. </li></ol> 2. הערכת ניסויים התגבשות 2D על ידי א.מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לסוג של בעל המדגם, או רשתות אחת או מספר נטענים. הגדלה של 2-10K, אשר ייקראו כאן הגדלה ביניים, המאפשר הופעה ראשונה של הפצה בהיקף ממוצע של פיזור של ממברנות, מורפולוגיה, וגודל, אשר נלקח לב במחברת מעבדה 5. אזורים מתאים נרשמות סקירות נציג בעזרת מצלמה CCD או, אם מצלמה CCD אינו זמין, על הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה נמוכה בטווח של בערך 400-800x משמש בשעות סקירה של כל מדגם / רשת הוא הרצוי. אמנם לא כל מועסק עם רשת, בהגדלה נמוכה נותן מידע רב ערך לסייע בהערכת הכנת הרשת במונחים של מספר היבטים: הן מכתים שלילי שבירה חלקית הפוטנציאל של הסרט פחמן, ריכוז מדגם על הרשת, הפצה אחידה proteoliposome אולי. ריבועים רשת בודדת עלול להיתפס עם משקפת או מצלמה CCD. עם כמה EMS אפשר לחסוך עמדות עניין מיוחד, אשר ניתן לבדיקה נזכר מאוחר יותר בהגדלה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם באזור רשת של עניין זוהתה בהגדלה או נמוכה או בינונית, הגדלה משתנה 60K-50K בערך. בהתאם קריסטל קרום, ותא גודל היחידה, אם הוא ידוע, בהגדלה נמוך כמו 30K ו גבוה ככל 80k משמשים. טווח הגדלה של 30-80k יהיה המכונה בהגדלה גבוהה לצורך ההקרנה עבור גבישים 2D. ההתמקדות מתרחשת גם בסביבה מוקד במינון נמוך הגדרת, עם הבורר לאחר הגדרת תמונה / צילום, או בקרבת שטח של עניין. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים של אי בהירות בשאלה אם האזור של עניין הוא אכן קרום, המדגם נבדק לסרט פחמן בגודל של proteoliposomes, נציץ, או חפצים אחרים. לענין זה, לחשוף את קצוות מתקפלים מורפולוגיה טיפוסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לאזור של עניין נבדק עם מצלמת CCD. תמונה CCD נאסף בהגדלה 30K-80k, תלוי בגודל הממברנה, חלבונים או תאים גודל יחידה, או ידוע אזור גבישי. סריג של חלבון ממברנה קטנות ו / או הידרופובי לרוב אינו גלוי בהכרח הערכה חזותית של התמונה CCD עצמו. או התמונה כולה משמשת להפוך מקוונת, פורייה (FT, או מהר FT-FFT). FT זה יכיל כמות משמעותית של רעש, לעומת זאת, אם מערך הורה הוא קטן. לפיכך, גודל התמונה מופחת התאגרף תאפשר יחס אות לרעש משופר של smalהימלר קריסטל זיהוי קל יותר. למטרה זו, תיבת מועבר על התמונה ו FT לחיות מוערך. עוצמת / בהירות של הקורה מותאם שמירה במינון נמוך התנאים המדגם, וכן הגדרות מצלמת CCD בראש. בהתאם למצלמה CCD בשימוש, גמא של FT חיים מותאם לזיהוי אופטימלי של מערכים מסודרים. ערך גבוה מדי יכול לטשטש כתמים בשל תרומות רעש, ערך גאמה נמוך מדי ימנע כתמים חלשים יותר מלהיות מזוהה. אלה הנקודות החלשות ייתכן שהדבר נובע מערכים גבישי קטן עם כתמים את רגל בקושי מעל רמת הרעש. למרות נתונים ברזולוציה גבוהה יותר נאסף מספר קטן של דוגמאות 6, בדרך כלל ההחלטה של גבישים 2D צבעונית שלילית מוגבלת או לא צריך להיות צפוי להיות טוב יותר ברזולוציה 15A בערך. עם defocus של כ -400 ננומטר, לא יותר מ 1-3 הזמנות של כתמים צפויים להיות מזוהה בקלות. דוגמאות הם בדרך כלל לא העריכו לפתרון, כמו cryo-EM איסוף נתונים ייתן אינדיקציה נכונה של השגה ברזולוציה הגבוהה ביותר. חדות של כתמים mosaicity האפשריים הם ציינו כי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנות שונות, כמו גם מורפולוגיות קרום, מוערכות על מנת בהגדלה גבוהה. זה קריטי במיוחד בתחילת או שלבי הביניים של ניסויים התגבשות 2D, כמו proteoliposomes קטנים ולא גדולים או טלאים קרום יכול להכיל האזורים המבטיחים ביותר. אחוז נמוך מאוד של גבישים 2D ידרוש רכישת התמונה FT, או עקיפה אופטית, של מספר רב של תמונות מאז הזיהוי הראשוני של מערכים הורה יהיה לעתים קרובות להביא לשיפור מהיר של גודל ואיכות 2,4,7. </li></ol> 3. נציג תוצאות Proteoliposomes הורה אידיאלי להציג לזיהוי בקלות, פינות חדות. גבישים גדולים המסודר מזוהים בקלות על ידי המקוון-FT של תמונות CCD או עקיפה אופטי של micrographs. הדוגמה מראה 2D גבישים של חלבון ממברנה קטנה של 18kDa כי הם עד כמה מיקרונים בגודל. כתמים על FT מזוהים בקלות חדות. התנועה של התיבה לחיות FT מראה כי הסריג היא רציפה ללא mosaicity. הסריג של חלבון גדול יותר עם תחום מסיסים נרחב יותר ניתן לזהות על המסך הקטן של EM. אוסף CCD התמונה FT יש צורך לספק אמצעי הערכה טובה יותר כדי לקבל מידע על mosaicity, למשל אפשרי (הצג FT). בחישוב של FT proteoliposome שאינו הורה, רעש יכול להיות בתחילה בטעות כתמים. אמנם התיבה של live-FT הוא עבר, עם זאת, כתמים ייעלמו. מצד שני, מערכים קטנים, עם crystallinity בספק, יהיו כתמים שלהם הנותר נייח כאשר חי FT מועבר ולו במעט על פני שטח התמונה. יתר על כן, גבישים אלה קטן יכול להיות מוכר על ידי כלל שיש התא גדלים באותה יחידה, ואת המרחקים בין נקודות ב FTS שונים ניתן למדוד בדרכים שונות, כגון עם עיגול בגודל מסוים. גבישים ליפידים להציג מורפולוגיה סריג FT ברורים. אין זה נדיר להיתקל משקעים בניסויים הראשונים. כאן משקעים חלבון ללא הכינון מחדש צריך להיות נבדל אגרגטים השומנים קטן אף. דוגמאות שנראים משקעים בהגדלה נמוכה לעתים קרובות להתברר אגרגטים השומנים כאשר צפו בהגדלה גבוהה יותר. לאחר בדיקה ב 30-50K, את הקצוות של מבנים אלה אפל לחשוף אותם להיות מורכבת של ממברנות עם משקעים לא של החלבון. אלו תצפיות חשובות כמו אגרגטים השומנים עשוי להיות מוגברת בגודל ממברנות גדול בניסויים הבאים. תוצאות Poor בדגימות הערכת המחוברים לפעמים ריכוז נמוך קרום שמונע הקרנת נכונה ומהירה. זה יכול להיות לעתים קרובות להתגבר עם השימוש של ריכוז חלבון גבוה יותר עבור התגבשות 2D על ידי דיאליזה. לחלופין, הקרומים ניתן להשאיר להתיישב לכמה ימים בתחתית הצינור Eppendorf במהלך האחסון. במקרים מסוימים ליישוב מהיר, או כמעט מיידית של ממברנות מתרחשת pipetting מהחלק התחתון של הצינור תגרום קרום צפיפות גבוהה על הרשת. אפשרות נוספת היא הרבה יותר מהר צנטריפוגה (בסל&quot;ד 3000-8000 דקות 1-3) של דגימות עם דגימה הבאים מתחתית הצינור. דוגמאות בתנאים אופטימליים יכלול אחוז גדול של גבישים 2D. אין צורך לכוון מראה הומוגני של ממברנות, כאוסף הגדול ביותר גבישים 2D המסודר נבחרו חזותית של נתונים. סוגים אלה של דוגמיות תוכר בקלות כאשר התגבשות ניסויים חוזרים כמו גם כאשר דגימות משמשיםcryo-EM איסוף נתונים, וכתוצאה מכך מספר מרבי של תמונות ברזולוציה גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נתון זה מראה סופג את הקצה של הרשת עם חתיכת קרועות Whatman # 4 נייר הסינון.

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

הערכה נכונה של דגימות דורש הערכה זהירה של מספר מספיק של ממברנות. לדוגמה, עם דגימות נמוך כמו 2% מערכי גבישי מתוך מעל 180 proteoliposomes הדמיה מסר מידע קריטי עבור אופטימיזציה מהירה של התגבשות התנאים 2D 7. כאשר משקעים של החלבון מתרחשת, רש?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

קריסטלוגרפיה אלקטרונים התפתח כשיטה שניתן להשתמש בהם או לחילופין או בשילוב עם התגבשות תלת ממדי ו-X-ray קריסטלוגרפיה ללמוד מבנה שאלות פונקציה של חלבונים בממברנה, כמו גם חלבונים מסיסים. הקרנת עבור דו ממדי (2D) גבישים על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (EM) הוא שלב קריטי למציאת, אופטימיזציה, ובחירת דוגמאות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM. כאן אנו מתארים את הפעולות הבסיסיות בזיהוי הן גדולות והורה, וכן מערכי 2D קטנים, שעלולים לספק מידע קריטי עבור אופטימיזציה של תנאי התגבשות. על ידי עבודה עם בהגדלה שונים EM, נתונים על מגוון של פרמטרים קריטיים מתקבל. הגדלה תחתון מספקת נתונים חשובים על גודל המורפולוגיה הממברנה. בהגדלה גבוהה, ניתן להזמין 2D ממדים קריסטל נחושים. בהקשר זה, הוא תיאר כיצד מצלמות CCD ו-פורייה באינטרנט הופך משמשים בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך proteoliposomes לסדר גודל. בעוד 2D גבישים של חלבונים בממברנה גדלים בדרך כלל על ידי הכינון מחדש על ידי דיאליזה, הטכניקה ההקרנה הוא ישים באותה מידה עבור גבישים המיוצר בעזרת monolayers, קריסטלים 2D הילידים, והורה מערכים של חלבונים מסיסים. בנוסף, בשיטות המתוארות כאן החלות על ההקרנה עבור 2D של גבישים קטנים עוד יותר, כמו גם חלבונים בממברנה גדול, שבו חלבונים קטנים דורשים את אותה כמות של טיפול זיהוי כדוגמאות שלנו הסריג של חלבונים גדול יכול להיות בקלות רבה יותר לזיהוי בשלבים קודמות של ההקרנה.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

assessing-two-dimensional-crystallization-trials-small-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Georgia Institute of Technology. הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

Video: Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.