נויטרופילים הם תאים מובחנים סופניים, וכרגע אין קווי תאים כדי לשחזר באופן מלא ביולוגיה נויטרופילית. לכן יש צורך להשיג נויטרופילים טהורים, מומתים, בריאים ורעננים כדי ללמוד את הביולוגיה שלהם. שיטת רענון זו משלבת שיפוע צפיפות, משקעים, תמה עדינה כדי לקבל הכנה נויטרופילית טהורה.
זה קל להגדיר, דורש ציוד פשוט ותרגול קטן. ההיבט הטכני, כגון שכבות הדרגתיות, של שיטה זו ידרוש קצת תרגול כדי לשלוט, אבל ברגע מעבר הצבע הוא מושלם השלבים האחרים צריכים לבוא כמו רוח. התחילו בחיטוי של מעיל באפי, אריזה ומכסה המנוע.
ואז להוסיף 10 מיליליטר של הדם לתוך צינור 50 מיליליטר. כדי לדלל את הדם לניקוי הדרגתי, הוסיפו 5%FBS/HBSS והקימו את הנפח עד 35 מיליליטר. לאחר סגירת המכסה, להפוך את הצינור מספר פעמים לערבוב ולאחר מכן לשמור על הצינור הפוך כדי לקבל את התחתון נטול תאי דם אדומים.
מוסיפים 10 מיליליטר של המדיום הדחול הצפיפות ישירות מתחת לדם, להבטיח כי המדיום והדם לא לערבב ואת הממשק נשאר חד. לסובב את הצינור ב 400 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, הקפדה להשבית את הבלם. לאחר הסיבוב, התבונן בשיפוע המופרד לשכבת פלזמה בסרום עליון, טבעת לבנה אמצעית של תאים מונונוקלאריים היקפיים בדם, שכבה בינונית הדרגתית הדרגתית בצפיפות מעוננת, וכדור תחתון המורכב מפס נויטרופילים דק לבן על גבי תאי הדם האדומים.
כדי להסיר PBMC, לצאת פיפטת היניקה ישירות לתוך שכבת PBMC ולשאף לחלוטין בזמן שכבת הפלזמה בסרום הוא מקבל ירידה כמו הטבעת מוסרת. לגרד את הצד של הצינור עם פיפטת היניקה כדי למקסם את הסרת PBMC. הסר בזהירות את השכבה הבינונית המדרגית של צפיפות מעוננת בין טבעת PBMC לכדור נויטרופיל/RBC.
עבור משקעי אריתרוציטים, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את גלולה נויטרופיל / RBC לתוך צינור נקי. לאחר מכן הוסף 5%FBS/HBSS לנפח סופי של 25 מיליליטר. הוסף ישירות 25 מיליליטר של הפתרון המואר מראש המכיל 3% dextran / 0.9% NaCl במים לתוך הצינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.
מניחים את הצינור על משטח מאוזן ולא רוטט במשך 15 דקות. לאחר הנחת הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע, לטבול מעט את pipette בנוזל ולאסוף כ 30 מיליליטר של השכבה העליונה בעקבות פני השטח הנוזלי כלפי מטה. לסובב את הצינור כדי להשיג גלולה אדומה ללא חלקיקים צפים בתקשורת.
עבור תמוז של RBC שיורית, לשאוף בעדינות את supernatant מבלי לשבש את הכדור. מוסיפים 25 מילימטרים של מים סטריליים אולטרה-ספיריים ישירות לתוך הצינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור במשך 28 שניות כדי לתיז את RBC. לאחר מכן, מיד להוסיף 25 מיליליטר של תמיסת NaCl סטרילית 1.8%מוכן במים לתוך הצינור ולהביא את הפתרון בחזרה לתנאים איזוטוניים על ידי ערבוב עדין.
לסובב את הצינור ב 200 פעמים g במשך שלוש עד חמש דקות עם בלם נמוך כדי למזער את משקעים של RBC וטסיות דם עם נויטרופילים. לשימוש חוזר בגלולה הנויטרופיל הלבן, הוסיפו ישירות את מדיום התרבות על הכדור אך אל תזרימו מעלה ומטה. לאחר מכן, רוק הצינור אופקית מצד לצד כדי למזער את הפעלת התא.
אם נצפתה צבירה או גוש של תאים, סנן את ההשעיה של התא דרך רשת של 70 מיקרומטר כדי להשליך את הנויטרופילים המגושמים. להערכת איכות הכנת הנויטרופילים המבודדת, מכתימים את התאים בסמנים ספציפיים לנויטרופילים, אאוזינופילים וסמן הפעלה. לאחר רכישת 20, 000 תאים על ידי ציטומטריית זרימה, לנתח את טוהר התא ואת ההפעלה באמצעות אסטרטגיות gating ולקבוע את הכדאיות התא באמצעות נספח V / propidium יוד כמתואר בכתב היד הטקסט.
שיפוע הצפיפות במהירות נמוכה הניב נויטרופילים עם יותר טוהר, בעוד מהירות גבוהה הביאה לתשואה מוגברת על חשבון טוהר. באמצעות מיון התאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות, התפלגות התאים לבדה סיפקה הערכה של איכות בידוד התא, אך יש להעדיף את השימוש בסמני תאים ספציפיים. אוכלוסיות התאים המזהמות שזוהו היו מונוציטים, לימפוציטים ואאוזינופילים.
תפוקת הנויטרופילים העצומה הושגה באמצעות פרוטוקול זה. הביטוי של CD62L הוערך. עוצמת הפלואורסצנטית הממוצעת עבור CD62L ירדה בתאי הבקרה החיוביים, מה שמצביע על שפיכת CD62L והפעלת נויטרופילים.
יש להעריך את בריאות הנויטרופילים לפני ביצוע ההבחנה מכיוון שלנויטרופילים יש מחצית חיים קצרה יחסית וההפעלה מקצרת עוד יותר את החיים. לאחר טיהור נויטרופילים באמצעות שיפוע הצפיפות והמיקרואורגניזמים המסחריים, התאים היו בתרבית במשך 24 שעות והישרדות התא נותחה על ידי ציטומטריית זרימה. הכימות של תאים ברי קיימא הצביע על כך שטיהור הדרגתי הצפיפות הביא לתאים ברי קיימא יותר לאחר 24 שעות מאשר טיהור באמצעות ערכה.
חשוב כי שכבות הדרגתיות ושלבי צנטריפוגה יבוצעו ככל האפשר כפי שהוא ישפיע מאוד על איכות ההכנה. ניסויי במבחנה ובואיות ביוכימיות יכולים להתבצע בעקבות הליך זה. כמו כן, בחירה שלילית יכולה להתבצע אם תאים אולטרה-תותכים נדרשים כמו בניסויי ביטוי ציטוקינים וחלבון.
