היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם חיונית לשמירה על המוסטאזיס. תהליך זה כרוך בביטוי של פוספוליפידים ושחרור מיקרו-שלפוחיות על פני הטסיות, החיוני לשלבי הקרישה. הערכות של תהליך זה סיפקו נתונים חדשים על האופן שבו תגובות קרישה טסיות הן במחלות אנושיות מגוונות.
ציטומטריית זרימה הייתה אבן פינה וזכתה להסכמה נרחבת בהערכת ביטוי פוספטידיל-סרין על טסיות דם ושחרור מיקרו-שלפוחיות. הבידוד והניתוח של טסיות מטוהרות מהדם גוזלים זמן רב ומחייבים ציוד מעבדה מיוחד, ולכן אינם זמינים כיום לאבחון קליני שגרתי. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור שלפוחית המיקרו-שלפוחית מאתגר גם בשל גודלם הקטן והמספר הנמוך של אירועים חיוביים לסמנים מעניינים.
כדי להתחיל, לאסוף דם ורידי היקפי בצינורות איסוף המכילים את נוגדי קרישה פעיל trisodium ציטראט עם חומצת לימון דקסטרוז. הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב את הדם עם נוגד קרישה ולתת את התערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. ספור טסיות באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את המהירות הנכונה לצנטריפוגה.
כדי להכין את פלזמה עשירה טסיות, צנטריפוגה את הדם ב 250 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מבלי להחיל את ההפסקה. לאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של ACDA ו 6.25 מיקרוליטר של apyrase ל 9 מיליליטר של פלזמה עשירה טסיות. צנטריפוגה את התערובת ב 1, 100 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
בעזרת פיפטת מרעה, הסר את הסופרנאטנט המכיל פלזמה דלה בטסיות והשהה מחדש את גלולת הטסיות בעדינות במיליליטר אחד של חיץ כביסה. לאחר מכן הוסף 3 עד 4 מיליליטר של חיץ כביסה לצינור וצנטריפוגה אותו שוב. לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מיליליטר של חיץ כביסה.
מעבירים 150 מיקרוליטר של תרחיף טסיות הדם לצינור של 1.5 מיליליטר לספירת התאים במונה תאים אוטומטי. הוסף 3 עד 4 מיליליטר של חיץ כביסה לתרחיף הנותר כדי לבצע שטיפה נוספת כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת הטסיות במאגר התגובה כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 בעוצמה של 11 טסיות לליטר.
כדי להתחיל, להשיג טסיות שטף בחיץ הרצוי עבור cytometry זרימה. הכינו את כל האגוניסטים והפלואורוכרומים במאגר התגובה. לבדיקות פנימיות יש להוסיף 100 מיקרוליטר טסיות שטופות בריכוז של 50X10 בחזקת 9 טסיות לליטר לצינורות טיפול שונים.
יש לנער בעדינות כל אליקוט ולדגור בחום של 37 מעלות למשך 5 דקות. לאחר מכן להוסיף 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC לא מדולל לכל microtube ולדגור. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של חיץ תגובה לכל צינור כדי לעצור את התהליך.
שער אוכלוסיית הטסיות באמצעות פיזור קדמי או FSC והשתמש בחלקות צפיפות כדי לזהות כל אוכלוסייה באופן עצמאי. קבע את החתך השלילי בקצה הימני של אוכלוסיית טסיות המדינה המנוחה. לאחר ההפעלה, סווגו את האירועים מימין לחיתוך זה כטסיות החושפות פוספטידיל-סרין.
עבור הבחנה בין מיקרובוסיקלים, הגדר את החתך בערך FSC הנמוך ביותר שנצפה באוכלוסיית טסיות המנוחה. לאחר ההפעלה, סווג אירועים חיוביים של פוספטידיל-סרין מתחת לסף זה כמיקרו-שלפוחיות. מדידות בסיסיות הצביעו על כך שפחות מ-2.9% מהטסיות הלא פעילות הציגו חשיפה לפוספטידיל-סרין.
עם ההפעלה, 26.7% מהטסיות הפכו חיוביות לפוספטידיל-סרין עם קולגן, 9.1% עם תרומבין ו-36.2% עם קולגן וטרומבין. הטיפול ביונופור הביא ל-49.6% טסיות דם חיוביות לפוספטידיל-סרין. היחס הבסיסי של מיקרובועיות היה 0.3%עליות משמעותיות נצפו רק עם קולגן ותרומבין יחד בכ-11.4% ויותר מכך עם יונופורים ב-44%
