טסיות דם צריכות להיות חופשיות מתאים וחלבונים בחקר תכונותיהם הביוכימיות והפיזיולוגיות. לכן, פיתחנו פרוטוקול לטיהור טסיות דם מדם העכבר. טכניקה זו יכולה לטהר טסיות דם באמצעות iohexol הדרגתי בינוני ומהירות נמוכה צנטריפוגה, וכתוצאה מכך הפרדה ברורה של טסיות דם מרכיבי דם אחרים.
כדי לטהר את טסיות הדם, השתמש בקצה פיפטה רחב נשא לשכבה 200 microliters של דם שלם שנקטף טרי לאט בצד של צינור 1.5 מיליליטר על 600 microliters של מדיום שיפוע iohexol ללא ערבוב. לאחר צנטריפוגה רוטור מתנדנד דלי כדי לבודד את טסיות הדם, להשתמש טיפ פיפטה רחב נשא חדש כדי לאסוף את רוב השכבה עשיר טסיות דם וחלק קטן של שכבת טסיות דם עניים מבלי לשאוף את תא הדם הלבן או שכבת תא הדם האדום. מוסיפים את דגימת טסיות הדם לצינור חדש, ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS לטסיות הדם.
מערבבים את טסיות הדם על ידי היפוך לפני ביצוע צנטריפוגה נוספת. ואז תן שימוש חוזר את גלולה ב 200 microliters של PBS עם צינורות קלים. להפעלת טסיות דם, להעביר אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות דם לצינור חדש המכיל 100 microliters של חיץ כתמים.
הוסף אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות הדם לצינור אחר המכיל 100 מיקרוליטרים של חיץ כתמים בתוספת פפטיד GPRP 0.4 מילימולר. מוסיפים את הטרומבין לצינור עם הפפטיד GPRP כדי להפעיל את טסיות הדם, ומוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המעניין את שני הצינורות. כשליטה חיובית, להוסיף microliter אחד של דם שלם עד 100 microliters של חיץ כתמים בצינור המכיל פפטיד GPRP 0.4 מילימולר, ולהוסיף טרומבין כדי להפעיל טסיות אלה.
כבקרה שלילית, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של דם שלם ב-100 מיקרוליטרים של חוצץ כתמים. ואז להכתים את שני צינורות הבקרה עם קוקטייל הנוגדנים. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ כתמים טריים לכל צינור.
תן שימוש חוזר לכדורים ב-300 מיקרוליטרים של חיץ כתמים טרי. ואז להעביר את דגימות התא לתוך צינורות ניתוח ציטומטריה זרימה בודדים מוגנים מפני אור. כדי לנתח את טסיות הדם לפי ציטומטריית זרימה, צור ניסוי חדש וצור פיזור קדמי לוגריתמי לעומת חלקות נקודה של פיזור צד לוגריתמי.
לאחר התאמת המתחים לפי הצורך, רשום את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי הפיצוי. עכשיו להפעיל את מדגם השליטה החיובית כדי לרכוש מספיק תאים כדי להתאים את הפיצוי ואת השערים. לאחר מכן לרכוש ולהקליט 100, 000 אירועים עבור כל דגימת דם שלמה, ולנתח את נתוני cytometry זרימה באמצעות חלקות ושערים המתאימים.
אם הדם מתווסף למדיום לאט, מדיום שיפוע iohexol ואת דגימת הדם יהיה ליצור שתי שכבות נפרדות בצינור. לאחר הצנטריפוגה, השכבה העליונה בצבע קש מכילה את הפלזמה אך ללא תאי דם שלמים. השכבה השנייה, לבנוויטית ועשירה בטסיות דם, מכילה את רוב טסיות הדם.
השכבה השלישית השקופה היא שכבת טסיות הדם הירודה והיא נמצאת ישירות מעל תא הדם האדום וכדור תאי הדם הלבנים. דם שלם מציג אוכלוסיות שונות של תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם על פיזור לוגריתמי קדימה לעומת חלקת נקודה של פיזור צד. טסיות דם מטוהרות, לעומת זאת, להפגין אוכלוסייה ברורה עם מספרים זניחים של תאי דם אדומים או לבנים.
דגימות דם שלמות מכילות תאי דם אדומים חיוביים Ter119 ואוכלוסיות תאי דם לבנים חיוביים CD45 שכמעט נעדרים בדגימות טסיות מטוהרות. טסיות דם מטוהרות שלא טופלו אינן מבטאות כמעט סמני הפעלה המאשרים את מצב המנוחה שלהם, בעוד טסיות דם מטוהרות שטופלו בטרומבין מדגימות בדרך כלל ביטוי של 71%P-selectin. הערכה מיקרוסקופית של דגימות טסיות דם מטוהרות לא מטופלות אינה מגלה צבירת טסיות דם.
לאחר ההפעלה עם טרומבין, עם זאת, טסיות הדם להפגין צבירה חזקה, עוד יותר המאשר את הכדאיות שלהם לאחר טיהור כפי שהוכח. שכבת דגימת הדם בזהירות על מדיום iohexol, וכאשר אוספים את טסיות הדם, הקפד שאפו בזהירות כדי לא לאסוף את תא הדם האדום ואת שכבות תאי הדם הלבנים לטיהור טסיות דם מוצלח. שיטה זו יכולה לשמש לטיהור טסיות דם ממינים אחרים גם כן.
טסיות הדם המטוהרות יכולות לשמש להבעת גנים, הפעלה, צבירה, שחרור גרנולים ולימודי הידבקות.
