בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

שלפוחיות חוץ-תאיות במחזור כסמנים ביולוגיים הן תחום חדש יחסית בחקר סמנים ביולוגיים עם פוטנציאל עצום. הפרוטוקול שלנו נועד לספק גישה מעשית ליישום גילוי וזיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים לשלפוחית חוץ-תאית במסגרת מחלקת מיון. עדויות מתפתחות הראו כי המטען המולקולרי שנמצא בשלפוחיות ובמחזור הדם החוץ-תאיים מכיל חלבונים ו-RNA מעניינים בהקשרי מחלות מרובים.

מספר שלפוחית חוץ-תאית חדשה, סמנים ביולוגיים סגורים נקשרו לאבחון ופרוגנוזה של ישויות שונות של מחלות לב וכלי דם. האתגרים העיקריים בתחום גילוי סמנים ביולוגיים של שלפוחית חוץ-תאית במחזור הם שימור שלפוחיות חוץ-תאיות ורכישת פלזמה התלויה בדינמיקת שחרור EV. לכן, יש צורך בפרוטוקול מחמיר המוטמע בשגרה הקלינית כדי למנוע השפלה של EV ולשמור על תוצאות הניתנות לשחזור, במיוחד בעת יישום שיטות ניתוח רחבות היקף כגון פרוטאומיקה.

גילוי סמנים ביולוגיים של חלבונים הסגורים בתוך EV במחזור תלוי במידה רבה בזמן לקיחת הדם הראשונית ביחס להופעת התסמינים, ומשך אחסון הדגימה עקב פירוק טבעי של EV. פרוטוקול זה מציע פרוטוקול מעשי של בידוד EV בפלזמה והכנסה לניתוח פרוטאומיקה שישולב בזרימת העבודה הקלינית של מחלקת מיון. המחקר הקרוב שלנו יתמקד בשילוב קולקטיבים שונים של מטופלים במתודולוגיה שלנו, ביניהם חולים עם אי ספיקת לב לא מפוצה, הפרעות קצב או טכיקרדיה קרדיומיופתיה, כמו גם מחקרי אורך של חולים שעוברים ניתוח מעקפים.

באמצעות פרוטוקול זה, אנו שואפים לזהות סמנים ביולוגיים חדשים הקשורים ל-EV התורמים לאבחון ופרוגנוזה של פתולוגיות שהוזכרו לעיל. כדי להתחיל לצנטריפוגה את פלזמת הדם האנושית, באמצעות צנטריפוגה אולטרה עם רוטור זווית קבועה מבלי להישבר. לאחר שהפסולת והגוף האפופטוטי שוקעים, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש ולצנטריפוגה אולטרה ב-100,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס מבלי להישבר כדי לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות.

הסר את הצינור בזהירות לאחר האולטרה-צנטריפוגה. בעזרת פיפטה אלקטרונית, שאפו בעדינות את הסופרנטנט, והשאירו כמיליליטר אחד של פלזמה מדולדלת שלפוחית חוץ-תאית. עבור לפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לזרוק בזהירות את הפלזמה שנותרה מבלי להפריע לכדור השלפוחית החוץ-תאית.

הטה את הצינור בהדרגה במהלך הפיפטינג כדי להבטיח שלא תישאר פלזמה והשהה מחדש את הגלולה ב-PBS. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת מלאי השלפוחית החוץ-תאית עם PBS קר כקרח ביחסים שונים כדי להשיג טווח ספירה סופי של 10 עד 100 ננו-חלקיקים למסגרת במהלך המעקב. הפעל את מכשיר ה-NTA והפעל את התוכנה הרלוונטית במחשב המחובר.

הכנס את החדר לארון הלייזר ולחץ על התחל מצלמה כדי להפעיל אותו. צייר מיליליטר אחד של PBS למזרק וחבר אותו לצינור הקדמי. שטפו היטב את מערכת הצינורות, וודאו שלא יישארו בועות אוויר בתא.

עקוב אחר המצלמה כדי לזהות בועות אוויר או חלקיקים מזהמים. כעת ערכו את דילול העבודה של השלפוחית החוץ-תאית המוכנה למזרק של מיליליטר אחד והזריקו אותו לתא. עבור לכרטיסיות הלכידה והעיבוד כדי להתאים את רווח המסך להתאמת בהירות הצג.

שנה את רמת המצלמה כדי לשפר את בידול הננו-חלקיקים על המסך. הגדר סף זיהוי מתאים בכרטיסיית התהליך כדי להבדיל בין חלקיקים לרעשי רקע. מקד את המצלמה באמצעות גלגל המיקוד בכל צד של המכשיר עד שננו-חלקיקים יופיעו חדים על המסך.

לאחר קביעת טמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס עבור כל המדידות בהגדרות החומרה, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידה. הקליטו לפחות שלושה סרטונים של 30 שניות כל אחד לכל ריצה לדוגמה. לחץ על שינוי כדי להזין את גורם דילול הדגימות, ולבסוף לחץ על ייצוא כדי לשמור את התוצאות.

באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, שלפוחיות חוץ-תאיות זוהו והודגמו על סמך בראוניז ותנועה. הניתוח חשף ריכוז חלקיקים ממוצע של 1.2 כפול 10 בחזקת 10 חלקיקים למיליליטר בפלזמה מאנשים בריאים המדגימים נוכחות של שלפוחיות חוץ-תאיות. הגודל הממוצע של שלפוחיות חוץ-תאיות בפלזמה נמדד ב-184.7 ננומטר, בהתאם למידות שלפוחית חוץ-תאיות טיפוסיות.