Циркулирующие внеклеточные везикулы в качестве биомаркеров являются относительно новой областью в исследованиях биомаркеров с огромным потенциалом. Наш протокол направлен на обеспечение практического подхода к обнаружению и обнаружению биомаркеров, связанных с внеклеточными везикулами, в условиях отделения неотложной помощи. Новые данные показали, что молекулярный груз, обнаруженный во внеклеточных везикулах и кровотоке, содержит белки и РНК, представляющие интерес для различных заболеваний.
Несколько новых внеклеточных везикул, замкнутых биомаркеров были связаны с диагностикой и прогнозом различных сердечно-сосудистых заболеваний. Основными проблемами в области открытия биомаркеров циркулирующих внеклеточных везикул являются сохранение внеклеточных везикул и получение плазмы в зависимости от динамики высвобождения ВВ. Таким образом, строгий протокол, встроенный в клиническую рутину, необходим для предотвращения деградации ВВ и поддержания воспроизводимых результатов, особенно при применении широкомасштабных методов анализа, таких как протеомика.
Открытие белковых биомаркеров, заключенных в циркулирующем ВВ, в значительной степени зависит от времени первоначального забора крови относительно появления симптомов и продолжительности хранения образца из-за естественной деградации ВВ. Этот протокол представляет собой практический протокол выделения ВВ плазмы и его внедрения в протеомный анализ, который должен быть интегрирован в клинический рабочий процесс отделения неотложной помощи. Наши предстоящие исследования будут сосредоточены на интеграции различных коллективов пациентов в нашу методологию, среди которых пациенты с декомпенсированной сердечной недостаточностью, аритмиями или кардиомиопатией тахикардии, а также лонгитюдные исследования пациентов, перенесших операцию шунтирования.
Используя этот протокол, мы стремимся идентифицировать новые биомаркеры, связанные с ВВ, способствующие диагностике и прогнозированию вышеупомянутых патологий. Для начала центрифугируйте плазму крови человека, используя ультрацентрифугу с ротором с фиксированным углом наклона без поломки. После того как мусор и апоптотическое тело осядут, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и ультрацентрифугу при 100 000 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия, не нарушая, чтобы изолировать внеклеточные везикулы.
Осторожно извлеките пробирку после ультрацентрифугирования. С помощью электронной пипетки аккуратно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно один миллилитр внеклеточных пузырьков обедненной плазмы. Переключитесь на пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы осторожно пипетировать оставшуюся плазму, не нарушая гранулу внеклеточного везикулы.
Постепенно наклоняйте трубку во время пипетирования, чтобы убедиться, что не осталось плазмы, и повторно суспендируйте гранулу в PBS. Затем разбавьте исходный раствор внеклеточных везикул ледяным PBS в различных соотношениях, чтобы достичь конечного диапазона подсчета от 10 до 100 наночастиц на кадр во время отслеживания. Включите прибор NTA и запустите соответствующее программное обеспечение на подключенном компьютере.
Вставьте камеру в лазерный гроб и нажмите на кнопку «Запустить камеру», чтобы активировать ее. Наберите один миллилитр PBS в шприц и подсоедините его к передней трубке. Тщательно промойте систему трубок, следя за тем, чтобы в камере не осталось пузырьков воздуха.
Следите за камерой, чтобы обнаружить любые пузырьки воздуха или загрязняющие частицы. Теперь наберите подготовленный внеклеточный везикулу рабочего разведения в одномиллилитровый шприц и введите его в камеру. Перейдите на вкладки захвата и обработки, чтобы настроить усиление экрана в соответствии с яркостью монитора.
Изменяйте уровень камеры, чтобы улучшить дифференциацию наночастиц на экране. Установите соответствующий порог обнаружения на вкладке «Процесс», чтобы отличить частицы от фонового шума. Фокусируйте камеру с помощью колеса фокусировки с каждой стороны прибора до тех пор, пока наночастицы не станут четкими на экране.
Установив постоянную температуру 22 градуса Цельсия для всех измерений в настройках оборудования, нажмите на кнопку «Запустить», чтобы начать измерение. Записывайте не менее трех видеороликов по 30 секунд каждое для каждого примера прогона. Нажмите «Изменить», чтобы ввести коэффициент разбавления проб, и, наконец, нажмите «Экспорт», чтобы сохранить результаты.
С помощью анализа отслеживания наночастиц были идентифицированы и визуализированы внеклеточные везикулы на основе домового и движения. Анализ выявил среднюю концентрацию частиц в 1,2 раза 10 в степени 10 частиц на миллилитр в плазме крови здоровых лиц, демонстрируя наличие внеклеточных везикул. Средний размер внеклеточных везикул плазмы был измерен на уровне 184,7 нанометров, что согласуется с типичными размерами внеклеточных везикул.
