קבוצת המחקר שלנו משתמשת במיטוכונדריה כמטרה פרמקולוגית לפיתוח מוצרים שונים כגון chemotheraputes, קוטלי חרקים, בין היתר. בסרטון זה אנו רוצים לתאר את המתודולוגיה להערכת אנזימים של הנשימה המיטוכונדריאלית בצורה נגישה, מובנת ושמישה יותר. במעבדה שלנו ביססנו פרוטוקול להערכת ההשפעות השונות של קסנוביוטיקה על מיטוכונדריה בחולדות, יתושים וקרציות, וסיפקנו כמה תובנות לגבי תגובה מיטוכונדריאלית ספציפית.
גישה זו תומכת בפורמולציה בטוחה ביולוגית של חומרי הדברה על ידי זיהוי הפרעות ביו-אנרגטיות מיטוכונדריאליות החיוניות למזעור רעילות שאינה מטרה. היתרון הדיפרנציאלי שלנו כולל פרוטוקול תכנון קוטלי חרקים שמתחיל בניתוח סיליקו של אלפי מולקולות, לאחר מכן אימות חוץ גופי של אלה העומדות בקריטריונים של ביטחון ביולוגי, ומסתיים בבדיקת in vivo. שיטה זו חוסכת זמן ומשאבים תוך הקפדה על שיטות עבודה מומלצות בייצור חומרי הדברה.
בטווח הבינוני, נבחר מולקולות טבעיות שניתן לשלב עם שינוי גנטי, המכוון למיטוכונדריה של חרקים, במטרה לשפר את הספציפיות והביטחון הביולוגי באורגניזמים שאינם מטרה. כדי להתחיל, הכינו 250 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה עם או בלי 0.2 גרם BSA. Aliquot 10 מיליליטר של החיץ לתוך צינור חרוטי קר כקרח.
לאחר המתת חסד של חולדה, נתחו את הכבד שלה לחלוטין והניחו אותו במאגר בידוד קר כקרח כדי לשטוף אותו. לאחר שתי שטיפות, טוחנים את רקמת הכבד במספריים חדים בצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של חיץ בידוד. הכניסו את התמיסה לצינור ההומוגנייזר של רקמת פוטר-אלווהיים כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה הטחונה לפחות 10 פעמים במהירות נמוכה של 390 סיבובים לדקה.
לאחר מכן, להעביר את הפתרון הומוגני לתוך צינור חרוטי צנטריפוגה ב 600 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים בזהירות את supernatant לתוך צינור חרוטי חדש. צנטריפוגה את supernatant שוב ב 7, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant וכתוצאה מכך.
השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית המבודדת בשני מיליליטר של חיץ בידוד ללא BSA. בדקו אם ביצי Aedes aegypti בוקעות במגשים עם מים מסוננים ללא כלור שבוע לפני הניסוי, ועקבו אחר תהליך ההתכה בזחלים. ברגע שהזחלים מגיעים לשלב L3, יש להמתין 12 שעות לכל היותר לפני איסופם.
בעזרת פיפטה של פסטר, אספו לפחות 100 זחלי Aedes aegypti בכוכבים L3 עד L4 בכ-30 מיליליטר מים נטולי כלור. לאחר הסינון, להעביר את הפתרון עם הזחלים לתוך צינור הומוגנייזר רקמות Potter-Elvehjem הומוגניזציה בזהירות בערך 390 סיבובים לדקה לפחות 10 פעמים. מעבירים את הרקמה ההומוגנית דרך מזרק צמר זכוכית כדי לסנן שאריות שלד חיצוני גדול.
כדי להתחיל, להשיג מיטוכונדריה כבד חולדה הומוגני Aedes aegypti L3, L4 זחלים. לבדיקת פולרוגרפיה, כייל את הרספירומטר ברזולוציה גבוהה בכל יום לפני תחילת כל בדיקה, בהתאם להוראות היצרן. הוסף תווך תגובה לתאים, ומבטיח עודף של לפחות 0.2 מיליליטר מעל נפח תא הניסוי הסטנדרטי של שני מיליליטר.
נטרו את צריכת החמצן כדי למדוד NADH ופעילות חמצון סוקצינאט לאחר הוספת מאגר תגובה, 0.1 מיליגרם חלבון והמצע. המתן עד שאות ריכוז החמצן יתייצב ורשום אותו. הוסף מעכבי חלבון הובלת אלקטרונים לתא כדי לאשר כי צריכת החמצן שנצפתה נובעת משרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.
עבור פעילות NADH dehydrogenase, תחילה להכין את מערכת התגובה המכילה את כל המרכיבים הדרושים ולהוסיף את ריאגנטים לתא ספקטרופוטומטר. עקוב אחר פעילות NADH dehydrogenase עם הפחתת אשלגן פרוציאניד ב 420 ננומטר. השתמש במקדם ההכחדה המולרי של 1.04 למילימולר לסנטימטר כדי לחשב ריכוז.
לבסוף, חלקו את הפעילות המדווחת בריכוז החלבון המשמש להשגת פעילות האנזים הספציפי. באופן דומה, להעריך succinate dehydrogenase ו cytochrome c reductase או פעילות III מורכבת באמצעות תערובות תגובה מתאימות. כדי למדוד פעילות ציטוכרום c אוקסידאז או קומפלקס IV, הכינו את מערכת התגובה וערבבו כמויות מולריות שוות של ציטוכרום c ונתרן דיתיוניט, מה שמבטיח הפחתה מלאה.
העבירו את התערובת המופחתת דרך עמודת ג'ל דקסטרן צולבת באמצעות מאגר הפוספט כשלב הנייד. כמת את השברים שנאספו ב 550 ננומטר בספקטרופוטומטר. לבסוף, לחשב את הריכוז עם מקדם הכחדה מולארי של 19.8 למילימולר לסנטימטר, תוך יישום חוק באר.
חלק את הפעילות המדווחת לפי ריכוז חלבון לקבלת תוצאות ספציפיות של פעילות אנזימים. Cavacrol ב-9.7 חלקים למיליון הפחית את פעילות NADH oxidase בכ-9.35% ואילו שמן אתרי Cymbopogon flexuosus, או EO, ב-10 חלקים למיליון הפחית את חמצון NADH והפחתת חמצן בכ-34%, מה שמצביע על עיכוב במעבר אלקטרונים בין קומפלקס I לקומפלקס IV.Cavacrol הפחית את פעילות האוקסידאז סוקצינאט בכ-10.84% בזחלי Aedes aegypti, ו-Cymbopogon flexuosus EO הפחית את פעילות סוקצינט אוקסידאז בשיעור של עד 50% במיטוכונדריה של כבד חולדה מבודד, מה שמרמז על עיכוב בין קומפלקס II לקומפלקס IV.Cavacrol הפחית את פעילות NADH cytochrome c reductase ואת חמצון ציטוכרום c והפחתת חמצן בקומפלקס IV בזחלי Aedes aegypti, ואילו Cymbopogon flexuosus EO הפחית את פעילות cytochrome c oxidase בכ-58% במיטוכונדריה של כבד חולדה.
