שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הכימיה האנליטית, הביוכימיה והביוטכנולוגיה. כגון, מהם השינויים המתרחשים בביוסינתזה של הקפאין. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שזה יכול להיות מיושם על מודלים צמחיים invitro המייצרת קפאין.
כדי להתחיל, להוסיף 10 מיליליטר של אצטון לתאים lyophilized, ולאטום את הבקבוק לפני ערבוב עם מערבל מערבולת במשך 30 שניות. לאחר מכן, מערבבים את המדגם ב 100 סל"ד עם מסובב במשך חמש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את המדגם עם 25 microliters של אצטון.
ראשית, להחיל מיקרוליטר אחד של תמצית קפאין מוכן בעבר על צלחות ג'ל סיליקה. לאחר מכן, לפתח את TLC בתא כרומטוגרפיה עם 10 מיליליטר של השלב הנייד, אצטון cyclohexane. דמיינו את רצועות הקפאין באולטרה סגול באורך גל קצר, עם מנורת UV קומפקטית.
לאחר מכן, לכמת את רמות הקפאין על ידי densitometry ב 273 ננומטר. באמצעות נייר סינון, ואקום לסנן את השעיית התא שהוכן בעבר. לאחר מכן, להשתמש מרגמה חרסינה כדי macerate מדגם התא, עם חנקן נוזלי RNA בידוד reagent, עד שהוא הומוגני.
לאחר מכן, להעביר 500 microliters של המדגם לצינור מיקרו צנטריפוגה מיקרו סטרילי. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של אלכוהול isoamyl כלורופורם, ו 300 microliters של פנול שיווי משקל. מערבבים את המדגם עם מערבל מערבולת וצנטריפוגה אותו ב 20, 000G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להעביר 300 microliters של השלב העליון לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של isopropanol ו דגירה הצינור במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס שלילי. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול לכדור.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 12, 000G במשך 10 דקות ו decant השלב הנוזלי. לאחר מכן, ייבשו את הדגימה למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את תמצית RNA עם 25 microliters של מים שטופלו DEPC.
ראשית, להוסיף שני מיקרוגרם של תמצית RNA הכולל לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר תגובה 10X ומיקרוליטר אחד של DNase. הביאו את הנפח הסופי של התגובה ל-10 מיקרוליטרים עם מים שטופלו ב-DEPC.
לאחר מכן, מערבבים את הדגימה ואת הצנטריפוגה ב 2, 000G לדקה אחת. לאחר מכן, הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של 50 דיסודיום מיקרומולר דימין טטראקטט, כדי לעצור את התגובה.
דגירה המדגם ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להחיל 100 ננוגרם של RNA על ג'ל אגרוז ולהפעיל את הג'ל. דמיינו את שלמות ה-RNA באמצעות מערכת תיעוד תמונות ג'ל.
ראשית, להוסיף 2.5 מיקרוגרם של RNA הכולל לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פריימר אוליגו deoxythymidine ולמלא את הצינור לנפח סופי של 13 microliters עם מים ללא גרעין. מערבבים את הדגימה וצנטריפוגה זה ב 2, 000G לדקה אחת.
דגירה המדגם ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז בארבע מעלות צלזיוס לשתי דקות. לאחר מכן, להוסיף ארבעה microliters של מאגר תגובה 5X, שני microliters של תערובת dNTP ומיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך לדגימה.
לאחר מכן, מערבבים את הדגימה בעדינות צנטריפוגה ב 2, 000G במשך דקה אחת. לאחר מכן, דגירה המדגם ב 45 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות, ולאחר מכן ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הוסף 7.5 מיקרוליטרים של פולימראז DNA 2X Taq ו 0.1 micromoles של RAX, לצינור מיקרו צנטריפוגה PCR.
לאחר מכן, להוסיף 0.75 microliters כל אחד קדימה ולהפוך פריימר כדי להגביר את הגן CCS1. לאחר מכן, הוסף 600 ננוגרם של תבנית CDNA. צור מראש את תגובת ההגברה ב- PCR בזמן אמת כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת PCR. לשקול גרם אחד של חומר סלולרי ולארוז אותו בנייר אלומיניום. לאחר macerating המדגם, להעביר אותו בקבוקון זכוכית ולהוסיף 2.5 מיליליטר של חיץ החילוץ.
לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 20, 000G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 500 מיקרוליטרים לבקבוקונים קריוגניים. עם ספקטרופוטומטר, למדוד את ריכוז החלבון של המדגם ב 562 ננומטר באמצעות מבחן חומצה ביצינצ'ונית, עם אלבומין סריק שור כסטנדרט.
ראשית, להכין את תערובת התגובה בצינור מיקרו צנטריפוגה, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להגדיל את הנפח הכולל ל 200 microliters עם 100 מילימולאר טריס HCL. זכור, זה הכרחי עבור הבטיחות שלך כדי לעקוב אחר אמצעי זהירות נאותים במהלך הכנת תערובת התגובה עם חומר רדיואקטיבי.
שמור את צינור המיקרו צנטריפוגה על קרח ולהוסיף נפח של השבר המסיס, המכיל שבעה עד תשעה מיליגרם של חלבון. לאחר מכן, מערבולת את התערובת ואת הדגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות ב 11, 000G במשך חמש דקות.
לאחר מכן, בזהירות לשחזר נפח של 900 microliters, ולהעביר את הדגימות לבקבוקון scintillation. לאחר מכן, להתאדות את הכלורופורם כדי להשלים יובש במכסה המנוע בטמפרטורת החדר. מוסיפים חמישה מיליליטר של נוזל תבליט לבקבוקון.
לבסוף, לנתח את הרדיואקטיביות משולבת לתוך הקפאין באמצעות מונה scintillation. בפרוטוקול זה, דפוס הספיגה לקפאין נותח באמצעות צפיפות TLC, דרך ספקטרום האור הנראה, וקריאה בספיגה מקסימלית של 273 ננומטר. עקומת ההפרדה של קפאין על צלחת TLC, הראה RF בין 0.34, ו 0.39.
ה- RNA הנגזר מתאים מושעים מציג הפרדות ברורות של 28, 18 ו- 5s RRNA, המציין כי הדגימות היו באיכות גבוהה. לבסוף, עקומת התכה הושגה מניתוח QPCR, מראה מוצר הגברה יחיד עבור הגן סינתאז קפאין. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביוטכנולוגיה והביוכימיה לחקור את תרבות הרקמה המשנית של חילוף החומרים מקפה, תה וקוקו.
אל תשכח כי עבודה עם רדיואקטיביות ופתולוגיה מולקולרית יכולה להיות מסוכנת ביותר, ואמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות, משקפי מגן וציוד מיוחד לחומר רדיואקטיבי תמיד יילקחו בעת ביצוע הליך זה.
