פיתחנו בדיקה רגישה וכמותית מבוססת תרבית תאים שניתן להשתמש בה כדי להעריך איתות קיפוד סוני, המועבר בעיקר דרך הריסים הראשוניים. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לבחון שינויים גנטיים ואפיגנטיים, הקשורים לתפקוד לקוי של ריסים ראשוניים. למרות התפקיד המרכזי של ריסים ראשוניים באיתות קיפוד סוני, המתודולוגיות הנוכחיות לרוב חסרות את הרגישות הנדרשת כדי להעריך את תפקוד הריסים הראשוניים תחת שינויים גנטיים.
פרוטוקול זה ממלא את הפער הזה על ידי מתן בדיקה מבוססת תרבית תאים, המחקה את הפעלת Sonic Hedgehog וביטוי גן המטרה של Sonic Hedgehog בתאים ריסניים. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, כגון לוקליזציה של חלבון מוחלק לאורך הריסים הראשוניים עם הפעלת מסלול Sonic Hedgehog, הבדיקה שלנו היא כמותית, קלה למעקב ורגישה מכיוון שהיא מבוססת על תרבית תאים. כדי להתחיל, הסר את בקבוק תרבית התאים T25 המכיל תאי RPE-1 כמעט מתלכדים הגדלים בחמישה מיליליטר של מדיום שלם מאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
השליכו את מדיום התרבית מבקבוק תרבית התאים והעקרו את התאים בפעילות אנזימטית של תמיסת טריפסין-EDTA מחוממת מראש של 0.25%. השעו מחדש את התאים בבקבוק באמצעות מדיום שלם שחומם מראש. ספור את התאים על המוציטומטר כדי לקבוע את צפיפות התאים של המתלה.
מניחים שני פתקי כיסוי סטריליים של 12 מילימטר לשתי צלחות תרבית תאים בגודל 35 מילימטר. זרע פעמיים כפול 10 בחזקת חמישה תאי RPE-1 הגדלים באופן אסינכרוני בכל צלחת המכילה פתקי כיסוי. מוסיפים שני מיליליטר מדיום שלם לכל מנה ומגדלים את התאים למשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, הסר את המדיום מתאי ה-RPE-1 הגדלים ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של מאגר DPBS שחומם מראש. הוסף שני מיליליטר של מדיום DMEM שחומם מראש המכיל 1% סטרפטומיצין פניצילין ללא FBS לכל מנה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.
למחרת, החלף את המדיום במדיום רעב לסרום המכיל אגוניסט מוחלק בריכוז סופי של 250 ננו-מולר. דגרו על התאים למשך 24 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, העבירו את החלקות הכיסוי לצלחת של 24 בארות, והניחו החלקת כיסוי אחת בכל באר.
הוסף 0.5 מיליליטר מתנול צונן לכל באר כדי לתקן את התאים. דוגרים את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שטפו מיד את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר מאגר כביסה.
השליכו את המדיום מהכלים. הוסף 0.5 מיליליטר מגיב TRIzol ישירות לכל מנה. מחלקים את המגיב באופן שווה ונותנים לו לעמוד חמש דקות.
פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית ולאסוף אותה בצינורות מיקרוצנטריפוגה נטולי נוקלאז של 1.5 מיליליטר הוסף 0.1 מיליליטר כלורופורם לכל צינור המכיל תאים מעורבים בטריזול שטופלו באגוניסט מוחלק ו-DMSO. דגרו את הצינורות במשך שתיים-שלוש דקות לפני הצנטריפוגה ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי המכיל את ה-RNA לצינורות מיקרו-צנטריפוגות טריים.
הוסף 0.25 מיליליטר איזופרופנול לשלב המימי ודגר את הצינורות למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב-12,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שימו לב להיווצרות כדור RNA לבן דמוי ג'ל.
השליכו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת מיקרופיפטה. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור ה-RNA ב-0.5 מיליליטר של אתנול 75% מדולל טרי. מערבל בקצרה את הצינורות כדי להבטיח ערבוב.
צנטריפוגה את הדגימות ב-7,500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת מיקרופיפטה. יבש את כדורי ה-RNA באוויר למשך 10 דקות.
השעו מחדש את הכדורים ב-25 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. מדוד את ריכוז ה-RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ב-260 ננומטר. השתמש באחד עד שלושה מיקרוגרם של RNA כולל מכל דגימה כדי לסנתז cDNA בהתאם להוראות היצרן לערכת סינתזה של cDNA.
הגדר את תגובות ה-qPCR בשלוש עותקים באמצעות cDNA מדולל של אחד לחמישה מכל דגימה עם ערכות פריימר של גנים GLI1, PTCH1, HHIP, SMO ובטא-אקטין, עם תערובת מאסטר qPCR בצלחת PCR מרובת בארות ורגישה לפלורסנט. מכסים את לוחית ה-PCR בסילר מתאים. הנח את הצלחת במכשיר qPCR.
הפעל את תוכנית ה-qPCR הסטנדרטית עם 40 מחזורי הגברה, ולאחר מכן ניתוח עקומת התכה. לאחר הריצה, בדוק את עקומת ההיתוך של כל אמפליקון לשיא בודד בטמפרטורה הרצויה. ייצא את נתוני ההגברה לגיליון אלקטרוני.
חשב את הביטוי היחסי של כל תעתיק על ידי נורמליזציה כנגד ביטוי בטא-אקטין, שרטט את נתוני הביטוי היחסי בגרף וחשב את המובהקות הסטטיסטית של השינויים בביטוי באמצעות מבחן t לא מזווג. רוב התאים הרעבים לסרום הרכיבו ריסים ראשוניים עם יותר מ-85% ריסים. במצב זה, רמות הביטוי של GLI1, PTCH1 ו-HHIP עלו משמעותית בתאים שטופלו באגוניסטים חלקים בהשוואה לתאים שטופלו ב-DMSO, בעוד שרמות תעתיק SMO לא הראו שינוי משמעותי.
