This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

תרבות 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הטלומרז אנושי הפוך transcriptase (hTERT) תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית הונצחו (hTERT-RPE1; המכונה כאן RPE1). הערה: תאי RPE1 הם תאים קרובים דיפלואידי, שאינו הופכים אדם שמשמשים בדרך כלל כדי ללמוד הרכבה צנטריול וciliogenesis. תאים אלה בצעו מחזור שכפול צנטריול נורמלי מתואם עם מחזור תא מוסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר מנה כמעט ומחוברות 100 מ&quot;מ תרבית תאים של תאי RPE1 ב 1: 5 דילול של התרבות המקורית לתוך צלחת 100 מ&quot;מ טריים המכילה 10 מיליליטר של DME / F-12 (1: 1) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין G ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (הבינוני המלאה נקרא כDME / בינוני F-12). לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips זכוכית העגולה 12 מ&quot;מ ב 50 מיליליטר של 1 N HCl בכוס זכוכית מכוסה, O / N בלי לרעוד, ב 60 ° C באמבט מים או בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> After השלכת פתרון החומצה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ב 100 מיליליטר מים מזוקקים על ידי דוגרים למשך 15 דקות, כאשר מדי פעם טלטול. חזור על הכביסה באופן דומה, בשנת 70% אתנול ו -95% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ידי בנפרד הפצה אותם על נייר סופג מעבדה בארון בטיחות ביולוגית, ואחריו עיקור בקרינת UV במשך 60 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2-4 coverslips היבש בצלחת תרבית תאי 35 מ&quot;מ. לדלל את הפתרון של פיברונקטין או פיברונקטין כמו פולימר מהונדס (ריכוז מניות של 1 מ&quot;ג / מיליליטר) לריכוז של 25 מיקרוגרם / מיליליטר בתרבית תאי PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 80-100 μl של הפתרון המדולל על coverslip כל דגירה במשך 60 דקות למעייל בצד העליון של coverslip. שטוף את coverslips שלוש פעמים באמצעות PBS לפני הוספה בינונית מלא. </li></ol></li></ol> 2. תאי גידול ותאי טיפול עם מעכבי פרוטאזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר 2 x 10 5 אסינכרוני לגדולתאי ing RPE1 בכל מנה 35 מ&quot;מ המכילים coverslips ולגדול התאים 2 מיליליטר בינוני מלא. החלף את מדיום התרבות כל שעות 24 עם בינוני מלא מראש חימם טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההשפעה של עיכוב הפרוטאזום ברמת centrosomal של חלבון הבדיקה (כאן VDAC3 או γ טובולין), לגדול התאים בשתי מנות 35 מ&quot;מ במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום להשלים ולהוסיף גם MG115 או DMSO כממס שליטה בריכוז סופי של 5 מיקרומטר או 0.05% בהתאמה. באותו הזמן, להוסיף BrdU לתאים בריכוז סופי של 40 מיקרומטר ודגירת תאים במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל coverslip בצלחת 24 גם. להוסיף מתנול 500 μl המצונן היטב כל אחד ודגירת הצלחת ב -20 ° C במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים על coverslips. מייד לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם 500 חיץ לשטוף μl (1x PBS המכיל 0.5 מ&quot;מ MgCl 2 ו 0.05% Triton-X 100). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השיירתאים מצלחת 35 מ&quot;מ ו צנטריפוגות התאים XG ב 1000 במשך 5 דקות. השתמש בתא גלולה לנתח את החלבון הכולל ידי מערבי סופג (שלב 6). </li></ol> 3. דופק BrdU וצ&#39;ייס Assay לנתח רמות חלבון בשלבי Cell Cycle שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הווריאציה של רמת חלבון (כאן VDAC3, Sas6 או Cep135) בcentrosomes בשלבים שונים של מחזור התא, תאים לגדול בשתי מנות של 35 מ&quot;מ המכילות coverslips במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום מלא המכיל 40 מיקרומטר BrdU דגירה התאים במשך 4 שעות בתרבית תאי החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלחת אחת, להעביר את coverslips לצלחת 24 גם כדי לתקן את התאים באמצעות מתנול הצונן כמתואר בשלב 2.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי דופק BrdU 4 שעות, להסיר את המדיום המכיל BrdU, לשטוף את התאים פעם עם PBS ופעם עם מדיום להשלים, להוסיף בינוני טרי, ולאחר מכן לגדול התאים בהעדר BrdU לזמנים שונים (בדרך כלל עוד 4 שעותלתאי RPE1) לפני תיקון התאים כמתואר בשלב 2.1.2. הערה: לתאי RPE1, רוב תאי BrdU חיובי נמצאים בS מאוחר או G2-שלב אחרי מרדף 4 שעות. זה צריך להיקבע באופן עצמאי לכל סוג תא. </li></ol> 4. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים הקבועים על coverslips ב -200 μl חיץ חסימה (BSA 2% ו -0.1% TritonX-100 ב 1x PBS) למשך 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם שילוב של נוגדנים ראשוניים (בדרך כלל אחד וגדל ארנב ועוד גדלו בעכבר) בדילול מלא בחסימת O החיץ / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך תא humidified, לשים נייר מגבת רטובה בחצי התחתון של תיבת קצה פיפטה 1,000 μl ריקה. הנח רצועת Parafilm על פני השטח המדף, ולזהות אגל (15-20 μl) של פתרון הנוגדן על Parafilm עבור כל coverslip להיות מודגרות. היפוך coverslip על טיפה של פתרון נוגדן (כך שתאים שקועים) וקרובמכסה קופסא הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך coverslips שוב ולהחזיר אותם בחזרה לצלחת 24 גם. לשטוף coverslips ואז דגירה אותם בתערובת 150 נוגדנים משני μl (כאן צבע נגד ארנב מצומדות ירוק-ניאון וצבע אדום-ניאון אנטי עכבר מצומדות דילול בחסימת מאגר) במשך שעה 1 ב RT. שטוף את coverslips שלוש פעמים. הערה: הנוגדנים משני fluorophore מצומדות הם רגישים לאור. להגן על הדגימות מן האור במהלך שלבים 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לצביעה נגד BrdU על ידי תיקון תאי RPE1 המוכתם שוב עם מתנול המצונן 500 μl ב -20 ° C למשך 10 דקות, כמתואר בשלב 2.1.2. שטוף את coverslips שלוש פעמים. הערה: קיבעון זה מאבטח את תיוג הנוגדן הראשוני והמשני של החלבון (ים) של עניין בתהליך הידרוליזה החומצה בשלב הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב -200 μl של 2 N HCl למשך 30 דקות ב RT. לנטרל עם 300 μl של 1 M טריס-Cl, pH 8ד לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את התאים שוב באמצעות 200 μl חיץ חסימה למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדן אנטי BrdU חולדה (בדילול בחסימת מאגר) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified. להחזיר את coverslips חזרה לצלחת 24 גם, לשטוף אותם ולאחר מכן דגירה עם נוגדן כחול-ניאון הצבע מצומדות אנטי-עכברוש המשני (בדילול מלא 150 μl חיץ חסימה בצלחת 24 גם עבור שעה 1 ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים. ספוט אגל (בערך 3-6 μl) של פתרון הרכבה המכיל antifade מגיב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. היפוך coverslip, עם התא בצד פונה כלפי מטה, על פתרון ההרכבה. נגב נוזל עודף בעדינות על ידי לחיצה על coverslip נגד השקופית באמצעות רקמות רכות ניקוי. החל לק שקוף בשולי coverslip כדי לאטום אותו לשקופית מיקרוסקופ. </li></ol> תמונת Immunofluorescence 5. Acquisition וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטרת 100X תכנית Apo טבילת שמן (עם צמצם מספרי 1.4) לרכישת התמונות של תאי RPE1 BrdU חיובי בטמפרטורת הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות במיקרוסקופ (ראה ציוד) מצורף עם מצלמה מסוגלת הדמיה דיגיטלית. עבור כל fluorophore, לקבוע את זמן החשיפה המתאים (בדרך כלל בין 300-1,000 אלפיות שני) על ידי בחינת אופן ידני את כל דוגמאות של ניסוי. לפני רכישת תמונות של תא, לקבוע באופן ידני העליון המתאימות ומישור מוקד תחתון לאורך ציר Z-(בדרך כלל 0.2 מיקרומטר גודל צעד). לרכוש תמונות של מדגמים שונים שנמצאים על coverslips הנפרד באמצעות זמן חשיפה זהה לfluorophores שונה לאורך ציר Z-שימוש בחבילת תוכנת הדמיה מיקרוסקופית דיגיטלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע deconvolution (במקרים אלה באמצעות אלגוריתם לא השכן) של כל ערימות התמונה שנרכשו לאורך ציר Z-. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הקרנת העצמה הכוללת של כל ערימת תמונה לאורךZ-הציר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאים שבם centrosomes קרוב (מרחק בין שתי centrosomes הוא פחות מ -2 מיקרומטר), לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 20-30 פיקסלים לכל צד) סביב שני centrosomes וסמן את השטח שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר ריבוע גדול יותר (בדרך כלל 24-35 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר לכיכר הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה (S מציין קופסא קטנה וL מציין קופסא גדולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של כל fluorophore באמצעות הנוסחא שתוארה על ידי Howell et al 29:. F = F S - [(L F - F S) x S / (L - S)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את עוצמת הקרינה המנורמלת של החלבון של עניין (כאן VDAC3 או Sas6) על ידי חישוב יחס עוצמת הקרינה מתוקן רקע fluorophore לזה של fluorophore משמש להתקן שנבחר על פנימי (כאן γ טובולין, Sas6 או Cep135). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ניתוח תאים בי centrosomes מופרדים היטב (מרחק בין שתי centrosomes יעלה על 2 מיקרומטר), לנתח כל centrosome בנפרד על ידי ציור שתי קבוצות נפרדות של תיבות. לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 15-25 פיקסלים לכל צד) סביב כל centrosome וסמן את השטח שנבחר. לצייר ריבוע גדול יותר (20-30 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה, ולחשב את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל fluorophore, בנפרד עבור כל centrosome, כמתואר בשלב 5.3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל חלבון משני centrosomes להשיג את רמת centrosomal הכוללת של חלבון שבתא ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגעוצמה מנורמלת לחלבון של עניין על ידי חישוב יחס עוצמת centrosomal הכוללת שלה לעצמת centrosomal הכוללת של התקן הפנימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח לפחות 15-25 תאים לכל תנאי ניסוי ואת העלילה הגרף בגיליון אלקטרוני. </li></ol> 6. ניתוח החלבון סה&quot;כ שימוש סופג מערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי assay radioimmunoprecipitation חיץ (ריף) המכיל pH 50 מ&quot;מ טריס-HCl 8, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% P-40, 1% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet (SDS) ודגירה של 10 דקות על קרח לlyse התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 10,000 XG במשך 10 דקות, להפריד את lysate מחלק גלולה ולמדוד את ריכוז החלבון הכולל של כל lysate באמצעות ערכת assay חומצת bicinchoninic (BCA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 40 מיקרוגרם של lysate עם חיץ 4x SDS-PAGE טעינה (50 מ&quot;מ טריס-Cl, pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 100 מ&quot;מ dithiothreitol, ברום 0.1%ophenol כחול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את הדגימות למשך 10 דקות ולהפעיל את הדגימות על 12.5% ​​denaturing SDS-PAGE במתח קבוע של 200 V. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מופרדים על SDS-PAGE על קרום nitrocellulose באמצעות טכניקה מערבית סופג (במתח קבוע של 90 V עבור שעה 1 בקור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם חלב 3% דל שומן ב1x PBS, ולאחר מכן דגירה הקרום עם פתרונות של נוגדנים עיקריים בדילול מלא (במקרה ארנב נגד VDAC3, אנטי-α-טובולין ארנב נגד γ טובולין ועכבר זה) ל1 שעות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הקרום שלוש פעמים (כל אחד דגירה 5 דקות תחת רועד) באמצעות חיץ PBS-T (1x PBS ו -0.2% Tween-20), דגירה הקרום בתערובת של קרוב אינפרא אדום-צבע פלואורסצנטי (IR) נגד ארנב מצומדות ו נוגדני צבע פלואורסצנטי IR מצומדות אנטי עכבר משניים (בדילול מלא PBS-T) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ולאחר מכן לסרוק את הקרום לנתח את הלהקות באמצעות f אינפרא אדוםמערכת ההדמיה luorescence מתאימה לזיהוי immunoblot. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li>
<li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li>
<li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li>
<li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1%3A+defensible+or+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9(2011).</li>
<li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976(2009).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP+proteins%3A+the+knights+of+centrosome+dynasty%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li>
<li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li>
<li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li>
<li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li>
<li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li>
<li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li>
<li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li>
<li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li>
<li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li>
<li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li>
<li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li>
<li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287(2002).</li>
<li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291(2011).</li>
<li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li>
<li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened%3A+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li>
<li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores%2C+along+spindle+fibers%2C+and+at+spindle+poles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li>
<li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li>
<li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP%2C+and+is+required+for+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li>
<li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome%3A+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li>
<li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li>
<li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li>
<li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li>
<li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li>
<li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מיקרוסקופיה כמותי בביולוגיה של תא היא נפוצה הקשורים מבחני Live- תא הדמיה כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג), שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), וכו &#39;עם זאת, יש דוגמאות הולך וגדל של ביולוגים של תא פיתוח מבחני כמותיים מיקרוסקופיה שונות לקבועים תאים בשנים האחרונות <sup...

Centrosomes מורכב של זוג centrioles מוקף חומר pericentriolar (PCM). להיות המרכזים המארגנים microtubule הגדולות (MTOCs) בתאי יונקים, centrosomes לשמש כשני הקטבים של צירים mitotic בתאים מתחלקים, ובכך לסייע לשמור על שלמות הגנומי 1. בתאים שקטים (לדוגמא, בשלב G0), אחד משני centrioles של centrosome, כלומר צנטריול אמא, הופך לגוף בסיסי להרכיב cilium העיקרי, אברון חושי הבולט החוצה מתא השטח 2. ברגע שהתאים להזין מחדש את מחזור התא, cilia העיקרי מפורק וכל צנטריול מכוון את ההרכבה של procentriole בקצה הפרוקסימלי שלה שמתארך בהדרגה ליצירת צנטריול בוגר 3. בתחילת S-שלב, מבנה דמוי גלגלון-המספק הסימטריה 9 פי לצנטריול נוצר על פני השטח של כל צנטריול הקיים ויהפוך את הבסיס של כל procentriole. t Sas6כובע הוא הכרחי להרכבת צנטריול מגויסת כדי ליצור את הרכזת של גלגלון 4-6. לאחר מכן חלבוני centriolar אחרים הם התאספו על גלגלון בפיקוח הדוק, הפרוקסימלי לאופן דיסטלי 7. לאחר שסיים בדיוק כפילות צנטריול, תאים להרכיב חומרי pericentriolar נוספים לבניית שתי centrosomes פונקציונלי בסוף שלב G2 8. בנוסף לרכיבי ליבת centriolar 9-11, כמה חלבונים אחרים, כולל קינאז, phosphatases, מלווים, רכיבי פיגום, חלבונים הקשורים קרום ומכונות השפלה משויך centrioles, גופים בסיסיים וPCM בזמנים שונים של מחזור התא 12-16. הוא ציין כי לעתים קרובות רמות centrosomal של חלבונים רבים מוסדרות באופן זמני על ידי מנגנוני מיקוד centrosomal ו / או השפלה proteasomal בcentrosomes. חשוב לציין, התנודות ברמת centrosomal של כמה חלבונים כגון Plk4, Mps1, Sas6, וCP110נקודות שונות t של מחזור התא נראית חיוני להסדיר הרכבה צנטריול 5,17-22, ובמקרה של Mps1 מניעת השפלה centrosomal זה מוביל להיווצרות של centrioles העודף 19. מצד השני, השברים centrosomal של כמה חלבונים הם פחות יציבים בהשוואה לבריכות cytosolic. לדוגמא siRNA בתיווך למטה ויסות של Centrin 2 (Cetn2) הוביל לירידה מתונה בלבד של רמת החלבון בcentrioles למרות ירידה גדולה ברמות התא כולו 23. לכן זה חיוני כדי למדוד את השינויים ברמה של חלבוני centrosomal בcentrosome ולא מדידת רמות חלבון תא כל עת הערכת פונקציות centrosome הספציפית שלהם. במחקר זה פיתחנו assay באמצעות immunofluorescence העקיף (IIF) לכמת את הרמה היחסית של חלבון בcentrosomes. assay זו פותח במיוחד לאבחון תאים שנמצאים ממדגמים שוניםולכן לא יכול להיות צילם באותו הזמן. דגימות אלה יכולים להיות תאים שטופלו בחומרים כימיים שונים (כלומר, תרופה לעומת קבוצת ביקורת), שנאספו בנקודות זמן שונות (כלומר, דופק לעומת מרדף), או נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן מתאים לחלבון באזור קטן ולנרמל את הערך שנגד אותם לחלבון אחר שרמות לא להשתנות תחת תנאי ניסוי נבחרו. מספר מחקרים בביולוגיה centrosome לאחרונה נצלו טכניקות שונות כמותי מיקרוסקופיה, בשני תאי החיים או קבועים, כדי לקבוע את פונקצית centrosome הספציפית של חלבוני מועמד 24-27. בדומה למבחנים אלה, הטכניקה הנוכחית גם מודדת את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של חלבון המבחן. עם זאת, ההכללה של הנורמליזציה באמצעות תקן פנימי בassay זה היית צפוי להציע יותרדיוק וביטחון בניתוח שני מדגמים שונים שנמצאים בשני coverslips שונה. יתר על כן, בנוסף לבחינה של רמת החלבון בcentrosomes, עם התאמות קלות בשיטה זו יכולה להיות מיושמת על קבוצה מגוונת של תנאי ניסוי או באתרים סלולריים אחרים. כאן, אנו משלבים assay מיקרוסקופיה הכמותי שלנו עם אסטרטגית דופק מרדף BrdU להשוות תאים משלבי מחזור התא שונים. במקום להשתמש בטכניקות עצירת מחזור התא סטנדרטית ושחרור ללמוד נקודות שונות בזמן מחזור התא, תאים גדלו באופן אסינכרוני מודגרת עם BrdU לתייג תאים בS-שלב, והתאים שכותרתו נרדפים לזמנים שונים (בדרך כלל 4-6 שעות). רוב התאים שכותרתו יהיה בשלב S-מייד לאחר הדופק. אורכו של המרדף נבחר כך שלאחר המרדף, תאים שכותרתו יהיו בS, G2, או מיטוזה מאוחר, אשר יכול להיות מאומת על ידי מאפיינים מורפולוגיים עמדת As- כזה של centrosomes ביחס לnucליי, מרחק בין centrosomes, עיבוי של כרומוזומים וכו &#39;לכן, לאורכו של המרדף תלוי במח&quot;מ של S, G2 ושלב M של סוג תא מסוים. מאז גישה זו נמנעת מעכבי מחזור התא כגון hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, וכו &#39;, זה מאפשר יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ניתוח מחזור התא. לפיכך, אנו מראים כאן שassay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותית בלבד, או בשילוב עם assay דופק המרדף BrdU, הוא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי למדוד במדויק את השינויים יחסי ברמת centrosomal של חלבון מועמד במהלך מחזור תא מוטרד. מדדנו את רמת centrosomal של VDAC3, חלבון שזיהינו לאחרונה בcentrosomes בנוסף למיטוכונדריה 16,28, באמצעות מבחני אלה. תוצאות שהתקבלו כאן לאמת התצפית הקודמת שלנו שברכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה, וגם משתנה בdependen מחזור התאאופן t 16, יתר על כן אימות תחולתה של שיטה זו.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock of 1 mg/ml in water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF blocking buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&amp;nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rat monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H&amp;amp;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland antibodies</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Round coverslips 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 numerical aperture</td></tr><tr><td>Slidebook software package</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Centrosomes הם אברונים קטנים אך חשובים, המשמשים כקטבים של ציר mitotic כדי לשמור על שלמות הגנומי או להרכיב cilia העיקרי כדי להקל על פונקציות חושיות בתאים. רמת חלבון עשויה להיות מוסדרת באופן שונה בcentrosomes מאשר במקומות אחרים .cellular, והשינוי ברמת centrosomal של כמה חלבונים בנקודות שונות של מחזור התא נראה חיוני לוויסות הנכונה של ההרכבה צנטריול. פיתחנו assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים המודד שינויים יחסי ברמת חלבון בcentrosomes בתאים קבועים ממדגמים שונים, כגון בשלבים שונים של מחזור התא או לאחר טיפול בחומרים כימיים שונים. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן המתאימה לחלבון באזור קטן, ולנרמל את המדידה שנגד אותם לחלבון אחר שאינו משתנה על פי ג הניסיוני נבחרondition. ניצול assay זה בשילוב עם דופק BrdU ואסטרטגיה מרדף ללמוד מחזורי תא מוטרדים, יש לנו כמותית תוקף התצפית האחרונה שלנו כי בריכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת בcentrosomes במהלך מחזור התא, סביר להניח בשפלה בתיווך פרוטאזום במיוחד בcentrosomes.

המחקרים האחרונים שלנו זיהו לוקליזציה רומן centrosomal ותפקוד של VDAC3, אחד מporins המיטוכונדריה 16,28. Immunostaining של מספר תאי יונקים כוללים תאי RPE1 באמצעות נוגדן VDAC3 ספציפי הראה צביעת centrosomal בולטת והכתמה של המיטוכונדריה חלשה יחסית. אנחנו גם הראו כי VDAC3 centrosomal קשור באופן מועדף עם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

Video: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemistry

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Neuroscience

זרימת עבודה של ניתוח צביעת חלבון גרעיני בתאים ראשוניים אנושיים

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

מחבר זרקור: ניתוח אפיגנטי מקיף לחקר פלסטיות התא האנושי והסתגלות סביבתית באמצעות בדיקות immunofluorescence

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

Genetics

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Summary

Explore More Videos

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית

צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות