אין פלטפורמת הדמיה של קולטן אנטיגן כימי מאומת קלינית עד כה. סימפורטר הנתרן-יוד מייצג כתב רגיש ורלוונטי מבחינה קלינית לתמונה של תאי T לרכב על ידי סריקת PET. הדמיית TLP PET של תא T של NIS CAR מאפשרת לחוקרים לעקוב באופן לא פולשני אחר תאים חדורים ב- vivo ויש לה פוטנציאל לחזות יעילות ורעילות של טיפול בתאי T CAR.
הדמיה יעילה של תאי T CAR מאפשרת הערכה של סחר והתרחבות תאי T ומאפשרת פיתוח אסטרטגיות כדי להתגבר על המגבלות. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה היא פשוטה וניתן ליישם אותה על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המוצגים במחקר זה. התחל עם הבידוד של תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או PBMCs מדגימת הדם באמצעות טכניקת שיפוע הצפיפות הסטנדרטית.
כדי לעשות זאת, להוסיף בעדינות 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לצינור הפרדה הדרגתי צפיפות 50 מיליליטר הימנעות היווצרות בועות. כדי למנוע השמנת תאים, דלל את דגימת הדם עם PBS המכיל 2%FBS ביחס נפח של אחד לאחד והעבר בעדינות את הדם המדולל על גבי מדיום שיפוע הצפיפות מבלי לשבור את הממשק בין השניים. לאחר מכן צנטריפוגה צינור ההפרדה ב 1, 200 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוטי טרי 50 מיליליטר, לשטוף את התאים עם PBS המכיל 2% FBS על ידי מילוי הצינור עד 50 מיליליטר סימן, צנטריפוגת הצינור ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי לפני שתשתמשו מחדש בתאים שנזרקו ב-50 מיליליטר של PBS המכילים 2%FBS. הגדילו מחדש את מחשבי ה-PBMCs הגלולים ב-PBS המכילים 2%FBS לריכוז של 50 כפול 10 בחזקת תאים שישית למיליליטר.
חזור על הכביסה בצינור 50 מיליליטר טרי. לספור את מספר התאים ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. לבידוד תאי T, העבר מחשבי PBMCs מבודדים לצינור עגול 14 מיליליטר פוליסטירן עגול.
לאחר מכן השתמש בערכת חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית כדי לבצע בידוד תאי T על-ידי הצבת ה- PBMCs בקוקטייל נוגדנים של בחירה שלילית במפריד תאים אוטומטי לחלוטין. לאחר בידוד תאי T, לספור את התאים ואת התרבות התאים במדיום הרחבת תאי T או TCM בריכוז של פעמיים 10 עד התא השישי למיליליטר. לאחר מכן, לערבב את הבקבוקון המכיל את החרוזים נגד CD3/ CD28 על ידי ערבוב ופיפטה החוצה את הנפח הנדרש של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge סטריליטר 1.5 מיליליטר.
לכביסה, resuspened החרוזים במיליליטר אחד של TCM לפני הנחת צינור על מגנט במשך דקה אחת לשאוף את supernatant. לאחר הסרת הצינור מן המגנט, resuspend החרוזים שטף במיליליטר אחד של TCM ולחזור על הכביסה פעמיים. resuspend החרוזים שטף במיליליטר אחד של TCM כדי להעביר אותם לתרבות תאי T, ולאחר מכן לדלל את השעיית חרוזים T-cell עם TCM לריכוז של 1.0 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר לפני העברתו לתרבות רקמה מטופלת צלחת שש טוב.
לדגור על צלחת הבאר ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. כדי להתקדם עם ההמרה של lentiviruses, להפשיר את lentiviruses קפוא בציפוי קולטני אנטיגן כימרי או נתרן-יוד symporter בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 עד 48 שעות של גירוי תאי T, מערבבים את תאי ה- T כדי לפרק את האשכולות ולהוסיף את lentivirus שהופשר טרי לתאים בריבוי של זיהום של חמישה.
לדגור על תאי T המועברים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. בימים 3, 4 ו-5 של דגירה, ספרו את תאי ה-T שהועברו והתאמו את ריכוז התאים ל-1.0 כפול 10 ל-6 למיליליטר על ידי הוספת TCM טרי שחומם מראש. עבור תאי T שהועברו בשקלים הנושאים את גן ההתנגדות לפורומיצין, טיפלו בתאים במיקרוגרם אחד למיליליטר של פורומיצין דיהידרוכלוריד בימים 3, 4 ו-5.
ביום השישי, לשבור את אשכולות תאי T ולהסיר את החרוזים נגד CD3 / CD28 מתאי T שהועברו על ידי הצבת הצלחת על מגנט במשך דקה אחת. לאחר מכן למקם את התאים שנאספו בחזרה בתרבית בריכוז של 1.0 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר. לשטוף aliquot של תרבית תאי T המכיל 50, 000 תאים עם מאגר זרימה ולהחזיר את התאים עם 50 מיקרוליטרים של מאגר זרימה.
לגילוי ביטוי CAR, הכתימו את תאי ה-T במיקרוליטר אחד של נוגדן נגד עכברים עזים. כדי לא לכלול את התאים המתים, הוסיפו 0.3 מיקרוליטרים של LIVE/DEAD Aqua. לדגור על התאים המוכתמים בחושך בטמפרטורת החדר.
לאחר 15 דקות, לשטוף את התאים עם 150 microliters של חיץ זרימה ב 650 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לתקן ולחדירות את התאים המוכתמים, לדגור על התאים עם 100 מיקרוליטרים של מדיום קיבוע במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של חיץ המכיל סוכן חדירות תא כגון סאפונין וצנטריפוגה.
לאחר הכביסה, תוסיפו מחדש את התאים המחדירים ל-50 מיקרוליטרים של חוצץ מחלחל. לאחר מכן הוסיפו 0.3 ננוגרם של נוגדן ETNL ש"ח אנטי אנושי ודגרו בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה אחת של דגירה, לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של חיץ זרימה וצנטריפוגה כפי שהוכח.
לאחר מכן לדגור על התאים עם 50 מיקרוליטרים של חיץ זרימה המכיל 2.5 מיקרוליטרים של נוגדן משני נגד ארנב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת תאי T כפי שהוכח, resuspened התאים ב 200 מיקרוליטרים של מאגר זרימה לבצע cytometry זרימה. לאחר מכן לקבוע את יעילות ההמרה של התאים.
ביום השמיני, לספור ולסובב את תאי T ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני resuspending גלולה התא עם מדיום מקפיא בריכוז של 10 פעמים 10 כדי התא השישי לכל מיליליטר. מעבירים מיליליטר אחד של השעיית התא לכל בקבוקון קריו מסומן לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, להעביר את תאי T לחנקן נוזלי.
הכינו את העכברים שהוזרקו עם תאי BCMA CAR T חיוביים ל-BCMA CAR להדמיית PET/CT על ידי שקילה של העכברים והסרת תגי אוזן מתכת. ואז להזריק 9.25 מגה-בקרל של F18 טטרפלואורובורט מוכן טרי לתוך העכבר תוך ורידי באמצעות הזרקת וריד הזנב. לאחר 45 דקות של תקופת ספיגה, המשך לרכוש תמונות PET סטטיות של עכבר מורדם במשך 15 דקות, ואחריו רכישת תמונת CT במשך חמש דקות עם סיבוב 360 מעלות ו 180 הקרנות.
בניתוח מייצג זה, שיתוף פעולה של שני וירוסים לתאי T יצר תאי T חיוביים BCMA CAR T כאשר מעל 90% מהתאים היו חיוביים ל-NIS. הניתוח של קינטיקת גדילת תאי T מאפס לשמונה ימים גילה כי שילוב של BCMA CAR ו- NIS לא השפיע באופן משמעותי על התרחבות תאי T בהשוואה לתאים שלא הושפעו. בניתוח ציטומטרי הזרימה של OPM-2, תאים שהועברו עם lentivirus ייצגו את הביטוי GFP על טיפול עם puromycin.
העכברים שקיבלו BCMA חיובי לוציפראז חיובי OPM-2 תאים היו נתונים הדמיה bioluminescence כדי לאשר את החריטה של תאי OPM-2. הדמיית PET של העכבר המנוהל על ידי F18 tetrafluoroborate חשפה התפלגות תאי T של BCMA CAR חיובית באיברים השונים ובמח העצם. בנוסף, תאי מח העצם שנקטפו מהעכבר הציגו את החריטה של תאי OPM-2 ואת המסירה של תאי ה-BCMA CAR T החיוביים של NISMA למח העצם.
להדמיה איכותית של תאי T חדורים לרכב, חשוב לעקוב אחר השלבים של פרוטוקול ייצור תאי T של NIS CAR ולאשר נוכחות של שני שברים חיוביים של ש"ח ו-CAR.
