פרוטוקול זה מתאר תהליך פשוט ותל"ג של התמרת תאי T ראשוניים אנושיים עם גן מעניין. טכניקה ספציפית זו תוכננה להיות חסכונית ותל"ג ללא שימוש בפלטפורמות ייצור יקרות של מערכות סגורות הזמינות כיום במרכזים אקדמיים רבים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן פוטנציאלי ביצירת טיפולים תאיים מהונדסים גנטית, כולל אך לא מוגבל לתאי CAR T, אשר היוו שינוי פרדיגמה להתמודדות עם ממאירויות המטולוגיות.
כדי לבודד PBMC מהתאים שנאספו לאחר לויקפרזיס של דם תורם, בצע צנטריפוגה הדרגתית צפיפות מבוססת רב-סוכר של הדגימה, תוך שמירה על יחס מגיב לדגימה של 1:2, על ידי צנטריפוגה של התערובת ב 800 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלמים כבויים. לאחר מכן באמצעות מיקרופיפטה, לאסוף את PBMCs לתוך צינור נקי 50 מיליליטר. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה.
לפני השעיית התאים שטופים במדיה hematopoietic מלא. הפעל כ -20 מיליון מהתאים המתקבלים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של מגיב גירוי תאי T לכל 2 מיליון תאים. לאחר מכן, לאחר הוספת אינטרלוקין-2 אנושי רקומביננטי ב 20 יחידות למיליליטר, מערבבים את התמיסה בעדינות ומעבירים אותה לצלחת שש בארות.
לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות לפני ביצוע התמרה ויראלית. ביום השלישי מעבירים את תרבית התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומערבבים אותו היטב. צנטריפוגה את הצינור ב 300G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את מגיב ההפעלה.
השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תווך שלם לפני ספירת התאים. כוונן את נפח תרחיף התא באמצעות מדיום מלא כדי להשיג ריכוז המאפשר ציפוי של 0.5 מיליון תאים לבאר בצלחת של 24 בארות. הוסף אינטרלוקין-7 אנושי רקומביננטי ואינטרלוקין-15 אנושי רקומביננטי לתאים בריכוזים המתאימים.
בצינור נפרד, הוסף את הכמות הרצויה של vectofusin-1 למדיום Opti-MEM, בהתחשב בנפח הנגיפי הסופי שיש להשתמש בו. שלבו תערובת זו עם הנגיף המרוכז ביחס של אחד לאחד, והקפידו על ערבוב יסודי. לאחר מכן, הוסף את התערובת המתקבלת המכילה את הנגיף לתאים.
התאם את הנפח הכולל של כל באר ל 400 מיקרוליטר באמצעות מדיום מלא במידת הצורך. לאחר כיסוי הצלחת במכסה, אוטמים אותה באמצעות סרט פרפין לפני צנטריפוגה ב 1000G למשך שעתיים ב 32 מעלות צלזיוס. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
למחרת, לאסוף ולמשוך את התאים מכל באר לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים ב 400G ובטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, יש להשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם לפני ספירת התאים.
לאחר מכן התאימו את ריכוז התא עם המדיה כדי להשיג מיליון תאים למיליליטר והוסיפו אינטרלוקין-7 רקומביננטי אנושי ואינטרלוקין-15 רקומביננטי אנושי ב-155 ו-290 יחידות למיליליטר בהתאמה לפני תרבית התאים. ברגע שמגיעים למספר התא הרצוי, קוצרים ומעבירים את התאים לצינורות 50 מיליליטר וצנטריפוגות אותם. לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מיליליטר של מדיה כדי לספור את התאים.
לאחר הצנטריפוגה שוב, יש להשליך את הסופרנאטנט לחלוטין ולהשהות מחדש את הגלולה בתמיסת שימור בהקפאה המורכבת מ-50% HSA ו-40% HBSS, בריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר לבקבוקון קריו. העבירו 0.9 מיליליטר של תרחיף תאים כל אחד למספר הנדרש של בקבוקוני קריו, והוסיפו 10% דימתיל סולפוקסיד לכל בקבוקון קריו. הניחו את בקבוקוני הקריו על קרח והעבירו אותם במהירות למקפיא בקצב מבוקר לשימור בהקפאה.
לאחר מכן העבירו את הדגימות השמורות בהקפאה למיכל חנקן נוזלי מנוטר לאחסון לטווח ארוך. כדי להעריך את יעילות הטרנסדוקציה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר FACS לדגימה במיון תאים מופעל פלואורסצנטי או בצינור FACS. לאחר צנטריפוגה של הדגימה בטמפרטורה של 400 גרם ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, יש להשליך את הסופרנאטנט לחלוטין באמצעות פיפטה.
השהה מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת אחת עד חמש של CD3 במאגר FACS. מערבבים את הדגימה ודגרים במשך 30 דקות על קרח בחושך לפני הצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, לאחר השלכת הסופרנאטנט לחלוטין, השהה מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת של 7-AAD בחיץ FACS.
מערבבים את התערובת לפני הדגירה במשך 10 דקות על קרח בסביבה חשוכה. לבסוף, להוסיף 200 מיקרוליטר של חיץ FACS אליו ולהמשיך לנתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה. ניתוח כדאיות של התאים המומרים גילה כי ביום ה -14, יותר מ -95% מהתאים היו חיוביים CD3 וחיים לאחר ניכוי תאים חיוביים 7-AAD, מה שמצביע על הפעלה מוצלחת של תאי T והתרחבות.
יעילות הטרנסדוקציה באוכלוסייה החיובית CD3 נמדדה ב -58.7% בהשוואה לתאים הלא מותמרים, אשר הציגו יעילות התמרה של 0.51% כאשר התאים המומרים הורחבו מהיום הרביעי עד היום ה -14, עם תת-תרבית כל יומיים, התאים עברו הרחבה פי 25. המוצר עבר בדיקות בקרת איכות שונות ועמד בכל הקריטריונים שנקבעו, המעידים על התאמתו לשימוש נוסף. ההליך כולו צריך להתבצע עם טכניקות אספטיות לחלוטין.
והשלב המסובך ביותר הוא תהליך ההמרה שבו צריך לקחת בחשבון את כל הריאגנטים שיש להוסיף על מנת לשמור על נפח כולל מסוים.
