הקרנה במבחנה מבוססת LED להערכת מולקולות הניתנות להפעלה פוטודינמית בהפעלה פוטודינמית של חיידקים

המחקר שלי מתמקד בחקר מולקולות שונות ממשפחת תרכובות הפלביליום, הן טבעיות והן סינתטיות, עם עניין מרכזי בחקר הפעילות הביולוגית שלהן בהקשר של הגנה מפני קרינת UV והערכת הפוטנציאל שלהן כרגישות לאור עבור יישומי טיפול פוטודינמי. הממצאים האחרונים בקבוצת המחקר שלנו הדגימו את התכונות המופעלות באור של צבעי פלביליום מבוססי אמינו, וביססו אותם כסוג חדש ומבטיח של רגישים לאור. תרכובות אלו מציגות פוטנציאל משמעותי למחקר נוסף, וסוללות את הדרך ליישומים חדשניים בתחום.

באמצעות מערכת המיקרו-פלייט ולוח האור עם 96 בארות, אנו יכולים להשיג סינון תפוקה גבוהה של רגישים לאור בסביבה מבוקרת, מה שמפשט את הזיהוי וההשוואה בין מועמדים שונים לטיפול פוטודינמי. כדי להתחיל, הציגו את חיידקי הסטפילוקוקוס אוראוס על צלחת אגר מולר-הינטון מתרבית העצירה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לקבלת תרבות טרייה.

אוספים שתיים עד שלוש מושבות טריות מצלחת האגר ומדללים אותן בשישה מיליליטר של PBS סטרילי מסונן מחומם מראש ב-pH 7.4. מערבולת החיסון ב-1,200 סיבובים לדקה למשך שלושה עד ארבעה מחזורים כדי להומוגניזציה של הדגימה ולמשוך שלושה מיליליטר מהחיסון ההומוגני לקובטה חד פעמית. לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר, יש לדלל את הדגימה כך שתתאים לצפיפות האופטית של 0.1 באמצעות PBS.

הכן תמיסת מלאי של תרכובת הרגישות לאור בממס מתאים כגון DMSO או PBS. לדלל את תמיסת המלאי ב-PBS כדי ליצור את פתרון העבודה, ולהבטיח שרכיבי אמצעי תרבית החיידקים לא יפריעו לספיגת האור. מערבולת את פתרון העבודה כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה.

כדי להתחיל, הכינו את תרחיף הסטפילוקוקוס הזהוב ואת תמיסת העבודה של תרכובת הרגישות לאור. הכן שתי צלחות נפרדות של 96 בארות, אחת מיועדת לחשיפה לאור ואחרת לשליטה בחושך. בכל צלחת, חלקו 100 מיקרוליטר כל אחד מתמיסת הרגישות לאור והתרחיף החיידקי.

מערבבים את התמיסות 5 עד 10 פעמים עם הפיפטה. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לרגישות לאור לקיים אינטראקציה עם תאי החיידקים. לאחר הדגירה, הוציאו את הצלחות מהחממה.

שמור על אחת הלוחות מוגנת מפני חשיפה לאור כבקרת החושך. הנח את הצלחת השנייה של 96 בארות מעל לוח ה-LED המלבני של 50 וואט. סמן את קצוות הצלחת על משטח ה-LED כדי להבטיח מיקום עקבי על פני חזרות פרוטוקול.

חשוף את הצלחת לאור LED למשך כ-15 דקות. השתמש בצלחת נוספת של 96 בארות כדי להכין דילולים סדרתיים של הדגימות, כולל בקרות, בארות לא מוקרנות ומוקרנות. הוסף 180 מיקרוליטר PBS לכל באר, בהתאם למספר הדגימות.

יש לשים 20 מיקרוליטר מכל באר בלוחות המוקרנים והלא מוקרנים לעמודה הראשונה של הצלחת המלאה ב- PBS. בעזרת מיקרו פיפטה רב-ערוצית, בצע דילול סדרתי פשוט מבאר 1 עד 6. מחלקים צלחת אגר לשישה חלקים שווים כאשר כל חלק מתאים לאחד הדילול.

יש לשים 10 מיקרוליטר מכל באר על החלק המתאים של צלחת האגר. דגרו את הצלחת למשך 18 עד 20 שעות. הסר את צלחת האגר מהחממה וזהה אזורים המתאימים לספירת מושבות.

בתוך כל חלק של לוח המקדחה, ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה. ספקטרום טווח האור הנראה הראה שלוש פסגות נפרדות בין 400 ל-700 ננומטר. בתנאי חושך, אף אחת מתרכובות הפלביליום שנבדקו לא הראתה השפעות ציטוטוקסיות.

לעומת זאת, לאחר חשיפה לאור, התרכובות שנבדקו גרמו לירידה תלוית מינון בכדאיות של סטפילוקוקוס זהוב עם השפעות משמעותיות שנצפו בריכוזים של 6 ו-12 מיקרומולרים.