박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

제 연구는 UV 광보호의 맥락에서 생체 활성을 연구하고 광역학 요법 응용 분야를 위한 광감작제로서의 잠재력을 평가하는 데 핵심 관심사를 가지고 천연 및 합성 플라빌리움 화합물군의 다양한 분자를 탐구하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리 연구 그룹의 최근 발견은 아미노 기반 플라빌리움 염료의 광 활성화 특성을 입증하여 유망한 새로운 종류의 광감작제로 자리 잡았습니다. 이러한 화합물은 추가 탐사를 위한 상당한 잠재력을 보여주며 이 분야에서 혁신적인 응용 분야를 위한 길을 닦고 있습니다.

96웰 마이크로플레이트 및 라이트 패널 시스템을 사용하면 통제된 환경에서 광감작제에 대한 고처리량 스크리닝을 얻을 수 있으며, 이를 통해 광역학 요법을 위한 다양한 후보 물질 간의 식별 및 비교를 단순화할 수 있습니다. 시작하려면 stop culture의 Mueller-Hinton 한천 플레이트에 황색포도상구균 박테리아를 도입합니다. 신선한 배양물을 얻기 위해 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

한천 플레이트에서 2-3개의 신선한 콜로니를 수집하고 pH 7.4에서 6ml의 예열된 멸균 여과 PBS로 희석합니다. 1, 3-4 사이클 동안 분당 200 회전으로 접종물을 소용돌이치고 균질화 접종 3 밀리리터를 일회용 큐벳으로 인출합니다. 600나노미터에서 광밀도를 측정한 후 PBS를 이용하여 광밀도 0.1과 일치하도록 시료를 희석합니다.

광감작제 화합물의 원액을 DMSO 또는 PBS와 같은 적절한 용매에서 제조한다. PBS에서 원액을 희석하여 작업 용액을 만들고 박테리아 배양 배지 성분이 광 흡수를 방해하지 않도록 합니다. Vortex는 완전한 균질화를 보장하는 작업 솔루션입니다.

시작하려면 황색포도상구균 현탁액과 광감작제 화합물 작업 용액을 준비합니다. 두 개의 별도 96웰 플레이트를 준비하는데, 하나는 빛 노출용이고 다른 하나는 어두운 제어용입니다. 각 플레이트에 각각 100마이크로리터의 광감작 용액과 박테리아 현탁액을 분배합니다.

용액을 피펫과 5-10회 혼합합니다. 광감작제가 박테리아 세포와 상호 작용할 수 있도록 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.

플레이트 중 하나를 어두운 컨트롤로 빛 노출로부터 보호하십시오. 다른 96웰 플레이트를 직사각형 50와트 LED 패널 위에 놓습니다. LED 표면에 플레이트의 가장자리를 표시하여 프로토콜 반복 전반에 걸쳐 일관된 배치를 보장합니다.

플레이트를 LED 조명에 약 15분 동안 노출시킵니다. 다른 96웰 플레이트를 사용하여 대조군, 비방사선 처리 및 조사된 웰을 포함한 샘플의 연속 희석을 준비합니다. 샘플 수에 따라 각 웰에 180마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

조사된 플레이트와 조사되지 않은 플레이트의 각 웰로부터 20마이크로리터를 PBS-충전 플레이트의 첫 번째 컬럼으로 분취합니다. 다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 웰 1에서 6까지 간단한 직렬 희석을 수행합니다. 한천 플레이트를 6개의 동일한 섹션으로 나누고 각 섹션은 희석액 중 하나에 해당합니다.

각 웰에서 10 마이크로 리터를 한천 플레이트의 해당 섹션으로 분취합니다. 플레이트를 18-20 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이터에서 한천 플레이트를 제거하고 집락 계수에 적합한 영역을 식별합니다.

오거 플레이트의 각 섹션 내에서 식민지 형성 단위의 수를 세십시오. 가시광선 범위 스펙트럼은 400에서 700나노미터 사이의 세 가지 뚜렷한 피크를 보여주었습니다. 어두운 조건에서, 테스트된 플라빌리움 화합물 중 어느 것도 세포 독성 효과를 나타내지 않았습니다.

대조적으로, 빛에 노출된 후 테스트된 화합물은 6 및 12 마이크로몰 농도에서 관찰된 상당한 효과와 함께 황색포도상구균 생존력의 용량 의존적 감소를 일으켰습니다.