הפרוטוקול שלנו עובד ככלי כדי למצוא תרכובות המעכבות דה-פעילות של pyrophosphatase ממברנה קשורה. ומעכבים אלה עשויים לשמש לטיפול במספר מחלות נסיטיות. פרוטוקול זה זול ופשוט לייצר צבע יציב במשך זמן רב מבלי להראות כל הפרעה בנוכחות ריכוז פוספוליפיד גבוה הנדרש להפעלה מחדש של אנזימים.
הכן 10 מיליליטר של פתרון מאגר ההפעלה מחדש, המכיל 20 מילימולרים M-E-S ב- PH 6.5, 3.5% נפח לפי גליצרול נפח, שני מילימולרים D-T-T ו- 0.05%D-D-M. הכינו 10 מיליליטר של מערבל התגובה, המכיל 200 מילימולרים טריס הידרוכלוריד ב PH שמונה. שמונה מילימולאר מגנזיום כלורי, 333 מילימולר אשלגן כלורי, ו 67 מילימולר נתרן כלורי.
כדי להכין 30 מיליגרם למיליליטר ליפוזומים להפעלה מחדש של אנזימים. ראשית, להוסיף 10 מיליליטר של 20 מילימולר של טריס הידרוכלוריד ב PH שמונה, עם אחד מילימולר D-T-T ל 0.3 גרם של L אלפא פוספטידילכולין מפולי סויה. שים את ליפוזום על קרח sonicate עם מרווחים שלאחר שנייה אחת במשך דקה אחת.
השתהה לדקה אחת וחזור על הפעולה עד שהפתרון יהפוך לצהוב שקוף. עליקוט ליפוזומים ב 100 microliters, להקפיא את החנקן הנוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד לשימוש. כדי להפעיל מחדש את האנזים, להפשיר את פתרון ליפוזום בטמפרטורת החדר.
יש לערבב 40 מיקרוליטרים של תוסף ליפוזום עם 22.5 מיקרוליטר של 20%D-D-M. שומרים את התערובת על 55 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסף 36.5 מיקרוליטרים של פתרון מאגר ההפעלה מחדש. מערבבים ומוסיפים מיקרוליטר אחד של חלבון מרוכז כדי ליצור ריכוז כולל של 0.13 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, להעביר 20 microliters של האנזים מחדש ל 1480 microliters של תערובת התגובה.
מערבבים בעדינות ולהשתמש מיד. ראשית, להמיס את התרכובות D-M-S-O כדי להפוך פתרונות מלאי של 50 מילימולרים ב 200 microliters. עבור תרכובות מסיסים לדלל את פתרון המלאי עם מים למיליליטר אחד צינורות מיקרו, לתת שניים, 10, ו 100 micromolar.
עבור כל דילול, מערבולת הפתרון המורכב לערבוב נכון. לאחר מכן, לבדוק את הסטייה מורכבת, באמצעות צינור רב ערוצי, לוותר 75 microliters של תערובת התגובה לתוך כל באר בצלחת 96-well. מוסיפים 75 מיקרוליטרים של כל תרכובת ומים כבקרה בטריליקט, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים.
למדוד כל באר ב 300 וולט באמצעות נפאלומטר מיקרופלאט. כדי להכין את פתרון ציטראט ארסניט, משקל חמישה גרם של נתרן ארסניט וחמישה גרם של טריסודיום ציטראט דיהידראט, להמיס את שתי התרכובות לתוך 100 מיליליטר של מים. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית.
מערבבים ומוסיפים מים ל-250 מיליליטר, מאחסנים בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. לאחר מכן, להכין פתרון A על ידי הוספת 10 מיליליטר של קרח קר 0.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת ל 0.3 גרם של חומצה אסקורבית להמיס את החומצה אסקורבית על ידי מערבולת. הכן פתרון B על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים קרים קרח ל 70 מיליגרם של אמוניום tetrathiomolybdate tetrahydrat, ומערבולת להתמוסס.
חנות פתרון A ו- B על קרח. כדי להכין את תקן הפוספט עם ריכוז של אפס, 62.5, 250 ו 500 micromolar לכיול. הוסף אפס מיקרוליטרים, 12.5 מיקרוליטרים, 50 מיקרוליטרים ו-100 מיקרוליטרים של 5 מילימולרים דיהידראקט דיהידראקט פוספט לארבעה צינורות מיקרו המכילים 370 מיקרוליטרים של תערובת התגובה.
למעלה עד מיליליטר אחד עם מים. עכשיו להוסיף מיליליטר אחד של פתרון B ל 10 מיליליטר של פתרון A, לערבב ביד ולאחסן את הפתרון על קרח. באמצעות צינור רב-ערוצי, הוסף 40 מיקרוליטרים של אפס, 62.5, 250 ו- 500 תקן פוספט מיקרומולרי לתסריטי הצינור ב- triplicate.
לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פתרון מורכב ו-15 מיקרוליטרים של תערובת פתרון M-P-P-A של כל צינור. חוץ מהצינורות המכילים תקן פוספט. לאטום את רצועות הצינור עם גיליון איטום דבק.
חותכים את גיליון האיטום כדי להפריד כל רצועת צינור. לאחר מכן, הדגירה מראש את המדגם במשך חמש דקות ב 71 מעלות צלזיוס. מניחים את המדגם על בלוק החימום עם מרווחים של 20 שניות בין כל רצועה.
עבור כל רצועה, לפתוח את איטום דבק. באמצעות צינור רב ערוצי, להוסיף 100 microliters של שני דיבסיק נתרן פירוספט טוחנת. ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה במשך חמש פעמים.
לאטום את רצועת הצינור שוב באמצעות אותו איטום. דגירה שוב ב 71 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על מנגנון הקירור עם מרווח של 20 שניות בין כל רצועה.
תן להם להתקרר במשך חמש דקות ולאחר מכן צנטריפוגה כל רצועה לזמן קצר כדי decant טיפות המים מתחת גיליון האיטום. להחזיר את הרצועה למנגנוני הקירור, להסיר את האיטום ולתת להם להתקרר עוד חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים 60 מיקרוליטרים של פתרון A ו- B, מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה במשך חמש פעמים, ולשמור את פסי הצינור על מנגנון הקירור במשך 10 דקות נוספות.
במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 90 מיקרוליטרים של תסריט הארסניט ושמור על טמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. כדי ליצור צבע כחול יציב. מחלקים 180 מיקרוליטרים של כל תערובת תגובה למיקרופלסטיק פוליסטירן ברור של 96 באר.
השתמש בספקטרופוטומטר מיקרופלאט כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 860 ננומטר. בפרוטוקול זה, שמונה תרכובות נבדקו יחד עם I-D-P, מעכב נפוץ של pyro phosphatase כשליטה חיובית. לאחר הוספת פתרון A ו- B, ו ארסניט ציטראט, צבע כחול ב 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר.
כל שלושת הריכוזים של תרכובות לא מעכבות, הציגו את אותה עוצמת צבע כחול. כמו גם E-1 כדי E-3 ללא כל מעכב. העלילה של פעילות אנזימטית נגד הריכוז של כל תרכובת נבדק, מראה כי המתחם עם פעילות עיכוב נוצר עקומה לא ליניארית הולם.
העלילה של I-D-P כשליטה חיובית, מראה בבירור ירידה בפעילות בריכוזים גבוהים יותר. עקומת העיכוב לתרכובות 1, 5, 6, 7 ו-8. מראה ריכוזי מעכבות מרביים למחצה ב 1.7 מיקרומולר, 21.4 מיקרומולר, 58.8 מיקרומולר, 239.0 micromolar, ו גדול מ 500 micromolar, בהתאמה.
זכור להתכונן, פתרון M-P-P-A. ממש לפני תחילת ההתנגדות.
