פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיה וכימות של השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית על פני רקמות מרובות. באלגנטיות C, מורפולוגיה מיטוכונדריאלית קשורה לעתים קרובות לפונקציונליות שלה. ניתן להבחין בשינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית במצבי מחלה שונים ועם התקדמות ההזדקנות, אשר לעתים קרובות מתאמים עם חוסר ויסות בתפקוד המיטוכונדריה, רקמות שונות, ולראות אלגנטיות.
מציגים מבנים מיטוכונדריאלים ייחודיים הדורשים אסטרטגיות הדמיה שונות. לכן, בחירת מיקרוסקופ מתאים ואופטימיזציה של הכנת הדגימה חיוניים להדמיה מוצלחת ספציפית לרקמות של מיטוכונדריה ו-C Elegance. כאן בחרנו להשתמש בזני הסל הטרנסגניים המבטאים GFP מקומי במיטוכונדריה במקום בצבעי מיטוכונדריה קונבנציונליים.
זה מאפשר לנו להימנע מהשפעות מחוץ למטרה, חדירה דו-צדדית ושלבי הכנת הדגימה המורכבים הדרושים להדמיית מיטוכונדריה ברקמות שונות באמצעות צבע. המוקד העיקרי של המעבדה שלנו הוא חקר הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי במהלך לחץ והזדקנות. סטנדרטיזציה של פרוטוקול הדמיה מיטוכונדריאלית חיונית כדי למזער טעויות חוץ-מנטליות וליצור תוצאות הניתנות לשחזור לגבי שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתנאים ביולוגיים שונים.
כדי להתחיל, השג שקופיות זכוכית נקיות. להכנת דגימה, הוסף 10 עד 20 מיקרוליטר של תמיסת M nine על מגלשת הזכוכית והניח את המספר הרצוי של תולעים בוגרות בגילאים ספציפיים בתמיסה. על השקופית, כסו את התולעים בתמיסת M nine עם זכוכית כיסוי לשריר הדמיה.
מיטוכונדריה, דחף את החלקה של הכיסוי כדי לגלגל את התולעים. לאחר מכן בעזרת לק אטמו את דפנות זכוכית הכיסוי כדי למנוע אידוי של תמיסת M nine. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטי כדי לצלם מיטוכונדריה של שרירים ואפידרמיס המבטאים את התגים הפלואורסצנטיים.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיית מיטוכונדריה במעי ובצע אופטימיזציה של הגדרות ההדמיה כך שיתאימו למערך הניסוי הספציפי. כדי להתחיל בניתוח, פתח את אפליקציית פיג'י לאחר ההתקנה כדי להוריד ולהתקין את המאקרו של ממפה mito. ראשית, הורד את קוד המקור.
העתק את הקוד המופיע תחת קוד IJM עבור MIT mapper 1.0. פתח את פיג'י ועבור לתוספים, ואחריו חדש ומאקרו הדבק את הקוד שהועתק בחלון המאקרו. לאחר מכן שמור את המאקרו לשימוש עתידי באמצעות קובץ ושמור בשם.
נווט אל הקובץ ולאחר מכן פתח לפתיחת תמונה מיקרוסקופית תלת מימדית עם Zs.In פיג'י, צור הקרנה מקסימלית מתחת לתמונה, ואחריה ערימות ופרויקט Z. בחר את טווח הפרוסות בתוך תמונות ממוקדות להקרנה מקסימלית ובחר עוצמה מקסימלית כסוג ההקרנה כדי לשמור את התמונה המוקרנת המקסימלית. כ-tiff, עבור אל קובץ ולחץ על שמור בשם ואחריו tiff.
חתכו את האזורים המעניינים מהתמונה המלאה בעזרת הכלי מלבן ונווטו אל תמונה וחיתוך. עבור לקובץ ואחריו שמור בשם ו-tiff כדי לשמור את תמונת החיתוך בפורמט Tiff. גרור ושחרר את מפת ה-mito או קובץ המאקרו שנשמרו בעבר לסרגל הכלים של פיג'י.
לחץ על הפעל. כאשר תתבקש, בחר את התיקייה המכילה את קובץ ה-TIFF שנשמר בשלב הקודם. כאשר תתבקש לבחור אזור, צור מלבן בתמונה באמצעות הכלי מלבן ולחץ על אישור כדי לאשר.
לבסוף, עבור לקובץ ושמור את הנתונים עם כל הערכים הקשורים למורפולוגיה המיטוכונדריאלית כקובץ CSV נקודה. המורפולוגיה המיטוכונדריאלית הייתה ספציפית לרקמה עם מיטוכונדריה צינורית, מיושרת עם סיבי שריר בשרירים, מבנים דמויי רשת מחוברים זה לזה במעי, ומעוגלים או סגלגלים יותר. מיטוכונדריה בהדמיית היפודרמיס עם מיקרוסקופ קונפוקלי שיפרה את ההדמיה של מיטוכונדריית המעי על ידי הפחתת אור לא ממוקד בהשוואה למיקרוסקופיה מורכבת.
בשקופיות, המיטוכונדריה הציגה פיצול לאחר 30 דקות במאגר M 9 כאשר מיטוכונדריה אפידרמיס מראה את הפיצול הבולט ביותר. ההזדקנות הביאה לפיצול מיטוכונדריאלי בכל הרקמות המופיעות כמבנים קטומים וכדוריים. כימות ממפה MIT הצביע על כך שאורך האובייקט השתנה בשרירים ונקודת הצומת השתנתה בהיפודרמיס.
