老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

このプロトコルは、複数の組織にわたるミトコンドリア形態の変化を画像化し、定量化するための標準化されたアプローチを提供します。C Eleganceでは、ミトコンドリアの形態はしばしばその機能に関連付けられています。ミトコンドリアの形態の変化は、さまざまな病状下や老化の進行とともに観察することができ、これはしばしばミトコンドリア機能の調節不全と相関し、異なる組織、そして優雅さが見られます。

独自のイメージング戦略を必要とするユニークなミトコンドリア構造を示します。したがって、適切な顕微鏡を選択し、サンプル調製を最適化することは、ミトコンドリアとC Eleganceの組織特異的イメージングを成功させるために不可欠です。ここでは、従来のミトコンドリア色素の代わりに、ミトコンドリア局在GFPを発現するトランスジェニックcele株を使用することを選択しました。

これにより、オフターゲット効果、onal bi penetrance、および色素を使用してさまざまな組織のミトコンドリアを視覚化するために必要な複雑なサンプル調製ステップを回避できます。当研究室では、ストレスや老化時のミトコンドリアの恒常性について研究しています。ミトコンドリアイメージングプロトコルの標準化は、精神外エラーを最小限に抑え、さまざまな生物学的条件下でのミトコンドリア形態の変化に関する再現性のある結果を生成するために不可欠です。

まず、きれいなスライドガラスを入手してください。サンプル調製のために、スライドガラス上に10〜20マイクロリットルのM nine溶液を加え、溶液中に特定の年齢で必要な数の成虫を置きます。スライド上で、Mナイン溶液中の線虫をカバーガラスで覆い、筋肉を画像化します。

ミトコンドリア、カバースリップを軽くたたいてワームを転がします。次に、マニキュアでカバーガラスの側面をシールし、Mナイン溶液の蒸発を防ぎます。標準的な広視野顕微鏡を使用して、蛍光タグを発現する筋肉と表皮のミトコンドリアを画像化します。

腸内ミトコンドリアのイメージングには共焦点顕微鏡を使用し、特定の実験設定に合わせてイメージング設定を最適化します。分析を開始するには、インストール後にフィジーアプリケーションを開き、mito mapperマクロをダウンロードしてインストールします。まず、ソースコードのものをダウンロードします。

「MIT マッパー 1.0 の IJM コード」の下にリストされているコードをコピーします。フィジーを開き、プラグインに移動してから、コピーしたコードをnewとmacroでマクロウィンドウに貼り付けます。次に、マクロをファイルを使用して保存し、名前を付けて保存します。

ファイルに移動し、Zs.In フィジーで3D顕微鏡画像を開くために開き、画像の下に最大投影を作成し、続いてスタックとZプロジェクトを作成します。最大投影用にピントの合った画像内のスライスの範囲を選択し、投影タイプとして最大強度を選択して、最大投影画像を保存します。tiff として、ファイルに移動し、[名前を付けて保存] をクリックし、続いて tiff をクリックします。

長方形ツールを使用して画像全体から関心領域を切り抜き、画像に移動して切り抜きます。ファイルに移動し、次に名前を付けて保存し、tiffを使用して、トリミング画像をTiff形式で保存します。以前に保存したmitoマップまたはマクロファイルをFijiツールバーにドラッグアンドドロップします。

「実行」をクリックします。プロンプトが表示されたら、前の手順で保存した TIFF ファイルを含むフォルダーを選択します。領域を選択するように求められたら、長方形ツールを使用して画像に長方形を作成し、[OK]を押して確定します。

最後に、ファイルに移動し、ミトコンドリアの形態に関連するすべての値を含むデータをドットCSVファイルとして保存します。ミトコンドリアの形態は組織特異的で、管状のミトコンドリアは筋肉の筋線維と整列し、腸内では相互につながった網状構造で、より丸みを帯びた楕円形でした。共焦点顕微鏡による皮下組織イメージング中のミトコンドリアは、複合顕微鏡と比較して焦点外光を減らすことにより、腸のミトコンドリアの視覚化を改善しました。

スライドでは、ミトコンドリアはM nineバッファー中で30分後に断片化を示し、表皮ミトコンドリアは最も顕著な断片化を示しました。加齢により、すべての組織でミトコンドリアの断片化が起こり、切り詰められた球形の構造として現れます。MITマッパーの定量化では、筋肉の物体の長さが変化し、皮下組織の接合点が変化したことが示されました。