איורים 1 ו -2 היו שפורסמו בעבר בביולוגיה ורפואה ברדיקלים חופשיים (Queliconi et al. 5) ויש לי זכויות יוצרים שנערכו על ידי Elsevier. עבודה זו נתמכה על ידי Fundação דה Amparo א Pesquisa לעשות Estado דה סאו פאולו (FAPESP), Instituto Nacional de Ciencia דואר Tecnologia דה Processos חיזורם Biomedicina, Nucleo דה Apoio א Pesquisa דה Processos חיזורם Biomedicina, USPHS NS064945 (קן), וUSPHS GM087483 (KN ). מנגל הוא דוקטורנט נתמך על ידי מענק FAPESP.

1. ג elegans צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות 35 מ&quot;מ צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר זרע עם OP50 חיידקים, כמו לכל שיטות טיפוח סטנדרטיות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן סי אלגנס ידי הצבת 6 מבוגרים הרה להולדת על צלחת NGM seeded. הסר את המבוגרים לאחר ~ 100 ביצים כבר הונחו (~ שעה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות במשך 3 ימים ב20 מעלות צלזיוס, ובשלב התולעים פיתחו לשלב בוגר צעיר והם אופטימליים לניסוי זה. פרוטוקולים אלטרנטיביים לסינכרון ג elegans מתוארים במקומות אחרים 10. </li></ol> 2. חומרים לAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ M9 (22 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) צריך להיות מטוהר של חמצן על ידי equilibrating עם N 2 (יכול לשמש גם ארגון) במהלך 30 דקות לפני הניסוי וכל זמן מוקף בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור קטן (3 מ&quot;מרחב) במכסה של 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות שבתולעים יוצבו במהלך AS. החור מאפשר חילוף גזים ללא שמירה על המכסה פתוח, כמו זה יכול להוביל לאידוי תקשורת מוגזם. </li></ol> 3. אנוקסיה / רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל הניסויים לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של RT, חיץ M9 מחומצן לכל צלחת 35 מ&quot;מ המכילה תולעים בוגרות צעירות גדלו כפי שתואר לעיל. להיות זהיר, כדי למנוע הסרת חיידקים מהצלחת (להוסיף M9 לקצוות שבו חיידקים לא זורעים). לאחר ~ 1 דקות התולעים צריכים להיות שוחים בM9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל קצה פיפטה 1 מיליליטר עם ארגון ה-BSA על ידי pipetting וגירוש פתרון BSA 1% סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטות את הצלחת המכילה את התולעים בחיץ M9 בזהירות, להסיר M9 מאותו המקום שבו הוא הוסיף, ולמקם את ההשעיה בmicrocentrifuge הצינורות שהוכנו מראש. תן לנוח בקרח עד התולעים ירדו לחלק התחתון של הצינורות (~ 1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסכום המקסימאלי של M9 האפשרי מבלי להפריע לתולעים מהצינור (שעזב סביב 100 μl), להוסיף 1 מיליליטר של M9 וקר-מטוהר החמצן ובמקום צינור על קרח עד התולעים ליישב לתחתית שוב. חזור על 3x השלב האחרון. בכביסה האחרונה, להסיר M9 עד ~ 100 μl נשאר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות עם התולעים בM9 deoxygenated בתוך תא חוסר חמצן / anoxic (ראה הוראות שלהלן, סעיף 3.6.1), או לחלופין, למכל אטום מותאם אישית (ראו הוראות שלהלן, סעיף 3.6.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קאמרי anoxic / חוסר חמצן מסחרי הוא לשמש, להשאיר כמה M9 מטוהר בתוך החדר לפני שמתחיל שלב 3.5 וחזור על שלב 3.5 פעם התולעים בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קאמרי מותאם אישית הוא לשמש, תיאור מפורט של איך ליצור מנגנון עלות נמוכה מוצג בסוף הפרוטוקול זה ותואר על ידי קבוצה אחרת בעבר 11. בקצרה: <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חורים במכסת 250 מיכל מיליליטר טאפרוור מהסוג ולהוסיף מחברים צינור אליהם. אחד ישמש להזריק את תערובת הגז ואילו השני יהיה יציאת הגז לתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התולעים אל תוך החדר ולאטום את החדר באמצעות המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז עם N 2 זרימה מתמדת (100 מיליליטר / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכל בתוך אמבט מים ב26 ° C. ודא שצינור היציאה הוא שקוע היטב במים ולכן אין החזרי אוויר ושאין דליפות במערכת (לכאורה על ידי בועות הנובעות מהחדר עצמו). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התולעים ב26 מעלות צלזיוס למשך 20 שעה. </li></ol> 4. Reperfusion המדומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 20 שעות בתנאי AS, הסר את הצינורות מתא הדגירה לאוויר חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ג elegans עם טיפ מצופה-BSA (כמו בשלב 3.3) על גבי OP50 זורעים 35 מ&quot;מ צלחת NGM. דגירה הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.אחרי זה, התולעים יהיו מוכנים להיות קלע. </li></ol> 5. זיהוי המלח נגד תולעים בשידור חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף פלטינה, בקלילות לגעת בחלק העליון של הראש של התולעת. תולעים חיים יעברו לאחור לאחר שנגע. אם התולעים nonresponsive, להבקיע מת. לעתים, תולעת לא תזוז אחורה, אך עשוי להפגין תנועת ראש מצד לצד קל. אמנם לא מבחינה טכנית מת, התולעים האלה הם כמעט בטוחים לפוג תוך מספר שעות, וצריכים להיות הבקיע כמת. אם מחכה יותר מדי זמן כדי לצבור התולעים, בקיעה פנימית של צאצאים יכולה להתרחש ו&quot; שקיות של תולעים &quot;אלה יכולים להיקרע, מה שהופך את איתור הפגרים קשים מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שני תולעי החיים ומתים מהצלחת כפי שהם נספרים להימנע מספירה כפולה. ניתן להעביר את התולעים חיים לצלחת נפרדת כדי לבצע מבחני התנהגותיים. כמות תולעי חיים ביחס לסך הכל מיוצגת כ% מתולעים ששרדו (איור 1 א </strong&gt;). </li></ol> 6. לגעת Assay תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיאור מפורט של פרוטוקול זה הוצג בהארט, אן ג, ed. התנהגות (3 יולי 2006), WormBook, ed. ג elegans מחקר הקהילה, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבקיע למגע תגובה, לזהות תולעים שנעים וקל לגעת בצד של הראש של התולעת (בסמוך לחלק האמצעי של הלוע) עם בחירת עפעף (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התולעת נעה אחורה, ציון מגיב כמו, אם לא, ציון nonresponsive כ( איור 1). חזור על שלב 10-15x זה עבור כל תולעת עם 10 מרווחי שניות. לחקור לפחות 10 תולעים בכל קבוצה יש את הנתונים מדויקים. אותו assay יכול לשמש כדי להעריך קדימה שינויי locomotory הבאים במגע קל לקיר הגוף האחורי. הקפד שלא לגעת בראש או זנב של התולעת, שכן זה מעורר התנהגות מובחנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בשנתזנים של חברה בקרה גנטית [N2 בריסטול wild-type לMEC מוטציה חיובית, (mechanosensory) לשלילי - למשל CB1338 MEC-3 (e1338) IV] לכייל את הכוח שעם לגעת בתולעים. מדי קשה של גירוי יהיה לעורר תגובה התנהגותית במוטנטים MEC, מעט מדי לא לעורר השפעה בבקרת N2 wildtype. </li></ol></li></ol> 7. עצבי שינויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש פוסט כשינויים עצביים, השתמש מתח המבטא GFP בתאי עצב MEC להגיב בנגיעה 4,5. יש נוירונים אלה תהליכים ארוכים שרצים לאורך קיר הגוף ובקיע מומים מורפולוגיים. בנוסף, המידע המורפולוגיים יכול להיות משולב עם מדדי התנהגותיים של תפקוד עצבי, כפי שתואר לעיל. זן אחד שיכול לשמש למטרה זו הוא TU2583, אשר זמין מג מרכז לגנטיקת elegans ומכיל transgene המשולב uIs25 להביע GFP לכאן ולכאןמ &#39;אמרגן MEC-18, או לחלופין TU2562, המכיל MEC-3 :: GFP היתוך משולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כרית agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים 2% agarose במים, מביא ל1x M9 עם מלאי 10x, ולתחזק את הפתרון ב70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה (~ 20 μl) של פתרון זה בשקופית זכוכית (25 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ) שהושמה בין שתי שקופיות אחרות, כל אחד מהם יש חתיכת קלטת אחת בצד התחתון שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות זכוכית סופיות בניצב הראשון על גבי פתרון agarose 2%, ולתת לו להתקרר ב RT. זה אמור ליצור משטח שהוא בעובי של הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופית העליונה ולהוסיף 10 μl של M9 המכיל tetramisole 0.1%, אשר יהיה לשתק את התולעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר חלק (~ 10) לחיות תולעים על 2% שקופיות agarose. מניחים coverslip עליהם ולדמיין את ה-GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרת 100X עם התאורה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגוםנוירונים יציגו מחרוזת cytosolic קרום של דפוס פנינים בתהליכים, המורכבת מ&quot;פונקטום המרובים (איור 2 א), ו / או מומים שבו התהליכים מופיעים להיות שבורים (איור 2). רוזן &quot;פונקטום וליקויים בשני נוירונים לכל תולעת, תוך שימוש בסך של לפחות 10 תולעים. </li></ol> 8. תוצרת מעבדת Hypoxic קאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגנון טאפרוור, מיכל סגר, אטום ניתן retrofit כתא anoxic. תשמור על עצמך כדי לבחור מיכל שהוא קטן כמו אפשרי. מיכל קטן יוצר סביבת חוסר חמצן מהיר יותר וקל יותר להשתלב באמבט המים (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חורים על המכסה (ניתן לעשות זאת עם מברג או על ידי חימום מלקחיים ומאלצים לתוך המכסה) והכנס את מחבר פלסטיק או מתכת שמתאים לצינורות (איור 5 א). השתמש בדבק שיכול להיות ממוקם מתחת למים, וגם מקבל קשה לאחר ייבוש, הימנעות תנועה שלהמחבר ולכן צמצום האפשרות של זליגה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכל צריך להיות ממוקם בתוך אמבט המים, כך שהוא שקוע לחלוטין (איור 4). לטבול את המכל, השתמש במשקל בקבוק או במשקל צלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד מחיבורי הצינור ישמש להציג את תערובת גז והצינור האחר יפעל כהקלה בלחץ, ולכן הוא צריך להישאר מתחת למים, כך שהמכל מסוגרת מהסביבה החיצונית (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב האוויר יכול להיות מווסת על ידי שימוש בגז בהתאמה אישית, בקרי זרימה המוניים או כל מנגנון שמערבב את הגזים הרצויים. זרימת הגז צריכה להיות מבוקרת, כמו זרימה גבוהה יכולה ליצור אידוי מוגזם. לדוגמא, במכל מיליליטר 250, 100 מיליליטר / דקה של גז תספק מרחב טוב לתולעים ושטף מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכו של הצינור צריך להישמר עד למינימום, כפי שהם יכולים להיות חדירים לגז,llowing הכניסה של O 2. חשוב להימנע משימוש בסיליקון, Tygon צינורות כחומרים אלה הם חדירים לחילוף גזים. אנחנו מעדיפים צינורות פוליפרופילן או ניילון. זכוכית או צינורות מתכת לשמור על הגזים טובים, אבל גם יותר קשים לעבוד איתו. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia.">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li><li>Ba Scott, ., Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin/IGF+receptor+homolog+DAF-2.">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li><li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li><li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans.">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li><li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כפי שכבר בשימוש נרחב בג elegans למודל פציעת IR. כמה נקודות מפתח צריכה להיות מודגשות לפרוטוקול זה: סי אלגנס הם עמיד למגוון רחב של פציעות, המצדיק את הצורך ב3 עלבונות נלווים (חום, רעב ואנוקסיה) כדי להשיג מוות באמצעות מערכת זו. אנוקסיה לבד לא הורגת את התולעים בחלון זה זמן 14. יתר על כן, עלייה בטמפרטורה היא לחץ נוסף, ולכן חשוב לעקוב מקרוב. לאמיתו של דבר, רעב אינו תורם באופן משמעותי לתואר של תמותה שנצפתה 7, כשלעצמה, אבל זה נראה להפחית שונות בין משכפל ניסיוני. בהתחשב בכך שלא יכול להיות שונה משמעותי מיום ליום, שזה חשוב ביותר כדי להשוות דגימות להפעיל ישירות במקביל, ולחזור על ניסויים על פני ימים רבים. באופן כללי, תוצאות נמדדות בשלוש צלחות נפרדות של 50-100 תולעים / תנאי ניסוי ואלה הםn בממוצע ונחשב כלשכפל ניסיוני אחד. באופן כללי, בין שבעה לתשעה משכפל נראה מספיק כדי להשיג או לשלול את מובהקות סטטיסטיות. השלב ההתפתחותי של התולעים המשמשים בניסוי גם צריך להיות במעקב צמוד כמו הרגישות של שלבים שונים לניזק משתנה באופן משמעותי 15,16. השימוש של צעירים הוא סטנדרטי, ותולעי שלב זחל (L3 וL4) נראים עמיד יותר להשפעות המזיקות של AS (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול זה מציג שתי דרכים לביצוע הניסויים, אחד באמצעות מנגנון מתוצרת מעבדה (באמצעות מכולות טאפרוור מסוג וקלט גז 11) ואחרים באמצעות תא חוסר חמצן מסחרי 4,6. ניתן להשיג אנוקסיה באמצעים אחרים שצורכים את החמצן, כפי שתואר במקומות אחרים 13,17. השימוש בטכניקות חלופיות כדי ליצור סביבת חוסר חמצן יכול לשנות את הזמן כמו הדגירה דרושהכדי ליצור את הכמות הרצויה של מוות. מיקוד ~ הישרדות 20% הוא נקודת מוצא אידיאלית ללימוד התערבויות מגן, בעוד 80% הוא באופן דומה אידיאליים עבור התערבויות שתחמרנה את ההשפעות המזיקות של AS. עוד אזהרה חשובה היא הזמן שבו תולעים מתים / חיים עשרות הצופה. אם הזמן לניתוח מורחב מעבר 24 שעות, הנתונים עלולות להטעות שכן תולעים מתים הפכו קשים יותר ויותר לזהות. זה יכול להיות בגלל פגרי תולעת הופכים שקופים יחסית לאורך זמן, אלא גם לעובדה שעוברים מופרים יכולים להתפתח לצאצאים לאחר המוות הפנימי של הפגרים ולשבש אותם כפי שהן עולות. הניתוח של מורפולוגיה עצבית יכול להיות שונה כדי לבחון את דפוסי ביטוי חלבון 18, פיצול גרעיני 4 ופרמטרים נוספים 19 ידי החלפת זן תולעת המבטא את סמן מקודד גנטי המתאים. אזהרה סופית אחת היא שההדמיה שלצריכים לעשות תהליכים עצביים פחות מ 30 דקות לאחר הצבת התולעים בשקופית. בעלי חיים נשמרים תחת הרדמה בשקופיות לתקופות ארוכות יותר יכולות להציג נזק כעצמאי. התאם את כמות בעלי חיים לכל שקופית על פי הזמן הדרוש כדי לעקוב ולנתח אותם.

סי אלגנס הוא נמטודות שאומצה באופן נרחב כאורגניזם מודל אוקריוטים תאיים מאז השקתו ב -1 ברנר. זהו מודל זול, פשוט, ותכליתי, המאפשר קישורים קלים בין שינויים ופנוטיפי הגנטיים משנים 2. איסכמיה מאופיינת בחוסר של חומרים מזינים ואספקת חמצן לרקמות, ואחריו reperfusion, כאשר פרץ של מיני חמצן תגובתי מיוצר 3 ורוב הנזק מתרחש. ב2002, מודל של איסכמיה / reperfusion (IR) בג elegans פותח 4 מעורב הגשה כל התולעת לאנוקסיה, מחסור באבות מזון ועומס חום למשך כ 20 שעה אחרי 24 שעות בתנאים רגילים. למרות שמודל זה הוא מבחינה טכנית אנוקסיה רעבה (AS) מצב, מוות של תאים מתרחש באמצעות מנגנונים הנשמרים ביונקים, לרבות נזק שנגרם על ידי חמצון במהלך reperfusion &lt;sup&gt; 5. יתר על כן, בדומה לIR יונקים, נזקים הנגרמים על ידי AS ב C. elegans ניתן למנוע על ידי נפשית מראש איסכמי 6,7 או 8,9 נפשית מראש חומר הרדמה. הפרוטוקולים שלהלן מדגימים כיצד לחקות IR בג elegans באמצעות מודל AS, איך להבקיע מומים מורפולוגיים והתנהגותיים הנובעים מAS, ואיך להתאים את הפרוטוקול באופן שמאפשר לניסוי שיבוצע בהשקעה ראשונית נמוכה באמצעות חלופה קאמרית בקלות-נבנה בהזמנה אישית .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

פרוטוקולים לאנוקסיה / רעב בסי אלגנס אורגניזם מודל הגנטי לדמות איסכמיה / reperfusion. תולעים מופרדים מחיידקים שבמזון והניחו מתחת לאנוקסיה 20 שעה (איסכמיה מדומה), ולאחר מכן עברו לאווירה נורמלית עם אוכל (reperfusion המדומה). תוצאות פרדיגמה ניסוייות זה במותו גדל ונזק עצבי, וטכניקות מוצגות להעריך כדאיות האורגניזם, שינויים במורפולוגיה של תהליכי מגע של תאי עצב, כמו גם מגע רגיש, המייצג את הפלט ההתנהגותי של תפקוד עצבי. לבסוף, שיטה לבניית חממות חוסר חמצן באמצעות מיכלי אחסון מטבח המשותף מתוארת. התוספת של יחידת בקרת זרימה המונית מאפשרת לשינויים שנעשו בתערובת הגז בחממות המותאמת אישית, ואמבט מים במחזור מאפשר לשניהם בקרת הטמפרטורה ועושה את זה קל לזהות דליפות. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה בעלות נמוכה לאופן מסחרייחידות זמינות.

הכפפת ג elegans ל20 שעות של AS ב26 מעלות צלזיוס בתא דגירה תוצרת מעבדה מותאמת אישית כפי שתואר (סעיף 3.6.2) הביא לתמותה משמעותית (איור 1 א) 5. דימות פלואורסצנטי הבאה של &quot;פונקטום והפסקות בתהליכים עצביים ה-GFP שכותרת של ניצולים אישרה את נוכחותו של מומים מורפולוגיים (איור 2). הניצולים גם הגיבו היטב לקיר גוף מגע קל (איור 1). מודל זה כבר בשימוש על ידי מספר קבוצות כדי ללמוד איך נטייה גנטית, התערבות תרופות, ופלסטיות מטבולית משפיעה על תוצאות AS תלויות 4-6,8,9,12,13. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> איור 1. ג elegans הישרדות ומגע תגובה לאחרAS.) אחוז מהתולעים כי תערוכת 24 לאחר כשעת הישרדות. זן N2 הוא הרקע הגנטי הסוג בר, וKWN85 מכיל transgene משולב שמתייג נוירונים MEC עם GFP. ב &#39;) בתגובה למגע גירויים של החיים ג elegans (הזנים N2) לאחר AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> איור 2. מומים (PLML וPLMR) לגעת שינויי נוירון לאחר AS. נוירון מגע כגון תהליכים והפסקות (א) או ההצטברות של אגרגטים GFP בתהליכים (ב &#39;) והמפותלים היו במעקב שבנותרו בחיים בהרדמה ג eleg<html> ans לאחר AS. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> איור 3. איסוף ריס. איסוף עפעף מורכב. בהבלעה, פירוט של הריסים דבוקים לעץ הקיסם. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> איור 4. קאמרי חוסר חמצן בתוך אמבט המים מתוצרת מעבדה. מיכל סגור מוכן להתחיל את הניסוי. חצים מצביעים על כניסת הגז ויציאה ומשקל הבקבוק משמש כדי למנוע ממנו צף. 231fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. פרטים של הצד הפנימי וחיצוני של מכסה מיכל. א) בצד חיצוני של מיכסה מיכל, המציין את הצינור ומחבר שלו מחובר לצד חיצוני של מיכסה מיכל חור. שנעשה בעבר ב &#39;), המציין את מחבר הצינור מחובר לחור שנעשה בעבר.

Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

an-anoxia-starvation-model-for-ischemiareperfusion-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K Views.  Universidade de São Paulo.  פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי. 

Video: An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בסיסי

Assay Chemotaxis סי אלגנס

שיטה לCulturing עוברי

נוגדן מכתים ב

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

מדידת רעילות ב -C. אלגיה