פפטידים RAN הם תכונה של הפרעות נוירודגנרטיביות התרחבות חוזרת כגון מחלת הנטינגטון, טרשת נפוצה צידית amyotrophic, דמנציה frontotemporal. פרוטוקולים אלה מספקים גישה מתוקקנת חשובה לכימות רעילות פפטיד RAN במערכת המודל C.elegans. הטכניקות המתוארות הן פשוטות ללמוד וזול, ניתן לבצע במהירות, למנף את התכונות לשחזור של מערכת C.elegans כגון תנועה ורבייה.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, האתגר העיקרי הוא להשיג רעילות פפטיד רן עקבי וביטוי. הגורמים העיקריים לשליטה כוללים טמפרטורת סמים, תזמון של משמרות טמפרטורה והכנת צלחות מבדיקת. חשוב לניסויים לסווג באופן עקבי את הפנוטיפים של בעלי החיים בתהליך תלוי גיל זה.
הדגמה חזותית של טכניקה זו מציגה את קריטריוני הסיווג שלהם. התחל על ידי שפיכת בינוני צמיחה nematode סטנדרטי עם IPTG מילימולר אחד ו 25 מיקרוגרם לכל קרבניצילין מיליליטר לתוך צלחות 24 באר. פס החוצה שיבוטים האכלה RNAi בחיידק HT115 על LB קרבניצילין אגר ולגדל אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
למחרת, לבחור מושבה אחת לתוך מיליליטר אחד של מדיה נוזלית קרבניצילין LB ולגדל את החיידקים במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. ספוט ארבע בארות בודדות של צלחת NGM RNAi 24 באר עם 20 microliters של תרבויות חיידקיות לילה כמתואר בכתב היד טקסט ולאפשר חיידקים RNAi לגרום ייצור RNA תקוע כפול בן לילה. השתמש בשיטת ההיפוכלוריט הסטנדרטית כדי לבודד ביצים מהיום הראשון C.elegans בוגר המבטא את טרנסגן פפטיד RAN משולב.
ואז לזרוע כ 30 ביצים לתוך כל באר של צלחת 24 היטב דגירה את הצלחת ב 20 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. כדי לבצע ניתוח מהירות וידאו, לרכוש שני קטעי וידאו משתי בארות נפרדות עבור כל מצב RNAi באמצעות מיקרוסקופ ניתוח סטריאו מצויד במצלמת מונוכרום. הקפד להשתמש בהגדרות רכישה עקביות בין בארות.
עבור כל סרטון, הגדר את משך הזמן למשך 10 שניות ואת מרווח הזמן ל- 76 אלפיות שניה. הגדר את זמן החשיפה לתמונה לארבע אלפיות שניה ולהשתמש בהגדרת גודל התצוגה של 1.49. לאחר מכן בחר שניים על-ידי שני binning.
ודא שהרזולוציה היא 800 על 600 פיקסלים והתחל להקליט. לאחר הרכישה, תייג כל סרטון מיד עם המתח, מצב RNAi ומספר טוב. לאחר מכן למדוד את המרחק נסע ואת האורך של כל בעל חיים עבור 20 בעלי חיים שונים לכל וידאו, בוחן בסך הכל כ 40 תולעים עבור כל מצב RNAi.
בתוכנה, בחר בלחצן כלי ביאור. לאחר מכן, כלי ציור הטקסט. לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת במסגרת הראשונה של הווידאו וסמן אותה במספר.
קדם את הווידאו עד הסוף תוך מעקב חזותי אחר התולעת. לאחר מכן לחץ על זה ולסמן אותו עם המספר המתאים הבא. השתמש בכלי סרגל קנה המידה של ההגרלה כדי לצייר קו מהמספר הראשון למספר השני ולתרשם את המרחק שנסע בגיליון אלקטרוני.
חזור על מדידה זו עבור 19 תולעים אחרות בסרטון תוך שמירה על כל מדידה בודדת בחלון הניתוח. לאחר השלמת המדידות, צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית הממחישה את כל קווי המדידה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל החיה שממנה היא נוצרה. לאחר מכן, נתח את הנתונים באמצעות גיליון אלקטרוני בן ארבע עמודות שבו עמודה אחת היא מזהה התולעת ועמודה 2 היא המהירות.
הזמן של כל סרטון ניתן למצוא על ידי לחיצה ימנית על הווידאו תחת הניסוי והולך אל המאפיינים. כדי לנרמל את מדידת המהירות, מצא את האורך של כל חיה. השתמש בכלי לצייר polyline כדי לעקוב בחופשיות C.elegans מקץ הראש לקצה הזנב.
לאחר מכן צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית הממחישה את כל הפוליקווים. אורך השורות יירשם תחת סטטיסטיקה. הוסף שתי עמודות לגיליון האלקטרוני, אחת עבור אורך בעלי חיים אחת עבור מהירות מנורמלת.
לבסוף, לנתח את נתוני מהירות מנורמל באמצעות ANOVA חד כיוון עם בדיקות שלאחר hoc לעומת RNAi וקטור ריק. מניחים ארבעה עד שישה L4 C.elegans מהונדסים המבטאת רן פפטיד GFP על צלחת GFP RNAi שישה סנטימטרים ולגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס. אם הניסוי הוא ניצול RNAi כדי לבדוק השפעות גנטיות על רעילות פפטיד RAN, להעביר 10 מבוגרים gravid מהונדסים לכל אחד משני וקטור ריק RNAi GFP RNAi או גנים ספציפיים RNAi צלחות.
אם מוטנטים משמשים לניתוח השפעות גנטיות על רעילות פפטיד RAN, מקום 10 סוג בר gravid או בעלי חיים מוטנטים המבטאת את אותו טרנסגן RAN על כל אחד משני צלחות RNAi וקטור ריק או GFP RNAi. לגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. בחרו 10 סטים של 10 L4s מהוססים מצלחות ה-RNAi והמקמו כל סט על צלחת RNAi באורך 3 ס"מ.
ודא כי התולעים שנבחרו להסקה כל יש תנועתיות נורמלית שטחית. מניחים את הצלחות בשקית ניילון כדי לשמור על לחות ולהדיר אותם ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, לנתח את בעלי החיים לניידות על ידי הקשה על הצלחות על מיקרוסקופ ניתוח ובדיקת תנועה.
אם תולעת נעה יותר מאורך גוף, ספור אותה כניידת והעבר אותה לצלחת RNAi חדשה באורך 3 ס"מ. השתמש בבחירה פלטינה כדי להקיש על התולעים הנותרות על הראש והזנב. אם החיה נעה יותר מאורך גוף, לספור את החיה כמו נייד ולהעביר אותו צלחת RNAi שלושה סנטימטר חדש.
אם שיתוק משמעותי אינו נצפה בשליטה הווקטורית הריקה עד היום השני, לסיים את ההסקה ולהתחיל מחדש. קבץ את כל התולעים שאינן זזות יחד, כך שניתן יהיה לזהות בקלות תנועה של יותר מאורך גוף. לספור את כל משותק, ארז, או תולעים מתות ולהשליך את הצלחת.
המשך להבקיע את בעלי החיים לשיתוק כל יום במשך חמישה עד שבעה ימים. בדיקת הצמיחה שימשה למדידת ההשפעה של עכבות גנים על הרעילות של דיפפטידים RAN שנמצאים בחולים ALS עם התרחבות חוזרת G4C2. ביטוי של PR50 GFP לבדו הביא למעצר צמיחה מוחלט, אבל הפלה של כמה גנים דיכאה את הרעילות ההתפתחותית.
ההשפעה של הפלות גנים ספציפיות על תנועתיות ההתפתחותית של PR50 המבטאת בעלי חיים נמדדה בשיטת ניתוח מהירות הווידאו. כצפוי, עיכוב של ביטוי PR50 GFP הביא לעלייה גדולה בהנעה בהשוואה לווקטור ריק RNAi. יתר על כן, RNAi נגד RPN7 תת-כוח proteasome הביא לעלייה משמעותית תנועתיות PR50.
כאשר פנוטיפים בוגרים נותחו עם הראיה שיתוק תלוי גיל, PR50 GFP הציג עד 80% שיתוק על ידי חמישה ימים של גיל. עם זאת, RNAi מכוון לגן cul-6 עיכוב משמעותי שיתוק רומז כי cul-6 נדרש עבור רעילות PR50 GFP. כדי לקבוע אם חלבוני RAN גורמים לנוירופתולוגיה כאשר הם באים לידי ביטוי בנוירונים C.elegans, רעילות ספציפית לנוירונים נבדקה באמצעות בדיקת הקומיסר.
ביום שני מבוגרים, ביטוי PR50 GFP בנוירונים המוטוריים הוביל לעלייה משמעותית בפענון הנוירונים המוטוריים. נוירופתולוגיה זו דוכאה באופן משמעותי על ידי מוטציה בגן קולטן IGF אינסולין הומולוג DAF-2 אשר מעכב את המאפיינים הרעילים של מספר חלבונים ניווניות. לצורך ההתרפסות ההתנהגותית, חשוב כי פפטידים RAN לייצר פנוטיפ חודר מאוד.
גנים או תרופות כאלה יכולים לספק סמנים ביולוגיים חדשים או אפשרויות טיפוליות למחלות פפטיד רן. באמצעות בדיקות אלה, ביצענו מסך RNAi כלל-גנום עבור מדכאי C9ORF72 הקשורים RAN פפטיד פרולין-ארגנין. גנים שזוהו במסך זה כוללים גנים חדשים ו שמורים רבים שיהיו נושא למחקרים מכניים עתידיים.
