Этот протокол обеспечивает стандартизированный подход к изображению и количественной оценке изменений морфологии митохондрий в нескольких тканях. В С-элегантности морфология митохондрий часто ассоциируется с его функциональностью. Изменения в морфологии митохондрий могут наблюдаться при различных заболеваниях и с прогрессированием старения, что часто коррелирует с нарушением регуляции функции митохондрий, различных тканей и элегантности.
Демонстрируют уникальные митохондриальные структуры, требующие различных стратегий визуализации. Таким образом, выбор подходящего микроскопа и оптимизация подготовки образцов имеют важное значение для успешной тканеспецифической визуализации митохондрий и C Elegance. Здесь мы решили использовать трансгенные штаммы cele, экспрессирующие локализованный в митохондриях GFP вместо обычных митохондриальных красителей.
Это позволяет избежать побочных эффектов, ональной бипенетрантности и сложных этапов подготовки образцов, необходимых для визуализации митохондрий в различных тканях с помощью красителя. Основным направлением деятельности нашей лаборатории является изучение митохондриального гомеостаза во время стресса и старения. Стандартизация протокола митохондриальной визуализации имеет важное значение для минимизации внепсихических ошибок и получения воспроизводимых результатов в отношении изменений морфологии митохондрий при различных биологических условиях.
Для начала приобретите чистые стеклянные предметные стекла. Для подготовки образца добавьте от 10 до 20 микролитров раствора М 9 на предметное стекло и поместите в раствор желаемое количество взрослых червей определенного возраста. На предметном стекле накройте червей в растворе М девять покровным стеклом, чтобы изобразить мышцы.
Митохондрии, подтолкните крышку листка, чтобы свернуть червей. Затем лаком для ногтей заклейте боковые стороны покровного стекла, чтобы предотвратить испарение раствора М девяти. Используйте стандартный широкоугольный микроскоп для визуализации мышечных и эпидермальных митохондрий, экспрессирующих флуоресцентные метки.
Используйте конфокальный микроскоп для визуализации кишечных митохондрий и оптимизируйте настройки визуализации в соответствии с конкретной экспериментальной установкой. Чтобы начать анализ, откройте приложение Fiji после установки, чтобы загрузить и установить макрос mito mapper. Во-первых, скачайте исходный код.
Скопируйте код, указанный в разделе Код IJM для MIT mapper 1.0. Откройте Fiji, и перейдите в раздел плагины, после чего в макросе вставьте скопированный код в макрос. Затем сохраните макрос для дальнейшего использования в файле и сохраните как.
Перейдите к файлу, а затем откройте для открытия 3D микроскопическое изображение с помощью Zs.In Fiji, создайте максимальную проекцию под изображением, за которым следуют стеки и Z-проект. Выберите диапазон срезов в фокусе изображений для максимальной проекции и выберите максимальную интенсивность в качестве типа проекции, чтобы сохранить максимальное проецируемое изображение. В качестве tiff перейдите в файл и нажмите «Сохранить», а затем tiff.
Обрежьте интересующие области на полном изображении с помощью инструмента «Прямоугольник» и перейдите к изображению и обрезке. Перейдите в файл, а затем нажмите «Сохранить как» и «Tiff», чтобы сохранить изображение обрезки в формате Tiff. Перетащите ранее сохраненную карту mito или файл макроса на панель инструментов Фиджи.
Нажмите кнопку «Выполнить». При появлении запроса выберите папку, содержащую файл TIFF, сохраненный на предыдущем шаге. Когда появится запрос на выбор области, создайте прямоугольник на изображении с помощью инструмента «Прямоугольник» и нажмите кнопку «ОК» для подтверждения.
Наконец, перейдите в файл и сохраните данные со всеми значениями, относящимися к морфологии митохондрий, в виде файла dot CSV. Морфология митохондрий была тканеспецифичной с канальцевыми митохондриями, выровненными с мышечными волокнами в мышцах, соединенных между собой паутинными структурами в кишечнике, и более округлыми или овальными. Визуализация митохондрий в гиподерме с помощью конфокального микроскопа улучшила визуализацию кишечных митохондрий за счет уменьшения расфокусированного света по сравнению с комплексной микроскопией.
На предметных стеклах митохондрии продемонстрировали фрагментацию через 30 минут в буфере М-девяти, причем эпидермальные митохондрии показали наиболее заметную фрагментацию. Старение привело к фрагментации митохондрий во всех тканях, проявляющейся в виде усеченных и сферических структур. Количественное определение картографа MIT показало, что длина объекта изменилась в мышцах и точка соединения изменилась в гиподерме.
