פיתחנו פרוטוקול חזק שבו ניתן לבצע מספר סבבים של הכלאה באתרה על אותו מוח דרוזופילה, המאפשר הדמיה של דפוסי הביטוי של גנים רבים ושונים. הטמעת מוח הזבוב בהידרוג'ל מבטיחה שלמות רקמה מצוינת ויציבות mRNA לאורך מספר סבבים של הכלאה. זה גם משפר משמעותית את הבהירות האופטית בעת הדמיה.
EASI-FISH יכול להיות מאומץ על ידי כל מעבדה עם מיקרוסקופ קונפוקלי או יריעת אור כדי להגדיר פרופילי ביטוי גנים של סוגי תאים במוח הזבוב. כדי להתחיל, נגב שקופית לא טעונה עם מגיב טיהור RNA. הסר את הסרט האטום המגן על הדבק מאטם הסיליקון.
לאחר מכן הדביקו את האטם המכיל עד ארבעה תאים למגלשה. השתמש בפיפטה P20 כדי לצפות כל משטח תא במיקרוליטר אחד של פוליליזין. לאחר מכן, העבירו עד ארבעה מוחות של דרוזופילה לכל שפופרת לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר.
החזר לחות למוח ב-150 מיקרוליטר של PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ואחריו PBS. הוסף 40 מיקרוליטר PBS לכל תא. בעזרת זוג פינצטה עדינה, מקם בעדינות את המוחות בשורה במרכז החדר, והשאיר מרווח ביניהם.
הסר PBS מהתא והוסף מיד 50 מיקרוליטר של מאגר MOPS של 20 מילי-מולרי. בזמן שהמוחות מאזנים במאגר MOPS, פיפטה נפחים שווים של Melphalan-X מופשר לתוך צינור עם מאגר MOPS בנפח שווה. לאחר מכן הוסף פתרון מלאי Ac-X ביחס של אחד ל-100.
מערבל את התמיסה וסובב אותה בקצרה כדי לאסוף אותה. הסר את כל חוצץ ה-MOPS מהתאים והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת Melphalan-X Ac-X. הנח החלקת כיסוי על גבי כל תא מבלי להשתמש בדבק האטם לאיטום.
לאחר מכן הניחו את החדר בקופסה לחה. למחרת, הסר בזהירות את פתק הכיסוי ושאף את תמיסת Melphalan-X Ac-X. שטפו את המוחות המותקנים פעמיים ב -100 מיקרוליטר של 0.1% PBT, ואחריהם 100 מיקרוליטר PBS.
הניחו תמיסות מופשרות של TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED ואמוניום פרסולפט על קרח. מערבולת את פתרון TREx-1000 כדי להבטיח שאין משקעים. מערבבים את התמיסות להכנת תמיסת ג'ל ומערבולת לפני הציפוי.
בעזרת קצה פיפטה, הוציאו את ה-PBS מהתא ופתלו את כל הנוזלים שנותרו בעזרת מגבון נטול מוך. הוסף מיד 40 מיקרוליטר תמיסת ג'ל על המוח בכל חדר. דגרו את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
כעת הסר את תמיסת הג'ל מהתא. לאחר מכן קלף את סרט המגן השקוף מדבק משטח האטם. הוסף 45 מיקרוליטר אחרונים של תמיסת ג'ל טרייה.
הנח בעדינות פתק כיסוי מעל החדר ולחץ על החלקת הכיסוי כדי לאטום את החדר לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות. דגרו את החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות כדי לפלמר את הג'ל. לאחר קירור הג'לים על ספסל, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר בזהירות את החלקת הכיסוי ואת אטם הסיליקון.
חותכים את הג'ל לצורה מלבנית וחותכים את הפינה הימנית העליונה כדי לציין את כיוון הדגימה. לאחר מכן, השתמש במברשת צבע עדינה שהורטבה בכמות קטנה של מאגר Pro K כדי להרים בזהירות את הג'לים מהשקופית. העבירו כל ג'ל בנפרד לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.
מערבבים 500 מיקרוליטר של מאגר Pro K וחמישה מיקרוליטרים של אנזים Proteinase K, ומוסיפים את התערובת לכל ג'ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר את המאגר בעזרת פיפטה גמישה עדינה ולאחר מכן שטוף את הג'לים שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות כל אחד.
דגרו את הג'לים למשך 30 דקות במיליליטר אחד של מאגר DNASE1 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 מיקרוליטר של אנזים DNASE1 עם 450 מיקרוליטר של מאגר DNASE1. מערבבים בעדינות ללא מערבולת.
דגרו כל ג'ל ב -500 מיקרוליטר של תמיסת DNASE1 למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הג'לים ארבע פעמים למשך 15 דקות עם מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר. כעת, דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הכלאה מופשר ללא בדיקות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
מדללים את הבדיקות במאגר הכלאה ביחס של אחד ל -100, מכינים 300 מיקרוליטר לג'ל. דגרו את הג'לים עם מאגר הכלאה המכיל בדיקות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הג'לים תחילה במאגר שטיפת בדיקה, ואז ב- PBS.
לתגובת שרשרת ההכלאה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הגברה לג'ל ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מחממים את סיכות השיער הפלואורסצנטיות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות במכונת PCR ומצננים את התמיסה ל-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור כל בדיקה, יש לדלל זוגות סיכות ראש תואמים ביחס של אחד ל-50 במאגר הגברה, ולהכין 300 מיקרוליטר לג'ל.
לאחר מערבולת התערובת, מוסיפים את התערובת לג'לים ודוגרים. כדי להרכיב את הג'ל להדמיית יריעות קלות, מצפים את משטח חיבור הג'ל של מחזיק ג'ל פעמיים במיקרוליטר אחד של פוליליזין, ומניחים לו להתייבש ב-37 מעלות צלזיוס בין שכבות. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על החלקת כיסוי כך שהחתך יהיה בצד שמאל.
בעזרת מכחול מעבירים את הג'ל על המשטח המטופל בתנועה אחת. גנים הקשורים למוליכים עצביים וגנים נוירופפטידים הראו דפוסי ביטוי מובהקים במוח הדרוזופילה הבוגר. VGluT ו-Gad1 זוהו באותו סבב הכלאה, והראו דפוסי ביטוי לא חופפים.
AstA הראה ביטוי חזק באונה האופטית וביטוי חלש יותר בקומפלקס המרכזי. Crz התבטא מאוד ב-pars lateralis, בעוד שרמות ביטוי נמוכות יותר נצפו בתאי עצב של האונה האופטית. Tk זוהה בתאי עצב H דלתא D שזוהו עם ביטוי Mer-GFP באמצעות קו GAL4 מפוצל ספציפי על ידי יריעת אור או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
FMRFamide נעדר בתאי עצב PFG המסומנים על ידי Mer-GFP, אך זוהה בתאי עצב שמסביב. הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים FB4K אישרה את ההתפלגות המרחבית של תעתיקי VGluT ו-ChAT/VAChT. נוירופפטידים, כגון AstA ו-Crz, מתבטאים כל כך חזק בתאים מסוימים עד שלא ניתן עוד להפריד כתמים פלואורסצנטיים בודדים המייצגים תעתיקים בודדים.
