אנו חוקרים אינטראקציות בין קולטן טירוזין קינאז לבין קרום הפלזמה של היונקים. אנו רוצים לדעת כיצד רפסודות שומנים ואסימטריית שומנים מניעים לוקליזציה, הפעלה ואיתות של קולטנים. זה מאתגר לחקור רפסודות שומנים ישירות מכיוון שהן קטנות, דינמיות ורגישות לתנאי טמפרטורה.
חוקרים נאלצים לעתים קרובות להשתמש במערכות מודלים עם תחומי סדר גדולים כדי לחקור אינטראקציות. שלפוחיות סינתטיות ופלזמה הן ייצוגים לא מושלמים של קרומי תאים חסרי אסימטריה של שומנים ואברונים. בעבודה עם תאים חיים, אנו משיגים ייצוג מדויק של קרום הפלזמה.
הם מדגישים את התחלת איתות הקולטן בהקשר של תאים חיים. זה נותן תובנה לגבי ההשפעה של סביבות ממברנה על קולטנים ומסלולי האיתות שלהם במורד הזרם. כדי להתחיל, הכניסו את מלאי השומנים לתוך צינור בורוסיליקט באמצעות פיפטה תזוזה חיובית עם קצה זכוכית.
הנח את צינור הבורוסיליקט על בלוק חימום המוגדר לכ-50 מעלות צלזיוס והחל זרם של גז חנקן על הצינור עד שכל הכלורופורם הנראה לעין יתאדה. העבירו את הצינור לתא ואקום וחשפו אותו לוואקום גבוה למשך שעה כדי להסיר את כל הממס שנותר. לאחר מכן הוסף את מדיית ה-F-12 של Ham ללא סרום לסרט השומנים המיובש כדי להגיע לריכוז סופי של 20 מילימולר.
מכסים את הצינור במכסה או בסרט טפלון ומחממים אותו באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, מערבל את הפתרון להשעיית שומנים ויצירת שלפוחיות רב-שכבתיות או MLV. לאחר שהמדיה הופכת לעכורה, העבירו את כל הנפח לצינור מיקרו צנטריפוגה ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה ימים.
מערבבים את ה-MLV המוכנים עם מתיל אלפא ציקלודקסטרין לריכוז סופי של 40 מילימולר. דגרו את תערובת השומנים למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס או 55 מעלות צלזיוס. צפו במדיה עוברת ממעונן לבהיר.
לאחר מכן, הניחו למצע חילופי השומנים להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. השג תאי קולטן אינסולין בשחלות אוגר סיני הגדל ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בתוסף DMEM המכיל 4.5 גרם לליטר גלוקוז. זרע 1.5 כפול 10 בחזקת שישה תאים בצלחות של 60 מילימטר ודגר אותם לקבלת מפגש של 80 עד 90%.
לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. הרעיבו את התאים למשך הלילה בשני מיליליטר של חומר F-12 ללא סרום. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS, הוסף מיליליטר אחד מאמצעי ההחלפה המוכן.
דגרו את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב כל 15 דקות כדי להבטיח חשיפה אחידה לאמצעי ההחלפה. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. הסר את ה-PBS מצלחת תרבית התאים לחלוטין והניח את הצלחת בזווית של 45 מעלות למשך 10 דקות או עד לייבוש מלא.
לאחר הסרת המאגר השיורי, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת איזופרופנול הקסאן לתאים המיובשים ודגרו במשך 10 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. כעת העבירו את התמיסה לצינור בורוסיליקט. לאחר כיסוי הצינור, יש לאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, ממיסים את שאריות התא באמצעות 500 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד. יש לנער את המיכל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח פירוק מוחלט. כדי לבדוק את יעילות ההחלפה, שפכו 100 מיליליטר של תמיסת מתנול כלורופורם 30% אמוניום הידרוקסיד למיכל כרומטוגרפיה בשכבה דקה מזכוכית.
מכסים את המיכל בחוזקה ונותנים לאדים להתייצב למשך שעה לפחות. יבש את דגימת תמצית השומנים על גוש חימום בטמפרטורה נמוכה מתחת לזרם של גז חנקן עד שהממס האורגני מתאדה. לאחר מכן, ממיסים את סרט השומנים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת מתנול כלורופורם אחד לאחד.
בעזרת מזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר, טען 1 עד 10 מיקרוליטר מהדגימה על צלחת TLC בעלת ביצועים גבוהים בסיליקה. החל את הדגימה ברצועות סנטימטר אחת הטוענות מקסימום 10 רצועות לכל צלחת של 20 סנטימטר. הנח את לוחית ה-TLC זקופה במיכל ה-TLC ואפשר לחזית הממס לנוע שמונה סנטימטרים כדי להפריד בין מיני פוספוליפידים.
לאחר מכן, הניחו לצלחת להתייבש במשך 10 דקות ורססו אותה בתמיסה מימית של 3% אצטט קופרי וחומצה זרחתית 8%. הניחו לצלחת להתייבש שוב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר או בעזרת אקדח חום. הצלחת צריכה להפוך מכחול שקוף ללבן אטום.
לאחר מכן, חרכו את הצלחת בתנור מחוסם בחום של 180 עד 200 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 דקות, או עד שנראים רצועות שומנים שחורות. דגרו על התאים המטופלים עם 500 מיקרוליטר של אינסולין 100 ננו-מולרי במדיה נטולת סרום למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אחרי שטיפת התאים ב-PBS קר כקרח, הניחו אותם על קרח כדי לעצור את הגירוי.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח וקצרו את התאים באמצעות מגרד תאים. גלולה את התאים ב -3000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה RIPA שלם לגלולת התא והשהה מחדש 30 עד 40 פעמים כדי ליז את התאים.
לאחר דגירה של הליזאט על קרח במשך 10 דקות, צנטריפוגה אותו ב-16,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את הפסולת. אוספים את הסופרנטנט בשפופרת טרייה. לאחר קביעת ריכוז החלבון, מערבבים את הליזאט עם מאגר לאמלי פי חמישה ומחממים אותו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
טען כמויות שוות של חלבון לדגימה על ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט לאלקטרופורזה. הפעל את הג'ל ב-100 עד 150 וולט במאגר פועל עד שהחלבונים נפתרים היטב בין 100 ל-250 קילודלטון. לאחר מכן, העבירו את החלבונים שנפתרו על קרום פלואוריד פוליווינילידן באמצעות מאגר העברה וצבעו את הממברנה בנוגדנים המתאימים.
חילופי שומנים בתאי ה-IR של שחלות האוגר הסיני הביאו לעלייה בעוצמת רצועת הספינגומיאלין ולירידה בעוצמת רצועת הפוספטידילכולין בעת החלפת ספינגומיאלין במוח. לעומת זאת, כאשר הוחלף 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine או DOPC, עוצמת פס הפוספטידילכולין עלתה, בעוד שעוצמת רצועת הספינגומיאלין פחתה. התאים שהוחלפו עם DOPC הראו ירידה באוטופוספורילציה של IR תלויה באינסולין.
לעומת זאת, תאים שהחליפו ספינגומיאלין במוח שמרו על זרחון IR או הגדילו אותו במידה מתונה. רמות זרחון מנורמלות נקבעו על ידי חלוקת עוצמת ה-IR pYpY בעוצמת הבטא IR מנתוני הכתם המערבי.
