עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות הנפש (5R01MH071476).

נוהל: 1 st יום 1. Homogenize 50-500 מ&quot;ג של רקמת שלאחר המוות אפור קפוא משנה עם Douncing חוצץ. ! זהירות - רקמה אנושית יש לטפל בזהירות תחת תנאי בטיחות מחמירים. זה צריך להיות מטופל בבית BSL-2 ומעלה תקני הבטיחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גזור בעבר, שלאחר המוות של המוח -80 ° C, dounce להם נפח מוח 5X של הצפת Douncing, ומכניסים צינור microcentrifuge 2.0 מ&quot;ל. בהתאמה מדגם זוגות לשלוט מעובדים בו זמנית. </li></ol> 2. Micrococcal nuclease (MN) עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5U/mL של Micrococcal nuclease המדגם ומערבבים תוך פתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה לפני הצבת על הקרח. * שלב קריטי - חשוב לעשות את הצעד הזה מהר מאז MN יש את היכולת לפעול על אף 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות 7 דקות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 7 דקות, מוסיפים EDTA 0.5m ריכוז של 10mm להפסיק את פעילות MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום דגימות לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל בז. הוספת נפח 10X המדגם של 0.2mM EDTA, 1 / 2000 נפח דגימה של benzamidine 0.2M ונפח מדגם 1 / 1000 של phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). האחרון שתי תרכובות משמשים מעכבי פרוטאז. * שלב קריטי - חשוב לשמור את דגימות קרח במהלך כל השלבים הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מדגם שעה 1, בעוד vortexing זה כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה הארוכה שעה, להוסיף נפח דגימה 1 / 2000 של 3M DTT, עוד מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם וורטקס פעם נוספת צנטריפוגות ב RCF 3175 במשך 10 דקות ב 4 ° C. * שלב אופציונלי - Precleansing עם חלבון G agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח supernatant ולשים צינור חדש בז 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של חלבון G agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 4000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ supernatant כך 500 μL משמשים לשלוט קלט (המכילים DNA הגנומי בלבד), והשאר מחולק לשני צינורות המכיל 1600 μL של המדגם כל - שהם עבור הכרומטין immunoprecipitation (שבב) דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת קלט ממוקם ב -80 ° CO / N עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי דגימות שבב - להוסיף נפח של 1:10 10XFSB ו 4μg של נוגדנים, ואז המערבולת דגימות ולסובב אותם 4 ° C למשך הלילה. ! זהירות - כמות דילול של הנוגדן עשוי לדרוש אופטימיזציה. </li></ol> 2 nd יום ! זהירות! - בגין יום 2 nd על ידי שטיפת חלבון G agarose אשר ישמשו לבודד DNA nucleosomal. מאז חרוזים agarose רגישים מאוד, יש צורך לנתק את ראשי טיפים בכל פעם pipetting כל תמיסה המכילה חרוזים agarose. 1. גשוש חלבון G חרוזים agarose ל-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.6 מ&quot;ל 1XFSB עד 245 μL חלבון ה-G-agarose (מספיק ל 4 צינורות) בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל (לולאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הפתרון לשתי 2 צינורות מ&quot;ל ולמלא כל אחד עד 1.6 מ&quot;ל עם 1X FSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב ב RT במשך 30 שניות ו צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.6 מ&quot;ל 1X FSB שוב. סובב את הדגימות למשך 30 שניות ואז צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant שוב, לשלב את שתי מבחנות עם 1.5 מ&quot;ל 1XFSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 זרע μL sonicated סלמון DNA (10mg/mL). ! זהירות - שלב זה אמור, באופן עקרוני, להפחית את הלא ספציפית מחייב immunoprecipitate אל חרוזים. עם זאת, זה גם יכול להוביל חיוביות שגויות עבור חלק (אדם) רצפי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב ב RT למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. הוספת 200 μL של 1XFSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 μL של חרוזים agarose לתוך מדגם כל שבב. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של 1XFSB לתוך הנותרים חרוזים agarose לשמש מלאה שלילי לסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה ארוכה שעה, בצנטריפוגה דגימות ובקרה שלילי RCF 0.1 למשך 30 שניות. בטל supernatant. </li></ol> 2. כביסה חרוזים ! זהירות! - מאגרים כביסה יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, יש להשתמש בהם רק אם הם פחות מחודש הישן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של כל פתרון כביסה על חרוזים לסובב דקות 3 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ואקום באמצעות supernatant. </li></ol> * פתרון כל כביסה - מלח נמוכה כביסה חיץ - מלח גבוהים כביסה חיץ </p&gt; - ליתיום כלוריד פתרון - רק לסובב ב RT דקה 1! - TE חיץ (10 mM טריס, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Elution * שלב קריטי - הפוך הצפת elution טריים עבור כל ניסוי ביום זה היא לשמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של חיץ טרי elution מוכן מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב במשך 15 דקות ב RT, אז צנטריפוגות ב RCF 0.4 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant בצינור 2.0 microcentrifuge מ&quot;ל (Loop). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של חיץ elution לטעום כל מערבולת ביד במשך כמה שניות. ואז, דגימות מערבולת במשך 15 דקות על mulitvortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 16 RCF סל&quot;ד במשך 4 דקות ולשמור אותו supernatant ב 2.0 מ&quot;ל צינור (Loop). </li></ol> 4. תקציר חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl EDTA 0.5m, 25 μl 0.8M טריס-HCl, pH 6.5, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K (1 / 200 לדוגמה) לדגום כל שבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט בכל קלט, להוסיף למאגר תמוגה לעיכול K proteinase (1 / 10 של חיץ מדגם) ו 10mg/ml proteinase K (1 / 200 חוצץ לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קלט דגימות שבב 52 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות. </li></ol> 5. פנול / כלורופורם מיצוי ! זהירות - ניסוי המחייב פנול / כלורופורם צריכה להתבצע מתחת למכסה המנוע. השתמש בכפפות בעת טיפול nitrile פנול / כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 3 שעות, נוסיף את 500 μl פנול, כלורופורם מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל וורטקס דגימות במשך כמה שניות, ואז צנטריפוגות בסל&quot;ד RCF 13 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו, בשני שלבים יהיו נוכחים ואנחנו מעוניינים בתוכן של השלב העליון. קח את השלב העליון והכניס אותו לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים תערובת של 2μL של גליקוגן 50μL של נתרן אצטט 3M מדגם זה יחד עם 1.375 מ&quot;ל של אתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל וורטקס דגימות במרץ. מניחים אותן -80 ° C במשך הלילה. </li></ol> 3 rd יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות טופס -80 ° C ומניחים אותם על הקרח להם להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 15 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant מבלי להפריע גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 75% קרים מדגם זה, ואז להפוך אותם 4-6 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה RCF ב 18 דקות 5 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant שוב ולאפשר כדורי לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כדורי מיובשים μL 50 של 4 מ&quot;מ טריס-HCl, pH8 ולאחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain.">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 .</li><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters.">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 .</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 .</li><li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2,+a+gene+linked+to+speech+and+language,+in+developing+human+brain.">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .</li><li>Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia.">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, .</li><li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain.">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 .</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי במיוחד עבור החוקרים מעוניינים חתימות מתילציה היסטון ו / או ה-DNA של המוח האנושי, כי אלה סימנים הכרומטין ניתן נוטה פחות חפצים הנתיחה שלאחר המוות לעומת סוגים אחרים של שינויים, כולל acetylation (היסטון) ו זירחון 1, 2. המוח הנתיחה ניתנת ללימוד מונו nucleosomal ...

פתרונות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר nChIP Douncing: 10 mM טריס, 4 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM CaCl 2 כדי להתאים את ה-pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FSB 10x: 50 mM EDTA, 200 מ&quot;מ טריס, 500 mM NaCl כדי להתאים את ה-pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח חיץ נמוכה כביסה: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ&quot;מ טריס (pH 8), 150 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר מלח גבוהים כביסה: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ&quot;מ טריס (Ph 8), 500 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליתיום כלוריד הצפת: 1% IGEPAL CA-630, חומצה Deoxycholic 1%, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM טריס (pH 8), 0.25 מ &#39;LiCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE חיץ: 10 mM טריס (pH 8), 1 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר elution: 0.1M NaHCO 3, 1% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proteinase חיץ K העיכול (10X): 1M טריס, 50 mM EDTA, 2% SDS, NaCl 2M להתאים את pH עד 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 M Sodium Acetate: 24.61 גרם נתרן אצטט נטול מים (MW = 82.03) ב 100 מ&quot;ל של מים מזוקקים autoclaved. התאם ל-pH 5.2 באמצעות חומצה אצטית מרוכזת. </li></ul>

a chromatin assay for human brain tissue

מחלות נוירו כרונית כגון סכיזופרניה, מחלה דו קוטבית אוטיזם נחשבים כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים לגרום לשינויים epigenetic של ביטוי גנים לפתולוגיה מולקולרית אחרים. באופן מסורתי, עם זאת, מחקרים ביטוי במוח שלאחר המוות הוגבלו כימות mRNA או חלבון. המגבלות נתקל במחקר שלאחר המוות המוח כגון variabilities בזמן autolysis ו integrities רקמות עשויים גם להשפיע מחקרים של מבנים גבוהים על מנת הכרומטין. עם זאת, הארגון nucleosomal של הדנ&quot;א הגנומי כולל ה-DNA: ליבה היסטון מחייב - נראה להישמר בעיקר מדגמים מייצגים הניתנים על ידי בנקים שונים במוח. לפיכך, ניתן ללמוד את דפוס מתילציה ושינויים קוולנטיים אחרים של ההיסטונים הליבה לוקוסים הגנומי מוגדרים במוח שלאחר המוות. כאן, אנו מציגים פשוטה יליד הכרומטין immunoprecipitation (NChIP) פרוטוקול קפוא (לא קבועה) דגימות מוח אנושי. החל העיכול nuclease micrococcal homogenates של המוח, בעקבות NChIP ידי qPCR ניתן להשלים בתוך שלושה ימים. המתודולוגיה המוצגת כאן צריך להיות שימושי להבהיר מנגנוני epigenetic של ביטוי גנים במוח אנושיים בריאים וחולים.

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Assay for Human Brain Tissue at JoVE.com

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University of Massachusetts Medical School. עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Video: A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Behavior

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory regions of oncogenes and tumor suppressors can lead to changes in gene expression and play an important role in the pathogenesis of brain tumors. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a popular technique that allows the detection of modifications or other proteins tightly bound to DNA. In contrast to cross-linked ChIP, in native ChIP, cells are not treated with formaldehyde to covalently link protein to DNA. This is advantageous because sometimes crosslinking may fix proteins that only transiently interact with DNA and do not have functional significance in gene regulation. In addition, antibodies are generally raised against unfixed peptides. Therefore, antibody specificity is increased in native ChIP. However, it is important to keep in mind that native ChIP is only applicable to study histones or other proteins that bind tightly to DNA. This protocol describes the native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Epigenetic mechanisms are frequently altered in glioma. Chromatin immunoprecipitation could be used to study the consequences of genetic alterations in glioma that result from changes in histone modifications which regulate chromatin structure and gene transcription. This protocol describes native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Cancer Research

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neuroscience

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array of diverse posttranslational modifications (PTMs) that mostly occur in the amino termini of histone proteins (i.e., histone tail) and regulate the accessibility and functional state of the underlying DNA. Histone tails extend from the core of the nucleosome and are subject to the addition of acetyl groups by histone acetyltransferases (HATs) and the removal of acetyl groups by histone deacetylases (HDACs) during cellular growth and differentiation. Specific acetylation patterns on lysine (K) residues on histone tails determine a dynamic homeostasis between transcriptionally active or transcriptionally repressed chromatin by (1) influencing the core histone assembly and (2) recruiting synergistic or antagonistic chromatin-associated proteins to the transcription site. The fundamental regulatory mechanism of the complex nature of histone tail PTMs influences the majority of chromatin-templated processes and results in changes in cell maturation and differentiation in both normal and pathological development. The goal of the current report is to provide novices with an efficient method to purify core histone proteins from cells and brain tissue and to reliably quantify acetylation marks on histones H3 and H4.

The purpose of this article is to provide a comprehensive, systematic guide to the efficient purification of histones H3 and H4 and the quantification of acetylated histone residues.

טיהור של H3, H4 חלבוני היסטון, כימות של סימני היסטון Acetylated תאים ורקמות המוח

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...