Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Procedimento: 1 ° Giorno 1. Omogeneizzare 50-500 mg di surgelati post-mortem del tessuto grigio questione con Douncing tampone. ! ATTENZIONE - tessuti umani devono essere maneggiati con cura in condizioni di sicurezza rigorose. Pertanto deve essere trattato a BSL-2 o superiore standard di sicurezza. <ol><li> Prendere in precedenza sezionato, post-mortem del cervello da -80 ° C, li dounce del volume cerebrale di tampone 5X Douncing, e il luogo in tubo di 2,0 ml microcentrifuga. Abbinato campione e le coppie di controllo vengono elaborati contemporaneamente. </li></ol> 2. Micrococcal nucleasi (MN) digestione <ol><li> Aggiungi 5U/mL di Micrococcal nucleasi al campione e mescolare all&#39;interno della soluzione pipettando su e giù prima dell&#39;immissione sul ghiaccio. * FASE CRITICA - E &#39;importante fare questo passo in fretta dato che MN ha la capacità di agire anche a 4 ° C. </li><li> Incubare i campioni per 7 minuti a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 7 minuti, aggiungere 0.5M EDTA a una concentrazione di 10 mM per interrompere l&#39;attività MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> I campioni in una provetta da 15 ml falco. Aggiungere 10 volte il volume del campione di 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 volume del campione di benzamidine 0,2 M e il volume del campione 1 / 1000 di phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). Gli ultimi due composti sono usati come inibitori della proteasi. * FASE CRITICA - E &#39;importante mantenere i campioni su ghiaccio per tutti questi passaggi. </li><li> Incubare campione per 1 ora, mentre vortex ogni 10 minuti. </li><li> Al termine della incubazione un&#39;ora, aggiungere il volume del campione 1 / 2000 della 3M DTT, un altro inibitore della proteasi. </li><li> Campione vortice ancora una volta e centrifugare a 3175 RCF per 10 minuti a 4 ° C. * STEP OPTIONAL - Precleansing con proteine ​​G agarosio. <ol><li> Prendere surnatante e mettere in tubo di nuovo 15 ml falco. </li><li> Aggiungere 500 ml di proteina G agarosio. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol></li><li> Distribuire in modo che surnatante 500 microlitri sono utilizzati come controllo di ingresso (che contiene solo DNA genomico), e il resto è diviso in due provette contenenti 1600 ml di ciascun campione - che sono per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) campioni. </li><li> Il controllo d&#39;ingresso è posto a -80 ° CO / N fino a quando un ulteriore uso. </li><li> Per i campioni di ChIP - aggiungere volume 1:10 di 10XFSB e 4μg di anticorpi, poi vortice i campioni e farli ruotare a 4 ° C per una notte. ! ATTENZIONE - Importo e la diluizione di anticorpi può richiedere di ottimizzazione. </li></ol> 2 ° Giorno ! ATTENZIONE! - Inizio 2 ° giorno dal lavaggio delle proteine ​​G agarosio che verrà utilizzato per isolare il DNA nucleosomal. Dal perline agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare la testa delle punte quando pipettaggio qualsiasi soluzione contenente microsfere di agarosio. 1. Probing proteina G Beads agarosio al DNA <ol><li> Aggiungere 1,6 mL 1XFSB a 245 microlitri proteina G-agarosio (sufficiente per 4 tubi) in una provetta 2 mL (anello). </li><li> Separare la soluzione in due 2 mL e ogni ricarica fino a 1,6 ml con 1X FSB. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 secondi e centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Eliminare il surnatante con un aspirapolvere. </li><li> Aggiungere 1,6 ml 1X FSB ancora una volta. Ruotare i campioni per 30 secondi, quindi si centrifuga a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante ancora una volta, e combinare entrambi i tubi con 1,5 ml 1XFSB. </li><li> Aggiungere 15 microlitri sonicato DNA dello sperma di salmone (10mg/ml). ! ATTENZIONE - Questo passo dovrebbe, in linea di principio, ridurre il legame non specifico del immunoprecipitato ai talloni. Tuttavia, questo potrebbe anche portare a falsi positivi per alcune delle (umano) sequenze di DNA. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti, poi centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 ml di 1XFSB. </li><li> Aggiungere 90 ml di perline agarosio in ogni campione ChIP. Ruota a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1XFSB nelle restanti perline agarosio per servire come controllo negativo e ruotare a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo le ore di incubazione lungo, centrifugare i campioni e di controllo negativo a 0,1 RCF per 30 sec. Scartare il surnatante. </li></ol> 2. Lavaggio delle Perle ! ATTENZIONE! - Buffer di lavaggio deve essere conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, e devono essere utilizzate solo se sono meno di un mese. <ol><li> Aggiungere 1 ml di ogni soluzione di lavaggio ai talloni, ruotare per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec. </li><li> Gettare il surnatante tramite aspirazione. </li></ol> Ogni soluzione di lavaggio * - Basso sale tampone di lavaggio - Alta sale tampone di lavaggio </p&gt; - Soluzione di cloruro di litio - solo ruotare a temperatura ambiente per 1 minuto! - Tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Eluizione * FASE CRITICA - Fai Buffer fresca eluizione per ogni esperimento il giorno in cui deve essere utilizzato. <ol><li> Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione appena preparati a ogni campione. </li><li> Ruotare per 15 minuti a RT, poi centrifugare a 0,4 RCF per 1 min. </li><li> Salvare il surnatante in una provetta da microcentrifuga 2,0 ml (Loop). </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione per ogni campione e vortice a mano per pochi secondi. Poi, i campioni vortex per 15 minuti su un mulitvortexer. </li><li> Centrifugare a 16 RCF rpm per 4 minuti e salvare surnatante nello stesso tubo di 2,0 mL (Loop). </li></ol> 4. Digerire proteine <ol><li> Aggiungere 10 microlitri EDTA 0.5M, 25 microlitri 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml di proteinasi K (1 / 200 del campione) per ogni campione ChIP. </li><li> Per ogni controllo in ingresso, aggiungere tampone di lisi per la digestione proteinasi K (1 / 10 di tampone campione) e 10mg/ml proteinasi K (1 / 200 di tampone del campione). </li><li> Incubare di ingresso e di campioni di chip a 52 ° C per almeno 3 ore. </li></ol> 5. Fenolo / cloroformio estrazione ! ATTENZIONE - Esperimento che richiedono fenolo / cloroformio deve essere effettuata sotto il cofano. Usare guanti di nitrile quando si maneggia fenolo / cloroformio. <ol><li> Dopo l&#39;incubazione 3 ore, si aggiunge il 500 microlitri fenolo-cloroformio per ogni campione. </li><li> Vortex tutti i campioni per alcuni secondi, poi centrifugare a 13 giri RCF per 5 min. </li><li> A questo punto, due fasi sarà presente e ci interessa il contenuto della fase superiore. Estrarre la fase superiore e metterla in una provetta 2 mL. </li><li> Aggiungere una miscela di 2μL di glicogeno e 50μL di acetato di sodio 3M per ogni campione con 1,375 ml di etanolo al 100%. </li><li> Vortex tutti i campioni vigorosamente. Metterli in -80 ° C durante la notte. </li></ol> 3 ° giorno <ol><li> Rimuovere campioni forma -80 ° C e metterli in ghiaccio per loro di disgelo. </li><li> Centrifugare a 15 RCF per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con cura sopranatante senza far muovere il sedimento sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 75% per ogni campione, poi capovolgere 4-6 volte. </li><li> Centrifugare a 18 RCF per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante una volta di più e consentire il pellet di aria secca. </li><li> Sciogliere pellet essiccato in 50 ml di 4mm Tris-HCl, pH8 e conservare a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso. </li></ol>

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	<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain.">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 .</li><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters.">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 .</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 .</li><li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2,+a+gene+linked+to+speech+and+language,+in+developing+human+brain.">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .</li><li>Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia.">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, .</li><li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain.">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 .</li></ol>

Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell&#39;istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione 1, 2. Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tem...

Soluzioni: <ul><li> Buffer nChIP Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 aggiustare il pH a 7,5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl aggiustare il pH a 7,5 </li><li> Sale di lavaggio tampone bassa: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Buffer sale di lavaggio ad alta: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Tampone al litio cloruro: 1% IGEPAL-CA 630, 1% acido desossicolico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Eluizione Buffer: 0,1 M NaHCO 3, 1% SDS </li><li> Proteinasi K buffer di digestione (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl regolare il pH a 8,0 </li><li> 3 M di acetato di sodio: 24,61 g di acetato di sodio anidro (PM = 82,03) in 100 ml di acqua distillata in autoclave. Regolare il pH a 5,2 con acido acetico concentrato. </li></ul>

a chromatin assay for human brain tissue

Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l&#39;autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell&#39;espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l&#39;organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante - sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell&#39;espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.

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A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell&#39;istone e gli altri regolatori epigenetici dell&#39;espressione genica nel cervello post-mortem.

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

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Biology

12.8K Views.  University of Massachusetts Medical School. Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell'istone e gli altri regolatori epigenetici dell'espressione genica nel cervello post-mortem.