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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

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Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Princeton University

California Institute of Technology

Although many of the core components of the embryonic cell-cycle network have been elucidated, the question of how embryos achieve robust, synchronous cellular divisions post-fertilization remains unexplored. What are the different schemes that could be implemented by the embryo to achieve synchronization? By extending a cell-cycle model previously developed for embryos of the frog Xenopus laevis to include the spatial dimensions of the embryo, we establish a novel role for the rapid, fertilization-initiated calcium wave that triggers cell-cycle oscillations. Specifically, in our simulations a fast calcium wave results in synchronized cell cycles, while a slow wave results in full-blown spatio-temporal chaos. We show that such chaos would ultimately lead to an unpredictable patchwork of cell divisions across the embryo. Given this potential for chaos, our results indicate a novel design principle whereby the fast calcium-wave trigger following embryo fertilization synchronizes cell divisions.

Does the potential for chaos constrain the embryonic cell-cycle oscillator?

Bien que bon nombre des composantes essentielles du cycle cellulaire embryonnaire r&eacute;seau ont &eacute;t&eacute; &eacute;lucid&eacute;s, la question de comment les embryons atteint post-fertilization robuste, synchrone de divisions cellulaires demeure inexplor&eacute;e. Quels sont les diff&eacute;rents r&eacute;gimes qui pourraient &ecirc;tre mises en &oelig;uvre par l&#39;embryon pour obtenir une synchronisation ? En &eacute;tendant un mod&egrave;le de cycle cellulaire d&eacute;velopp&eacute; ant&eacute;rieurement pour les embryons de la grenouille Xenopus laevis d&#39;inclure les dimensions spatiales de l&#39;embryon, nous &eacute;tablissons un nouveau r&ocirc;le pour l&#39;onde rapide, initi&eacute;e par la fertilisation calcique qui d&eacute;clenche des oscillations du cycle cellulaire. Plus pr&eacute;cis&eacute;ment, dans nos simulations une vague rapide calcium entra&icirc;ne synchronis&eacute;es des cycles cellulaires, tandis qu&#39;un r&eacute;sultats d&#39;onde lente en v&eacute;ritable chaos spatio-temporel. Nous montrons que ces chaos m&egrave;nerait finalement &agrave; un patchwork impr&eacute;visible des divisions cellulaires dans l&#39;embryon. Compte tenu de ce potentiel pour le chaos, nos r&eacute;sultats indiquent un principe de conception originale, auquel cas la g&acirc;chette rapide calcium-vague embryon fertilisation synchronise les divisions cellulaires.

Le risque de chaos contraint-il l&#39;oscillateur du cycle cellulaire embryonnaire ?

Anche se molti dei componenti fondamentali della rete ciclo cellulare embrionale stati chiariti, la questione di come gli embrioni raggiungere post-fertilization robusto, sincrone divisioni cellulari rimane inesplorata. Quali sono i diversi schemi che potrebbero essere attuati dall&#39;embrione per ottenere la sincronizzazione? Estendendo un modello di ciclo cellulare precedentemente sviluppato per gli embrioni di rana Xenopus laevis per comprendere le dimensioni spaziali dell&#39;embrione, stabiliamo un ruolo nuovo per l&#39;onda di calcio rapido, iniziati di fertilizzazione che innesca oscillazioni del ciclo cellulare. In particolare, nelle nostre simulazioni un&#39;onda veloce calcio risultati in cicli cell sincronizzati, mentre un risultati onda lenta in piena regola caos spazio-temporale. Dimostriamo che tale caos porterebbe alla fine ad un mosaico imprevedibile di divisioni cellulari attraverso l&#39;embrione. Dato questo potenziale di caos, i nostri risultati indicano un principio di progettazione romanzo per cui il grilletto veloce calcio-onda dopo fertilizzazione embrione sincronizza divisioni cellulari.

Il potenziale di caos vincolare l&#39;oscillatore del ciclo delle cellule embrionali?

A yeast strain lacking Met4p, the primary transcriptional regulator of the sulfur assimilation pathway, cannot synthesize methionine. This apparently simple auxotroph did not grow well in rich media containing excess methionine, forming small colonies on yeast extract/peptone/dextrose plates. Faster-growing large colonies were abundant when overnight cultures were plated, suggesting that spontaneous suppressors of the growth defect arise with high frequency. To identify the suppressor mutations, we used genome-wide single-nucleotide polymorphism and standard genetic analyses. The most common suppressors were loss-of-function mutations in OPI1, encoding a transcriptional repressor of phospholipid metabolism. Using a new system that allows rapid and specific degradation of Met4p, we could study the dynamic expression of all genes following loss of Met4p. Experiments using this system with and without Opi1p showed that Met4 activates and Opi1p represses genes that maintain levels of S-adenosylmethionine (SAM), the substrate for most methyltransferase reactions. Cells lacking Met4p grow normally when either SAM is added to the media or one of the SAM synthetase genes is overexpressed. SAM is used as a methyl donor in three Opi1p-regulated reactions to create the abundant membrane phospholipid, phosphatidylcholine. Our results show that rapidly growing cells require significant methylation, likely for the biosynthesis of phospholipids.

Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.

Une souche de levure sans Met4p, le principal r&eacute;gulateur transcriptionnel de la voie d&#39;assimilation de soufre, ne peut pas synth&eacute;tiser la m&eacute;thionine. Cette auxotrophe apparemment simple ne pousse pas bien dans un milieu riche contenant des exc&egrave;s m&eacute;thionine, formant de petites colonies sur les plaques de dextrose/peptone/Extrait de levure. Croissance rapide de grandes colonies &eacute;taient abondants lorsque les cultures une nuit ou Pluss ont &eacute;t&eacute; ensemenc&eacute;s, sugg&eacute;rant que les suppresseurs spontan&eacute;s de la d&eacute;fectuosit&eacute; de la croissance se posent avec haute fr&eacute;quence. Pour identifier les mutations de l&#39;&eacute;liminateur, nous avons utilis&eacute; le genome-wide single-nucleotide polymorphism et analyses g&eacute;n&eacute;tiques standard. Les suppresseurs plus communs &eacute;taient des mutations perte de fonction OPI1, codant un r&eacute;presseur transcriptionnel du m&eacute;tabolisme des phospholipides. &Agrave; l&#39;aide d&#39;un nouveau syst&egrave;me qui permet une d&eacute;gradation rapide et pr&eacute;cise de Met4p, nous pourrions &eacute;tudier l&#39;expression dynamique de tous les g&egrave;nes suite &agrave; perte de Met4p. Exp&eacute;riences &agrave; l&#39;aide de ce syst&egrave;me avec et sans Opi1p a montr&eacute; que Met4 active et Opi1p r&eacute;prime les g&egrave;nes qui maintiennent les niveaux de la S-ad&eacute;nosylm&eacute;thionine (SAM), le substrat pour la plupart des r&eacute;actions m&eacute;thyltransf&eacute;rase. Cellules d&eacute;pourvues Met4p poussent normalement quand une SAM est ajout&eacute; aux m&eacute;dias ou un des g&egrave;nes SAM synth&eacute;tase est surexprim&eacute;. SAM est utilis&eacute;e comme un donneur de m&eacute;thyl dans trois r&eacute;actions Opi1p r&eacute;glement&eacute;s pour cr&eacute;er le phospholipide de la membrane abondante, la phosphatidylcholine. Nos r&eacute;sultats montrent que les cellules en pleine croissance exigent importante m&eacute;thylation, probablement pour la biosynth&egrave;se des phospholipides.

R&eacute;gulation coordonn&eacute;e du m&eacute;tabolisme du soufre et phospholipides refl&egrave;te l&#39;importance de la m&eacute;thylation dans la croissance des levures.

Un ceppo di lievito privo di Met4p, il principale regolatore di transcriptional del percorso di assimilazione dello zolfo, non pu&ograve; sintetizzare la metionina. Questo apparentemente semplice auxotroph non ha fatto crescere bene in multimediali contenenti metionina in eccesso, formando piccole colonie su piastre di lievito peptone/estrarre/destrosio. Pi&ugrave; veloce crescita grandi colonie erano abbondanti quando culture durante la notte sono state placcate, suggerendo che soppressori spontanee del difetto di crescita si presentano con alta frequenza. Per identificare le mutazioni soppressore, abbiamo usato il polimorfismo a singolo nucleotide genome-wide e standard analisi genetiche. I soppressori pi&ugrave; comuni erano mutazioni con perdita di funzione nel OPI1, codifica un repressore trascrizionale del metabolismo di fosfolipidi. Utilizzando un nuovo sistema che permette la degradazione rapida e specifica di Met4p, noi potremmo studiare l&#39;espressione dinamica di tutti i geni in seguito perdita di Met4p. Esperimenti utilizzando questo sistema con e senza Opi1p ha mostrato che Met4 attiva e Opi1p reprime geni che mantengono livelli di S-adenosilmetionina (SAM), il substrato per la maggior parte delle reazioni di metiltransferasi. Cellule manca Met4p crescono normalmente quando SAM viene aggiunto ai media o uno dei geni sintetasi SAM &egrave; overexpressed. SAM viene utilizzata come un donatore di metile in tre reazioni Opi1p regolamentati per creare i fosfolipidi di membrana abbondanti, fosfatidilcolina. I nostri risultati dimostrano che cellule in rapida crescite richiedano significativa metilazione, probabilmente per la biosintesi dei fosfolipidi.

Regolazione coordinata del metabolismo dello zolfo e fosfolipidi riflette l&#39;importanza della metilazione nella crescita del lievito.

We describe the development and characterization of a system that allows the rapid and specific induction of individual genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae without changes in nutrients or temperature. The system is based on the chimeric transcriptional activator Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Upon addition of the hormone Î²-estradiol, cytoplasmic GEV localizes to the nucleus and binds to promoters containing Gal4p consensus binding sequences to activate transcription. With galactokinase Gal1p and transcriptional activator Gal4p absent, the system is fast-acting, resulting in readily detectable transcription within 5 min after addition of the inducer. Î²-Estradiol is nearly a gratuitous inducer, as indicated by genome-wide profiling that shows unintended induction (by GEV) of only a few dozen genes. Response to inducer is graded: intermediate concentrations of inducer result in production of intermediate levels of product protein in all cells. We present data illustrating several applications of this system, including a modification of the regulated degron method, which allows rapid and specific degradation of a specific protein upon addition of Î²-estradiol. These gene induction and protein degradation systems provide important tools for studying the dynamics and functional relationships of genes and their respective regulatory networks.

Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.

Nous d&eacute;crivons le d&eacute;veloppement et la caract&eacute;risation d&#39;un syst&egrave;me qui permet l&#39;induction rapide et sp&eacute;cifique des g&egrave;nes individuels dans la levure Saccharomyces cerevisiae sans changements d&#39;&eacute;l&eacute;ments nutritifs ou de temp&eacute;rature. Le syst&egrave;me est bas&eacute; sur l&#39;activateur de la transcription chim&eacute;rique Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Lors de l&#39;addition de l&#39;hormone &beta;-estradiol, GEV cytoplasmique se localise au noyau et se lie aux promoteurs contenant des s&eacute;quences de liaison Gal4p consensus d&#39;activer la transcription. Avec galactokinase Gal1p et activateur de la transcription Gal4p absent, le syst&egrave;me est &agrave; action rapide, ayant pour r&eacute;sultat une transcription facilement d&eacute;tectable dans les 5 min apr&egrave;s addition de l&#39;inducteur. &Beta;-Estradiol est presque un inducteur gratuit, comme indiqu&eacute; par g&eacute;nome profilage qui montre une induction involontaire (par GEV) de seulement quelques dizaines de g&egrave;nes. R&eacute;ponse &agrave; inducteur est class&eacute; : interm&eacute;diaire des concentrations de r&eacute;sultat d&#39;inducteur dans la production des niveaux interm&eacute;diaires de prot&eacute;ine produit dans toutes les cellules. Nous pr&eacute;sentons des donn&eacute;es illustrant plusieurs applications de ce syst&egrave;me, y compris une modification de la m&eacute;thode de degron r&eacute;glement&eacute;, ce qui permet une d&eacute;gradation rapide et sp&eacute;cifique d&#39;une prot&eacute;ine sp&eacute;cifique lors de l&#39;addition de &beta;-estradiol. Ces syst&egrave;mes de d&eacute;gradation de l&#39;induction et la prot&eacute;ine g&egrave;ne fournissent des outils importants pour l&#39;&eacute;tude de la dynamique et les relations fonctionnelles des g&egrave;nes et de leurs r&eacute;seaux respectifs de r&eacute;gulation.

Action rapide et presque gratuite induction d&#39;&eacute;puisement expression et prot&eacute;ine de g&egrave;ne chez Saccharomyces cerevisiae.

Descriviamo lo sviluppo e la caratterizzazione di un sistema che permette l&#39;induzione rapido e specifico dei singoli geni nel lievito saccaromices cerevisiae senza cambiamenti nella temperatura o sostanze nutritive. Il sistema si basa sull&#39;attivatore trascrizionale chimerico Gal4dbd.ER.VP16 (GEV). Con l&#39;aggiunta di ormone &beta;-estradiolo, GEV citoplasmatica si localizza nel nucleo e si lega ai promotori contenenti sequenze Gal4p consenso vincolante per attivare la trascrizione. Con galattochinasi Gal1p e attivatore trascrizionale Gal4p assente, il sistema &egrave; fast-acting, con conseguente trascrizione facilmente rilevabili entro 5 min dopo l&#39;aggiunta dell&#39;induttore. &Beta;-estradiolo &egrave; quasi un induttore gratuito, come indicato dal genome-wide profilatura che mostra ad induzione non intenzionale (da GEV) di solo qualche decina di geni. Risposta a induttore &egrave; classificato: intermedio concentrazioni del risultato dell&#39;induttore nella produzione dei livelli intermedi di proteina prodotto in tutte le cellule. Vi presentiamo i dati che illustrano diverse applicazioni di questo sistema, tra cui una modifica del metodo degron regolamentati, che consente la degradazione rapida e specifica di una proteina specifica con l&#39;aggiunta di &beta;-estradiolo. Questi sistemi di degradazione ad induzione e proteina del gene forniscono strumenti importanti per lo studio delle dinamiche e rapporti funzionali di geni e le rispettive reti regolamentari.

Fast-acting e quasi gratuito ad induzione di esaurimento della proteina e di espressione di gene in Saccharomyces cerevisiae.

Methionine abundance affects diverse cellular functions, including cell division, redox homeostasis, survival under starvation, and oxidative stress response. Regulation of the methionine biosynthetic pathway involves three DNA-binding proteins-Met31p, Met32p, and Cbf1p. We hypothesized that there exists a "division of labor" among these proteins that facilitates coordination of methionine biosynthesis with diverse biological processes. To explore combinatorial control in this regulatory circuit, we deleted CBF1, MET31, and MET32 individually and in combination in a strain lacking methionine synthase. We followed genome-wide gene expression as these strains were starved for methionine. Using a combination of bioinformatic methods, we found that these regulators control genes involved in biological processes downstream of sulfur assimilation; many of these processes had not previously been documented as methionine dependent. We also found that the different factors have overlapping but distinct functions. In particular, Met31p and Met32p are important in regulating methionine metabolism, whereas p functions as a "generalist" transcription factor that is not specific to methionine metabolism. In addition, Met31p and Met32p appear to regulate iron-sulfur cluster biogenesis through direct and indirect mechanisms and have distinguishable target specificities. Finally, CBF1 deletion sometimes has the opposite effect on gene expression from MET31 and MET32 deletion.

Combinatorial control of diverse metabolic and physiological functions by transcriptional regulators of the yeast sulfur assimilation pathway.

Abondance de m&eacute;thionine affecte diverses fonctions cellulaires, y compris la division cellulaire, l&#39;hom&eacute;ostasie redox, la survie dans la famine et la r&eacute;ponse au stress oxydatif. R&eacute;gulation de la biosynth&egrave;se de la m&eacute;thionine implique trois prot&eacute;ines de liaison &agrave; l&#39;ADN-Met31p, Met32p et Cbf1p. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se qu&#39;il existe une &quot;division du travail&quot; parmi ces prot&eacute;ines qui facilite la coordination de la biosynth&egrave;se de la m&eacute;thionine avec divers processus biologiques. Pour explorer contr&ocirc;le combinatoire dans ce circuit r&eacute;glementaire, nous avons supprim&eacute; CBF1, MET31 et MET32, individuellement ou en combinaison dans une souche sans m&eacute;thionine synthase. Nous avons suivi l&#39;expression des g&egrave;nes du g&eacute;nome que ces souches ont &eacute;t&eacute; affam&eacute;s pour la m&eacute;thionine. En utilisant une combinaison des m&eacute;thodes bio-informatiques, nous avons constat&eacute; que ces r&eacute;gulateurs contr&ocirc;lent des g&egrave;nes impliqu&eacute;s dans les processus biologiques en aval de l&#39;assimilation de soufre ; bon nombre de ces proc&eacute;d&eacute;s n&#39;avaient pas auparavant &eacute;t&eacute; document&eacute;es comme la m&eacute;thionine d&eacute;pendante. Nous avons &eacute;galement constat&eacute; que les diff&eacute;rents facteurs sont chevauchent mais des fonctions distinctes. En particulier, Met31p et Met32p sont importants dans la r&eacute;gulation du m&eacute;tabolisme de la m&eacute;thionine, tandis que p fonctionne comme un facteur de transcription de &laquo; g&eacute;n&eacute;raliste &raquo; qui n&#39;est pas sp&eacute;cifique au m&eacute;tabolisme de la m&eacute;thionine. En outre, Met31p et Met32p semblent r&eacute;guler la biogen&egrave;se cluster fer-soufre au moyen de m&eacute;canismes directs et indirects et ont des sp&eacute;cificit&eacute;s distinguent cible. Enfin, suppression de CBF1 parfois a des effets oppos&eacute;s sur l&#39;expression g&eacute;nique contre la suppression de MET31 et MET32.

Combinatoire contr&ocirc;le de nombreuses fonctions m&eacute;taboliques et physiologiques par les r&eacute;gulateurs transcriptionnels de la voie d&#39;assimilation de soufre levure.

Abbondanza metionina colpisce diverse funzioni cellulari, tra cui la divisione cellulare, l&#39;omeostasi redox, sopravvivenza sotto la fame e la risposta allo stress ossidativo. Regolamento del percorso biosintetico metionina coinvolge tre DNA-binding proteins-Met31p, Met32p e Cbf1p. Abbiamo ipotizzato che esiste una &quot;divisione del lavoro&quot; tra queste proteine che facilita il coordinamento della biosintesi di metionina con diversi processi biologici. Per visitare il controllo combinatorio in questo circuito normativo, abbiamo eliminato CBF1, MET31 e MET32 singolarmente e in combinazione in un ceppo manca metionina sintasi. Abbiamo seguito l&#39;espressione di gene di genome-wide come questi ceppi erano morti di fame per la metionina. Utilizzando una combinazione di metodi di bioinformatica, abbiamo trovato che questi regolatori controllano geni coinvolti nei processi biologici a valle di assimilazione di zolfo; molti di questi processi ha avuto non precedentemente state documentate come metionina dipendente. Abbiamo anche trovato che i fattori differenti sono sovrapposti ma funzioni distinte. In particolare, Met31p e Met32p sono importanti nel regolare il metabolismo della metionina, mentre p funziona come un fattore di trascrizione &quot;generalista&quot; che non &egrave; specifico per il metabolismo della metionina. Inoltre, Met31p e Met32p sembrano regolare biogenesi cluster ferro-zolfo attraverso meccanismi diretti e indiretti e hanno specificit&agrave; di destinazione distinguibili. Infine, delezione di CBF1 a volte ha l&#39;effetto opposto sull&#39;espressione del gene da cancellazione MET31 e MET32.

Controllo combinatorio delle diverse funzioni metaboliche e fisiologiche di regolatori trascrizionali della via di assimilazione dello zolfo del lievito.

In yeast, the pathways of sulfur assimilation are combinatorially controlled by five transcriptional regulators (three DNA-binding proteins [Met31p, Met32p, and Cbf1p], an activator [Met4p], and a cofactor [Met28p]) and a ubiquitin ligase subunit (Met30p). This regulatory system exerts combinatorial control not only over sulfur assimilation and methionine biosynthesis, but also on many other physiological functions in the cell. Recently we characterized a gene induction system that, upon the addition of an inducer, results in near-immediate transcription of a gene of interest under physiological conditions. We used this to perturb levels of single transcription factors during steady-state growth in chemostats, which facilitated distinction of direct from indirect effects of individual factors dynamically through quantification of the subsequent changes in genome-wide patterns of gene expression. We were able to show directly that Cbf1p acts sometimes as a repressor and sometimes as an activator. We also found circumstances in which Met31p/Met32p function as repressors, as well as those in which they function as activators. We elucidated and numerically modeled feedback relationships among the regulators, notably feedforward regulation of Met32p (but not Met31p) by Met4p that generates dynamic differences in abundance that can account for the differences in function of these two proteins despite their identical binding sites.

Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.

Chez les levures, les voies de l&#39;assimilation de soufre sont combinatoirement contr&ocirc;l&eacute;es par cinq r&eacute;gulateurs transcriptionnels (trois prot&eacute;ines de liaison &agrave; l&#39;ADN [Met31p, Met32p et Cbf1p], un activateur [Met4p] et un cofacteur [Met28p]) et une sous-unit&eacute; de ligase ubiquitine (Met30p). Ce syst&egrave;me de r&eacute;glementation exerce un contr&ocirc;le combinatoire non seulement sur l&#39;assimilation de soufre et de la biosynth&egrave;se de la m&eacute;thionine, mais aussi sur beaucoup d&#39;autres fonctions physiologiques dans la cellule. R&eacute;cemment, nous avons caract&eacute;ris&eacute; un syst&egrave;me d&#39;induction de g&egrave;nes qui, suite &agrave; l&#39;ajout d&#39;un inducteur, r&eacute;sulte dans la transcription d&#39;un g&egrave;ne d&#39;int&eacute;r&ecirc;t dans les conditions physiologiques quasie imm&eacute;diate. Nous avons utilis&eacute; cela pour perturber les niveaux des facteurs de transcription unique durant la croissance stationnaire en ch&eacute;mostats, ce qui a facilit&eacute; la distinction de direct contre les effets indirects des facteurs individuels dynamiquement par le biais de quantification des changements ult&eacute;rieurs structure du g&eacute;nome de l&#39;expression g&eacute;nique. Nous avons pu montrer directement que Cbf1p agit parfois comme un r&eacute;presseur, tant&ocirc;t comme un activateur. Nous avons &eacute;galement constat&eacute; des circonstances dans lequel &eacute;voluent les Met31p/Met32p r&eacute;presseurs, ainsi que ceux dans lesquels ils op&egrave;rent comme activateurs. Nous avons &eacute;lucid&eacute; et mod&eacute;lis&eacute; num&eacute;riquement des relations de r&eacute;troaction entre les organismes de r&eacute;glementation, notamment de proaction r&egrave;glement de Met32p (mais pas de Met31p) par Met4p qui g&eacute;n&egrave;re des diff&eacute;rences dynamiques en abondance, ce qui peut expliquer les diff&eacute;rences observ&eacute;es en fonction de ces deux prot&eacute;ines malgr&eacute; leurs sites de fixation identique.

Analyse ax&eacute;e sur la perturbation et la mod&eacute;lisation du r&egrave;glement combinatoire dans la voie d&#39;assimilation de soufre levure.

In lievito, i percorsi di assimilazione dello zolfo combinatoriamente sono controllati da regolatori trascrizionali cinque (tre DNA-binding proteins [Met31p, Met32p e Cbf1p], un attivatore [Met4p] e un cofattore [Met28p]) e una subunit&agrave; della ligasi di ubiquitin (Met30p). Questo sistema normativo esercita controllo combinatorio non solo sull&#39;assimilazione dello zolfo e biosintesi di metionina, ma anche su molte altre funzioni fisiologiche nella cella. Recentemente abbiamo caratterizzato un sistema di induzione genica che, dopo l&#39;aggiunta di un induttore, si traduce in prossimit&agrave; immediata trascrizione di un gene di interesse in condizioni fisiologiche. Abbiamo usato questo a turbare i livelli di fattori di trascrizione singolo durante la crescita di stato stazionario in chemostati, che ha facilitato la distinzione di diretto da effetti indiretti dei singoli fattori in modo dinamico attraverso la quantificazione delle successive modifiche nel genome-wide pattern di espressione genica. Siamo stati in grado di dimostrare direttamente che Cbf1p a volte agisce come un repressore e a volte come un attivatore. Abbiamo trovato anche circostanze in cui funzione Met31p/Met32p come repressori, come pure quelli che funzionano come attivatori. Abbiamo chiarito e modellato numericamente rapporti di feedback tra i regolatori, in particolare il feedforward regolamento di Met32p (ma non Met31p) da Met4p che genera differenze dinamiche in abbondanza che possono spiegare le differenze in funzione di queste due proteine nonostante loro siti leganti identici.

Analisi basata su perturbazione e modellazione di combinatoria regolamento in via di assimilazione dello zolfo del lievito.

A general method for the dynamic control of single gene expression in eukaryotes, with no off-target effects, is a long-sought tool for molecular and systems biologists. We engineered two artificial transcription factors (ATFs) that contain Cys(2)His(2) zinc-finger DNA-binding domains of either the mouse transcription factor Zif268 (9 bp of specificity) or a rationally designed array of four zinc fingers (12 bp of specificity). These domains were expressed as fusions to the human estrogen receptor and VP16 activation domain. The ATFs can rapidly induce a single gene driven by a synthetic promoter in response to introduction of an otherwise inert hormone with no detectable off-target effects. In the absence of inducer, the synthetic promoter is inactive and the regulated gene product is not detected. Following addition of inducer, transcripts are induced >50-fold within 15 min. We present a quantitative characterization of these ATFs and provide constructs for making their implementation straightforward. These new tools allow for the elucidation of regulatory network elements dynamically, which we demonstrate with a major metabolic regulator, Gcn4p.

Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.

Une m&eacute;thode g&eacute;n&eacute;rale pour le contr&ocirc;le dynamique de l&#39;expression g&eacute;nique unique chez les eucaryotes, sans effets hors cible, est un outil depuis longtemps pour mol&eacute;culaire et biologistes des syst&egrave;mes. Nous avons con&ccedil;u deux facteurs de transcription artificiels (ATFs) qui contiennent des domaines de liaison &agrave; l&#39;ADN des doigts de zinc de le Cys(2)His(2) du facteur de transcription de souris Zif268 (9 bp de sp&eacute;cificit&eacute;) ou un tableau con&ccedil;u rationnellement de quatre doigts de zinc (12 bp de sp&eacute;cificit&eacute;). Ces domaines ont &eacute;t&eacute; exprim&eacute;es en fusions aux r&eacute;cepteurs des &oelig;strog&egrave;nes humains et domaine d&#39;activation VP16. Les ATFs peuvent provoquer rapidement un seul g&egrave;ne, conduit par un promoteur synth&eacute;tique en r&eacute;ponse &agrave; l&#39;introduction d&#39;une hormone autrement inerte sans effets d&eacute;tectables de hors-cible. En l&#39;absence de l&#39;inducteur, le promoteur synth&eacute;tique est inactif et le produit du g&egrave;ne r&eacute;glement&eacute; n&#39;est pas d&eacute;tect&eacute;. Apr&egrave;s ajout de l&#39;inducteur, relev&eacute;s de notes sont induites &gt; 50 fois moins de 15 min. Nous pr&eacute;sentons une caract&eacute;risation quantitative de ces ATFs et nous fournir des constructions permettant leur mise en &oelig;uvre simple. Ces nouveaux outils permettent l&#39;&eacute;lucidation des &eacute;l&eacute;ments du r&eacute;seau r&eacute;glementaire dynamiquement, qui nous d&eacute;montrent avec un r&eacute;gulateur m&eacute;tabolique majeur, Gcn4p.

Syst&egrave;mes de perturbation d&#39;expression g&egrave;ne synth&eacute;tique avec sp&eacute;cificit&eacute; rapide, accordable, seul g&egrave;ne chez la levure.

Un metodo generale per il controllo dinamico dell&#39;unico espressione dei geni negli eucarioti, senza effetti di fuori bersaglio, &egrave; uno strumento lungo cercato per molecolare e sistemi biologi. Abbiamo progettato due fattori di trascrizione artificiali (ATFs) che contengono domini di DNA-binding Cys(2)His(2) zinc-finger di entrambi i mouse fattore di trascrizione Zif268 (9 bp di specificit&agrave;) o una matrice razionalmente progettata di quattro dita di zinco (12 bp di specificit&agrave;). Questi domini sono stati espressi come fusioni al recettore estrogeno umano e al dominio di attivazione VP16. Il ATFs pu&ograve; indurre rapidamente un singolo gene, guidato da un promotore sintetico in risposta all&#39;introduzione di un ormone altrimenti inerte senza effetti rilevabili fuori bersaglio. In assenza di induttore, il promotore sintetico &egrave; inattivo e il prodotto del gene regolato non viene rilevato. A seguito di aggiunta dell&#39;induttore, le trascrizioni sono indotte &amp;gt; 50 volte entro 15 min. Noi presenti una caratterizzazione quantitativa di questi ATFs e forniscono costrutti per rendendo semplice la loro implementazione. Questi nuovi strumenti permettono per la delucidazione di elementi della rete regolamentare in modo dinamico, che dimostriamo con un importante regolatore metabolico, Gcn4p.

R. Scott McIsaac

The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics,
Graduate Program in Quantitative and Computational Biology

Princeton University

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

R. Scott McIsaac

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics,Graduate Program in Quantitative and Computational Biology

Princeton University

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

The Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics,
Graduate Program in Quantitative and Computational Biology