Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni GM046406 (a DB) e dal National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM riconosce finanziamenti del NSF Graduate Research Fellowship. MNM è supportata da un Lewis-Sigler Fellowship. Vorremmo ringraziare i membri del Botstein laboratorio per le discussioni utili e agli ex membri Allegra Petti e Nikolai Slavov per il loro contributo al progetto del ciclo metabolico. Ringraziamo Daniel Zenklusen e Robert Singer per averci iniziato con il metodo FISH.

Le figure 1 e 2 sono schemi delle procedure sperimentali pesce e gasdotti analisi dell&#39;immagine utilizzata per quantificare le immagini FISH. 1. Soluzioni per preparare * Le seguenti soluzioni sono per l&#39;uso di sonde Singer. Se si utilizza sonde Stellaris, sostituire &quot;40% formammide&quot; con &quot;10% formammide&quot; sia in tampone di ibridazione e di tampone di lavaggio. Ulteriori modifiche alla Tampone di Ibridazione quando utilizzano sonde Stellaris sono (1) Aggiungere 1 g di solfato di destrano e (2) non includono 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml di 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g di sorbitolo Buffer Spheroplasting 890 microlitri di buffer B VRC 100 microlitri 10 microlitri di 25.000 U / ml liticasi 2 microlitri β-mercaptoetanolo &lt;strong&gt; Tampone di ibridazione (10 ml, volume finale) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 microlitri 200 mM VRC magazzino 40 pl di 50 mg / ml di BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 10 ml di volume finale) 1 g di solfato di destrano * * Tampone di ibridazione può essere conservato in aliquote da 0,5 ml a -20 ° C per convenienza. Tampone di lavaggio (50 ml, volume finale) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 50 ml di volume finale) Etichettatura Buffer 1,06 g di carbonato di sodio 100 ml di acqua DEPC pH 9 2. Probe-etichettatura (Probes Singer soltanto) Otteniamo queste sonde per sintesi in-house usando un apparato di sintesi oligonucleotidi ABI. Typically, 4-5 ~ 50 bp oligonucleotidi sono sintetizzati che sono omologhi al gene di interesse, sostituendo timidina ammino-allil per diversi thymidines distanziati di almeno 8, preferibilmente + 10 bp a parte. A causa della loro sensibilità all&#39;ozono, lavoriamo in un impianto produce ozono durante l&#39;uso CY coloranti. <ol><li> Ottenere ~ 5 sonde e risospendere in 100 microlitri di acqua - le concentrazioni di controllo su Nanodrop. </li><li> Seconda del numero di sonde / gene, unire totale di 10 mcg / oligonucleotidi gene (ad esempio, se sono 5 sonde / gene, poi vogliono 2 mcg / sonda). </li><li> Utilizzare le colonne QIAquick per purificare le sonde secondo QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. </li><li> Aggiungere 10 volumi di tampone di PN al volume di sonde combinate e mix totale. </li><li> Applicare il campione di colonna QIAquick - se il volume totale è superiore a 750 ml, centrifugare due volte utilizzando la metà del volume in ogni giro </li><li> Lasciate riposare per 1 min. </li><li> Centrifugare 1 min a 6.000 giri. </li><li> Lavare con 750 microlitri di buffer PE. </li><li> Centrifugare1 min a 6.000 giri. </li><li> Smaltire flusso attraverso colonna e re-spin per 1 min a 13.000 rpm per asciugare. </li><li> Luogo colonna QIAquick in nuova provetta e DNA eluire con 50 ml H 2 O - Assicurarsi H 2 O pH è all&#39;interno di 7.0 e 8.5 ed è posto direttamente sulla membrana. </li><li> Lasciate riposare per 1 min. </li><li> Centrifugare per 1 min a 13.000 rpm per eluire il DNA. </li><li> Lyophilize DNA a 45 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 10 microlitri di buffer di etichettatura e aggiungere al tubo di tintura senza toccare il colorante. </li><li> Ripetere con un altro tampone di 10 microlitri di etichettatura. </li><li> Vortex e spin down tubo di tintura e di DNA. </li><li> Coprire le provette con un foglio di alluminio e conservare al buio a RT O / N di etichettare. </li><li> Ripetere QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. Eseguire con due differenze: - Aggiungere 200 microlitri di buffer PN alle sonde e mettere sonde marcate attraverso le colonne 2x. - Effettuare 3 lavaggi con tampone PE al fine di lavare via il colorante senza legami prima eluizione. </li><li> After eluizione ottenere la concentrazione tramite NanoDrop. L&#39;efficienza di etichettatura è tipicamente ~ 0.25 pmol / ng di DNA a singolo filamento. </li></ol> 3. Coverslip Preparazione <ol><li> Luogo coprioggetto su diapositive in plasma-preen camera a vuoto ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (il più vicino al centro è il migliore). </li><li> Mettere in forno a camera a vuoto e assicurarsi che sia sigillato. </li><li> Accendere pompa prima quindi accendere vuoto solo una volta pompa viene avviata. </li><li> Accendere il forno a microonde, e smettere di 5 sec dopo plasma è visibile. </li><li> Spegnere vuoto poi pompare. </li><li> Estrarre camera a vuoto e rimuovere coprioggetto con una pinza (quelli che sono caduti devono essere puliti di nuovo). </li><li> Luogo Coprivetrini lato ripulito in piastre da 12 pozzetti. </li></ol> 4. Procedura di fissazione <ol><li> Crescere lievito per un OD 600 di circa 0,1-0,2 in terreno minimo. 10 ml di cellule produce abbastanza for ~ 10 ibridazioni separati. </li><li> Aggiungere 1/10 di volume 37% di formaldeide direttamente ai mezzi di crescita (10 ml di coltura + 1 ml di 37% di formaldeide) e lasciate riposare per 45 min. </li><li> Lavare 2 volte con 1 ml di ghiaccio freddo tampone B in una provetta (può girare a 13.000 rpm per 1 min). </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone spheroplasting. </li><li> Incubare a 37 ° C per 15 min. Controllare le celle ogni pochi minuti sotto il microscopio fino maggior parte delle cellule sono di colore nero (cioè non di fase luminosa). </li><li> Lavare 2 volte con ghiaccio freddo tampone B, la filatura a bassa velocità (~ 3.500 giri). </li><li> Aggiungere 1 ml di EtOH 70%, risospendere delicatamente e lasciare per una notte a 4 ° C (può immagazzinare indefinitamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedura di ibridazione <ol><li> Preparare la soluzione di ibridazione: a 100 l di tampone di ibridazione, aggiungere 1-3 ml di sonda, poi vortice e centrifuga. Sonde Singer usano 8-10 ng totale per set sonda (cioè per ogni gene). Abbiamo ripreso fino a 3 geni simultaneamente con 3 difrenti sonda marcata imposta. </li></ol> Assicurati di riscaldare la soluzione di ibridazione a temperatura ambiente prima di aprirlo. Per le sonde Stellaris, si consiglia di iniziare a 4 reazioni di ibridazione separati con l&#39;aggiunta di 1 ml ciascuna di 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluizioni di lavoro di sonde per vedere quale è ottimale. Diluizioni di lavoro di sonde Stellaris sono preparate in tampone di ibridazione. <ol start="2"><li> Centrifuga (per tutti i passi successivi; 3.500 giri; 5 min) le cellule fisse (ad esempio 200 ml) e aspirare via l&#39;etanolo. </li><li> Risospendere delicatamente in 1 ml di tampone di lavaggio che contiene la stessa percentuale di formammide come tampone di ibridazione. Lasciate riposare per 2-5 min. </li><li> Centrifugare campione e tampone di lavaggio aspirato, quindi aggiungere la soluzione di ibridazione. Incubare al buio con un leggero scuotimento, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: la seguente procedura è valida per l&#39;applicazione di cellule / di imaging su vetrini. Per wincenerimento / cellule di imaging in piastre a 96 pozzetti, tra cui soluzione alternativa al tesoro specie reattive dell&#39;ossigeno vedere <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Il giorno dopo, o in anticipo, pulito (vedi procedura) e il trattamento di vetrini con 150 ml 0.01% Poli-L-lisina per 5 min. Aspirare, lasciate asciugare, lavare 3 volte con dH 2 O e lasciare asciugare. </li><li> In mattinata, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per il campione, risospendere delicatamente, centrifuga e aspirare, poi risospendere in un altro 1 ml di tampone di lavaggio e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare con SSC 2X + 0,1% Triton X-100 a RT 15 minuti su agitatore. </li><li> Prendete mezzo di montaggio dal freezer per permettergli di venire a RT prima del montaggio. </li><li> Lavare con 1X SSC a temperatura ambiente 15 minuti su agitatore. </li><li> Diluire DAPI in PBS (0,1 mcg / ml finale) e risospendere le cellule in 150 microlitri. </li><li> Luogo soluzione sulla pulizia / poli-lys-treated vetrini a 12-pozzetti; almeno 30 min indisturbati. </li><li> Rimuovere la soluzione (si può metterlo su un vetrino di ricambio come backup) e lavare 3 volte con 1 ml di PBS 1X. </li><li> Mettere 3 ml di prolungare oro mezzo di montaggio su un vetrino (Invitrogen P36934). Fate questo uno alla volta se si dispone di più vetrini per evitare l&#39;essiccamento del mezzo di montaggio. </li><li> Aggiungi ~ 0,5 ml di etanolo al coprioggetto a 12-pozzetti, rimuovere il vetrino e l&#39;aria secca mentre si tiene con una pinzetta. </li><li> Posizionare coprire cellula-side scivolare giù sul mezzo di montaggio e lasciare indurire diverse ore o O / N nel buio. </li><li> Sigillare i bordi con smalto e procedere con l&#39;imaging. </li></ol> 6. Imaging di cellule con Olympus IX-81 invertito Microscopio Panoramica <ol><li> Per l&#39;acquisizione delle immagini che utilizziamo Slidebook (intelligente-imaging.com) software e una, 1,45 NA, obiettivo olio TIRFM 100X. Per GFP seriale, DAPI, Cy3, Cy3.5 e Cy5 di imaging: set di filtri Chroma (vedi reagenti). </li><li> Usa filtro DAPIdi trovare e mettere a fuoco le cellule. </li><li> Impostare questo come punto di riferimento. </li><li> Prendete un z-pila di immagini di tutto il punto di riferimento in cui la distanza totale è di 5 micron di dimensione 0,2 micron (25 aerei). Ripetere l&#39;operazione per ogni canale colorante (cioè insieme ogni sonda). </li><li> Esportare come TIFF a 16 bit per l&#39;analisi delle immagini. </li></ol> 7. Image Analysis Panoramica (Probes Singer) Di seguito forniamo una descrizione dei metodi di calcolo che usiamo per analizzare le immagini FISH in MATLAB. Le funzioni MATLAB rilevanti utilizzati sono bracketing sulla destra. Gli algoritmi e le soglie sono attualmente messi a punto per i dati provenienti da sonde di stile Singer. Utilizzando sonde stile Stellaris richiederà qualche aggiustamento, in particolare alla fase di filtraggio finale (7.8). Cella di identificazione 15 <ol><li> Celle separate da sfondo utilizzando una soglia globale su DAPI immagini 16 [graythresh]. </li><li> Identificare nuclei utilizzando la funzione maxima esteso [imextendedmax]. </li><li> Cellule del segmento con il nucleo come i semi per un algoritmo spartiacque [spartiacque]. </li></ol> Trova località in ogni canale di fluorescenza <ol start="4"><li> Eseguire la trasformazione tophat per normalizzare sfondo e migliorare il rapporto segnale-rumore [bwmorph]. </li><li> Trovare maxima per identificare lo strato a fuoco (nel piano z) per ciascuna macchia [imregionalmax]. </li><li> Filtra i potenziali punti utilizzando un modello di regressione lineare di una sfumatura radiale. </li></ol> Intensità macchia Misurare e filtrare i segnali singoli vs multipla della sonda <ol start="7"><li> Montare un profilo gaussiano 2D al posto nello strato a fuoco precedentemente identificate e l&#39;intensità stima 17. </li><li> Filtrare i punti deboli che utilizzano una soglia (basata su istogramma). Per le sonde di tipo Singer questo è importante, ma lo è meno per sonde Stellaris. </li><li> Contare i punti in ogni cella. </li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ad oggi, pesce è stato principalmente un metodo a basso rendimento. L&#39;uso di Cy3, Cy3.5, e Cy5 coloranti limita il numero di geni si può investigare in celle singole a tre alla volta. Alcune sonde aggiuntive sono state sviluppate (Stellaris), ma il numero di sonde distinguibili è ancora al massimo sette. Per aggirare questa limitazione, strategie di etichettatura combinatorie utilizzando più fluorofori sono stati utilizzati per creare codici a barre per diverse specie di mRNA 19,20. Più di recente, Lubecca e Cai utilizzati barcoding ottica e spettrale per quantificare 32 specie diverse contemporaneamente con il pesce in cellule di lievito singole 19. Una limitazione di questo recente approccio combinatorio è necessario l&#39;utilizzo di microscopia super-risoluzione. L&#39;analisi necessari per distinguere le sonde barcoded è anche abbastanza complessa. Abbiamo scoperto che Cy3 e Cy3.5 sono preferibili a Cy5 per esperimenti di FISH. Una delle limitazioni della Cy5 colorante è la sua sensibilitàa photobleaching. Tuttavia, Stellaris ha recentemente sviluppato Cy5 varianti che sono pubblicizzati come più resistente alla fotodegradazione, e può alleviare questo problema tecnico. E &#39;anche interessante notare che il pesce è un metodo costoso da implementare e che entrambi cantante e Stellaris sonde in genere costano $ 700 - $ 1.000 per set di sonde, anche se i prezzi per le sonde disponibili in commercio dovrebbero diminuire in futuro. Risparmiando di reagenti e di etichettatura efficiente porta sonde Singer fino alla gamma più bassa di prezzo. Una delle principali sfide tecniche è la separazione delle macchie sonda unica o multipla, che richiede l&#39;implementazione di sofisticati algoritmi di spot-determinano. Questo può richiedere un&#39;ampia revisione manuale per sintonizzare i parametri di analisi delle immagini per specifici apparati sperimentali. Un profilo della nostra pipeline di calcolo con funzioni rilevanti MATLAB è fornita nella Sezione 7 del protocollo. Questo problema è in qualche modo alleviata dalle sonde Stellaris che hanno solo<html> un&#39;etichetta per ogni sonda. Si richiede pertanto la colocalizzazione di più sonde di vedere un segnale. Poiché FISH richiede fissaggio cellule, non facilita tracciamento singole cellule nel tempo. In precedenza, abbiamo utilizzato i dati dello snapshot di pesce per ricostruire la dinamica di espressione genica nei singoli metabolicamente ciclismo lievito popolazioni 6. Ciclismo metabolica è osservato in pre-fame, culture in continuo, ed è caratterizzata da popolazione a livello di oscillazioni collettive del consumo di ossigeno. Queste oscillazioni sono associati con genoma oscillazioni di trascrizioni che si verificano per la metà di tutti i geni di lievito nelle diverse fasi del consumo di ossigeno. Abbiamo cercato di determinare se il ciclismo metabolica era presente in colture di lievito continue non sincronizzate. Se presente, trascritti che sono anti-correlate in popolazioni sincroni dovrebbero essere anti-correlata in singole cellule non sincronizzate, e viceversa per trascrizioni correlate. ent &quot;&gt; Per ricostruire la dinamica della produzione di mRNA nel tempo, i dati dell&#39;istantanea osservati deve essere paragonato a quello che ci si aspetta da un modello del comportamento sottostante. ci sono limiti teorici a quando queste&quot; istantanee &quot;dei dati di espressione genica possono essere utilizzati per determinare le sottostanti dinamiche di espressione genica e quali tipi di modelli possono essere distinti 21. Per i dati relativi al ciclo metabolico, piuttosto che mostrare direttamente la presenza di oscillazioni temporali, misurazioni statistiche sono state attuate a sostegno che esiste effettivamente una cella programma oscillatorio autonomo coerente con microarray di massa misurazioni.

Utilizzando tecniche di misura rinfusa, non è possibile l&#39;analisi del numero di trascritti o attività trascrizionale nelle cellule singole 1. Utilizzando proteine ​​fluorescenti guidati dai promotori di interesse come reporter di espressione genica in grado di risolvere questo problema in qualche misura, ma il tempo necessario per proteine ​​fluorescenti per piegare oscura primi dinamiche. Proteine ​​fluorescenti a lunga vita, inoltre, non possono segnalare vite mRNA. Il metodo FISH può essere utilizzato per test di mRNA durante il suo intero ciclo di vita, da inizio della trascrizione nel nucleo per la successiva maturazione e decomposizione in celle singole, con risoluzione di una singola molecola. L&#39;originale in esperimenti in situ per la visualizzazione di acidi nucleici utilizzati sonde di RNA radiomarcato per sondare elementi di DNA. Tra questi la visualizzazione del DNA ribosomiale nelle ovaie della rana Xenopus laevis 2 e DNA satellite nel tessuto del mouse 3. Il primo fluorescente in situ experrienza si utilizzata una molecola di RNA marcato con un fluoroforo per sondare particolari sequenze di DNA 4. La prima applicazione di sonde fluorescenti per la visualizzazione di RNA in situ era la visualizzazione di espressione genica actina di pollo in coltura tessuto muscolare 5. Più recentemente, nel lievito gemmazione, FISH è stata usata per studiare oscillazioni nella trascrizione durante il ciclo metabolico lievito 6, il decadimento di mRNA durante la progressione del ciclo cellulare 7, e la localizzazione spaziale dei trascritti di mRNA durante la mitosi 8. FISH è stato utilizzato nel lievito per dimostrare che le fluttuazioni non correlati in geni costitutivamente trascritti, che costituiscono più della metà di tutti i geni di lievito, nascono dalla non correlata trascrizione iniziazione 9. Nella specie non lievito, pesce è stato utilizzato per identificare marcatori di cellule staminali a livello intestinale del mouse 10 e di determinare che penetranza incompleta dei destini delle cellule può derivare da fluttuazioni stocastiche gene espressione in C.elegans embrioni 11. Il metodo FISH descritta qui funziona da ibridare etichettati tintorie, sonde di DNA a singolo filamento di mRNA messaggi. Le cellule vengono esposte e mRNA vengono conteggiati utilizzando un algoritmo di punto di rilevamento. Sonde a singolo filamento possono essere generati con un sintetizzatore di DNA e quindi etichettati (di cui qui come sonde Singer) o ordinati in commercio come sonde pre-etichettati (sonde Stellaris) 12,13. Una delle principali differenze tra le sonde cantante e Stellaris è che le sonde Singer sono più lunghi (~ 50 bp) e sono multi-etichettati, mentre le sonde Stellaris sono brevi (~ 20 bp) con una sola etichetta per ogni sonda, come descritto da Raj et al 14. Inoltre, l&#39;approccio Stellaris utilizza molte altre sonde per gene di quella di Singer (~ 30 contro 5 sonde per gene, rispettivamente). Qui di seguito forniamo un protocollo che descrive l&#39;uso di entrambi i tipi di sonda. Nella sezione 2, forniamo un protocollo per l&#39;etichettatura di amino-allil sonde timidina contenenti won una tintura Cy scelto. Una panoramica dei passi computazionali necessari per individuare i punti singoli di mRNA è fornita nella Sezione 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

L&#39;ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo permette di rilevare acidi nucleici nell&#39;ambiente cellulare nativo. Qui forniamo un protocollo per l&#39;utilizzo di FISH per quantificare il numero di mRNA in cellule di lievito singoli. Cellule possono essere coltivate in qualsiasi condizione di interesse e poi fissate e rese permeabili. Successivamente, multiple deoxyoligonucleotides singolo filamento coniugati a coloranti fluorescenti sono usati per etichettare e visualizzare mRNA. Fluorescenza diffrazione limitata dalle singole molecole di mRNA è quantificato utilizzando un algoritmo spot-rilevamento per identificare e contare il numero di mRNA per cellula. Mentre i metodi di quantificazione più standard di Northern blot, RT-PCR e microarray di espressione genica forniscono informazioni su mRNA media nella popolazione rinfusa, FISH facilita sia il conteggio e la localizzazione di questi mRNA in cellule singole a risoluzione di una singola molecola.

La figura 3 mostra istogrammi tipici calcolate mediante immagini FISH e utilizzato per determinare il numero di mRNA presenti in cellule singole. Un importante vantaggio di microscopia basata quantificazione RNA è che si possono ottenere informazioni sulla localizzazione dei trascritti. Per esempio, abbiamo usato FISH per identificare gli mRNA in cellule singole con un inducibile CBF1 allele (Figura 4). Poiché molte molecole di mRNA presenti nel sito di trascrizione, siamo in grado di identificare la presenza e la posizione dei siti di trascrizione all&#39;interno del nucleo. Utilizzando coloranti diversi da mRNA etichetta di geni differenti, si può quantificare molteplici specie di mRNA nelle stesse cellule. Per dimostrare questo, le cellule di lievito sono state incubate in presenza di α-factor e sorbitolo. FUS1 trascrizione (Quasar670 colorante, rosso) è indotta da α-fattore. Trascrizione STL1 (Quasar 570 colorante, verde) è indotta da un aumento della osmolarità extracellulare ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 è un esempio di FISH con sonde Singer. Figura 5 è riportato un esempio di FISH con sonde Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della procedura sperimentale FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Schema del gasdotto di analisi di immagine. I punti finali sono determinati nella figura a destra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Istogramma di intensità a pronti per un particolare gene utilizzando sonde Singer </strong&gt;. Intensità della sonda vengono calcolati sia all&#39;interno (rosso) e le cellule esterne (blu). Spot a bassa intensità sono sia rumore o sonde singoli. Messaggi di mRNA reali sono etichettati con sonde multiple. Quando si utilizzano sonde Stellaris, sonde singole sono meno rilevabili e quindi le soglie e filtraggio devono essere adeguati di conseguenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati rappresentativi del procedimento FISH Singer. In questo esperimento, CBF1 trascrizione è attivata con un promotore inducibile 18. I nuclei sono colorati blu con DAPI. CBF1 mRNA sono contrassegnati con sonde Cy3-etichettati. Frecce bianche evidenziano la presenza di siti CBF1 trascrizione nel nucleo. MRNA trascritti singole sono visibili nel citoplasma. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Risultati rappresentativi del procedimento FISH Stellaris. Cellule di lievito Mata sono stati esposti contemporaneamente a 30 ng / ml di α-factor e 0,75 M sorbitolo per 10 minuti e sono stati contemporaneamente sondati per FUS1 (Quasar 670, rosso) e STL1 (Quasar 570, verde) trascrizioni. Nella casella evidenziata, possiamo vedere una cellula risponde solo al feromone (FUS1 sito di inizio, rosso) e un altro prevalentemente rispondere alle sorbitolo (STL1 sito di inizio, verde).

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per eseguire fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per il conteggio mRNA in cellule singole a risoluzione di una singola molecola.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.7K Views.  Princeton University. Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per eseguire fluorescenza In situ Ibridazione (FISH) per il conteggio mRNA in cellule singole a risoluzione di una singola molecola.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).