Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Riepilogo

Qui si descrivono come ottimizzare l'immagine video acquisiti per un olfattivo magnetico-legare (OMT) apparato. Ci descrivono anche due protocolli campione sperimentale per lo studio visuo-olfattiva fusione.

Abstract

Insetti volanti utilizzare segnali visivi di stabilizzare la loro voce in un flusso di vento. Molti animali inoltre traccia odori portato dal vento. Come tale, la stabilizzazione visiva di bolina monitoraggio direttamente aiuti nel monitoraggio degli odori. Ma i segnali olfattivi influenzano direttamente il comportamento visivo di tracciamento indipendente di spunti vento? Inoltre, recenti progressi nella olfattiva genetica molecolare e la neurofisiologia hanno motivato romanzo analisi quantitative comportamentali per valutare l'influenza del comportamento di (ad esempio) geneticamente inattivando specifici circuiti di attivazione olfattiva. Abbiamo modificato un sistema magnetico tether originariamente ideato per gli esperimenti di visione dotando l'arena con pennacchi strette a flusso laminare odore. Qui ci concentriamo su esperimenti che può essere eseguita dopo una mosca è legato ed è in grado di navigare in campo magnetico. Mostriamo come acquisire immagini video ottimizzato per la misurazione dell'angolo del corpo, come giudicare il monitoraggio stabile odore, e ci illustrano due esperimenti per esaminare l'influenza dei riferimenti visivi sul monitoraggio degli odori.

Protocollo

L'OMT è un adattamento di un sistema di legare magnetico ^{1, intesa} a incorporare un simulatore virtuale ² pennacchio. I seguenti protocolli spiega come ottimizzare le immagini video acquisite (Parte 1) ed eseguire due tipi di base visuo-olfattiva esperimenti (parte 2 e 3).

Parte 1: Acquisizione Video

Ottimizzare l'immagine video è di fondamentale importanza per la qualità dei dati acquisiti. Seguire questi passaggi per immagini più nitide.

1. Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze.
2. Posizionare la firewire board camera (Fuoco-I 1394store.com) sotto la camera a vuoto in acrilico trasparente in modo che la telecamera è direttamente verso l'alto attraverso la camera, attraverso un tubo di vetro, per l'aspetto ventrale della mosca legato. Assicuratevi che non ci sia rivestimento filtro IR sull'obiettivo del sistema video.
3. Per illuminare il volo, utilizzare un array circolare di LED a infrarossi (Small-Parts Inc) posizionato appena sotto i pannelli a LED. Attenzione ogni LED sul corpo della mosca individualmente per un'illuminazione uniforme.
4. Per ridurre i riflessi dal sistema di pannello e per ridurre al minimo segnali visivi osservato dalla mosca, è utile per ricoprire tutte le superfici riflettenti all'interno della telecamera con vernice nera opaca. Luci della stanza deve essere spento per ridurre l'abbagliamento e modulazioni luminosità rilevabile ad occhio della mosca.
5. Ispezionare visivamente l'immagine della telecamera. La mosca dovrebbe essere bianco luminoso su uno sfondo nero. Se l'immagine è sfocata la lente può essere necessario a fuoco. Se il volo è scuro, la matrice di LED può essere sfocata o non sufficientemente alimentato per l'illuminazione adeguata. Se lo sfondo contiene oggetti luminosi, montare un disco di carta gregge nero appena sopra al volo per minimizzare riflessione di fondo.
6. Noi acquisire video con subroutine personalizzati scritti in Matlab utilizzando la casella degli strumenti di acquisizione di immagini.

Parte 2: La mosca trovare il pennacchio odore

Un semplice esperimento in OMT si assiste ad un affamato (affamato) volano localizzare e poi attivo il monitoraggio di un pennacchio di odore di cibo attraente. Manipolando l'ambiente influenza la capacità visiva della mosca di tenere traccia con fermezza un odore appetitivo cibo. Si noti che gli esperimenti sono tipicamente eseguiti in un formato blocco casuale di ridurre al minimo ogni pregiudizio in ordine sperimentale. Tutto l'hardware esterno (multiplexer gas, arena LED, acquisizione video) sono controllati da routine software personalizzati scritti in Matlab (Mathworks).

1. Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze.
2. Prima di ogni esperimento, con un'indicazione sul display, ruotare il volano per alcuni giri ³ per garantire un movimento fluido intorno l'intero asse di imbardata 360. Se il volo non gira senza problemi lo scarto. Se il problema persiste, la causa probabile è magneti allineata. Nota: Se la distribuzione di campo in direzione di traiettorie diverse nel corso del processo di spin mostra picchi significativi (cioè non è piatto a 360 gradi), molto probabilmente c'è un bias di orientamento a causa di magneti allineati.
3. Presente al volo con le seguenti condizioni campione sperimentale in ordine casuale: i) ad alto contrasto modello a strisce con il vapore acqueo proveniente dal porto odore, ii) ad alto contrasto motivo a righe con odore di vapore attraente; iii) una striscia singola offset verticale di 90 gradi dall'ugello vapore acqueo, e iv) una singola striscia di offset di 90 gradi con vapore odore. Nella nostra esperienza, intervalli di 30 secondi funzionano bene per gli esperimenti in cui sono sfidati vola a individuare la fonte degli odori per conto proprio. Noi acquisire video a 30 Hz per la durata di ogni condizione sperimentale e analizzare le immagini in linea con le routine software personalizzato scritto in Matlab (una delle più utili funzioni built-in Matlab è regionprops.m che analizza le proprietà geometriche di un'ellisse.
4. Quando si usano concentrazioni elevate odore, l'odore residuo può essere rilasciato dal porto odore dopo che l'odore è spento. Per minimizzare eventuali effetti che questo può avere, è utile per far girare al volo per qualche secondo con un panorama di rotazione per consentire al sistema per scovare ogni odore residuo.
5. E 'utile anche per ruotare visivamente al volo tra i trattamenti sperimentali (i) mantenere le mosche attivamente impegnati nella sperimentazione e di (ii) mantenere vola da rimanere fermi in un posto. Un esperimento esempio può avere il seguente ordine: i) ventiduesimo giro iniziale di diagnosi; ii) cinque secondo giro intermedi; iii) venti coppia seconda condizione # 1; iv) cinque secondo giro intermedi; v) venti coppia seconda condizione # 2.

Parte 3: La mosca rimanendo entro il pennacchio odore

Un secondo esperimento di base nella OMT è quello di trascinare visivamente una mosca in un pennacchio odore, istantaneamente il cambiamento delle condizioni visive, e quindi misurare la sua capacità di rimanere nel pennacchio. Anche in questo caso, si noti che tutti gli esperimenti vengono eseguiti in un blocco casuale format per minimizzare ogni pregiudizio in ordine sperimentale.

1. Mettere una mosca appena legato in campo con un paio di pinze.
2. Visivamente ruotare (spin) i tempi di volo diversi in tutto il campo prima di ogni esperimento come un controllo diagnostico per garantire che l'animale ha la capacità di orientarsi in ogni direzione (cfr. parte 2.2).
3. Prima di ogni condizione, accendere l'odore sperimentale (acqua o aceto) e visivamente "trascinare" la mosca nel pennacchio da oscillanti una piccola striscia verticale in corrispondenza della posizione del pennacchio. Questa sfrutta il comportamento potente fissazione striscia osservato nei moscerini [4].
4. Ora che il volo è orientata verso il pennacchio, rimuovere la striscia oscillante e presentano le condizioni di esempio seguente visiva: i) strisce ad alto contrasto panoramica con il vapore acqueo (Fig. 1A), ii) sfondo uniforme con il vapore acqueo (Fig. 1B); iii) strisce ad alto contrasto panoramica con l'odore del vapore (Fig. 1C), iv) di sfondo uniforme, con odore di vapore (Fig. 1D). Acquisire video come in 2.3. Un esperimento esempio può avere il fluire ordine: i) ventiduesimo giro diagnostica iniziale, ii) cinque secondi oscillazione striscia pennacchio, iii) venti coppia seconda condizione # 1; iv) cinque secondi oscillazione striscia pennacchio; v) venti coppia seconda condizione # 2 .

Rappresentante dei risultati:

Figura 1

Parte 1 spiega come ottimizzare le immagini video OMT. L'immagine video deve avere una chiara visione della mosca illuminato su uno sfondo scuro nero. Eccessivamente immagini luminose può essere migliorata riducendo le interferenze di fondo, riducendo l'intensità dei LED a infrarossi, o spegnendo le luci della stanza. Se il volo è illuminato in modo improprio, regolando la messa a fuoco dei LED IR o modulando l'intensità dei LED IR potrebbe risolvere il problema. Parti 2 e 3 descrivono per condurre semplici esperimenti per verificare il corretto funzionamento di un OMT. In tutti i casi, una mosca dovrebbe essere visivamente "forzato" (via risposte optomotor) per ruotare alcuni giri in campo per garantire un regolare e completa gamma di movimento. Nella parte 2 una mosca è sfidato a trovare un pennacchio odore di per sé. Per mantenere il volo impegnati nell'esperimento, per ridurre l'effetto del rilascio di odori residui, e per mantenere vola da mantenere una sola voce tutto l'esperimento, è utile per ruotare visivamente al volo per alcuni secondi tra prove. Una mosca non dovrebbe mai localizzare un pennacchio di vapore acqueo in misura significativa, e deve sempre localizzare un pennacchio di odore in presenza di ricchi spunti visuali panoramiche. Nella parte 3 una mosca è visivamente trascinato direttamente in un pennacchio odore e sfidato a mantenere la sua voce all'interno del pennacchio contro una varietà di ambienti visuali fisse. Se il volo viene trascinato in un pennacchio di vapore acqueo, dovrebbe allontanarsi rapidamente. Se il volo viene trascinato in un pennacchio odore e non ci sono sufficienti indizi visivi per mediare inseguimento robusto, la mosca rimarrà nel pennacchio.

Discussione

L'acquisizione delle immagini di questo sistema utilizza una telecamera a bordo poco costoso firewire e software scritto in Matlab. Immagini chiare sono cruciali per ottenere precise tracce di dati. Le strategie sopra descritte sono utili per ripulire le immagini in questo sistema. Altri video di procedure di monitoraggio per questo sistema sono stati descritti ^1. Inoltre, questo sistema potrebbe essere facilmente modificato per includere in tempo reale il monitoraggio video. I protocolli sperimentali ese...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Firewire camera	1394store.com	Fire-I board camera BW	4.3mm lens no IR coating
IR LEDs	Small Parts, Inc.
Black spray paint	Rustoleum		Flat black
Black flock paper	Edmund Scientific
Panel system	Caltech		3
Matlab 2006a	Mathworks		Image acquisition toolbox