Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

Resumo

Aqui nós descrevemos como otimizar a imagem de vídeo adquiridos para uma corda magnética olfativo (OMT) aparelho. Descrevemos também dois protocolos de amostragem experimental para estudar visuo-olfativa de fusão.

Resumo

Insetos voadores usar pistas visuais para estabilizar a sua posição em um fluxo de vento. Muitos animais adicionalmente faixa odores transportados pelo vento. Como tal estabilização, visual de rastreamento diretamente contra o vento auxilia no acompanhamento odor. Mas sinais olfativos influenciam diretamente o comportamento acompanhamento visual de forma independente a partir de pistas de vento? Além disso, os recentes avanços na genética molecular e olfativos neurofisiologia têm motivado novas análises quantitativas de comportamento para avaliar a influência do comportamento de (por exemplo) geneticamente inativação específica circuitos ativação olfativo. Nós modificamos um sistema de corda magnética originalmente concebido para experimentos visão, equipando a arena com estreitas laminar plumas odor de fluxo. Aqui nos concentramos em experimentos que podem ser realizadas após uma mosca é preso e é capaz de navegar na arena magnético. Nós mostramos como adquirir imagens de vídeo otimizado para medir o ângulo do corpo, como juiz de rastreamento odor estável, e nós ilustrar dois experimentos para analisar a influência de pistas visuais sobre rastreamento odor.

Protocolo

A OMT é uma adaptação de um sistema de corda magnética ^{1, destinada} a incorporar a ² simulador virtual pluma. Os protocolos a seguir irá explicar como otimizar as imagens de vídeo adquirida (Parte 1) e executar dois tipos básicos de experimentos visuo-olfativa (Parte 2 e 3).

Parte 1: Aquisição de Vídeo

Otimizar a imagem de vídeo é fundamental para a qualidade dos dados adquiridos. Siga estes passos para imagens mais limpas.

1. Coloque uma mosca recém amarrado na arena usando um par de fórceps.
2. A posição da câmera firewire bordo (Fire-I 1394store.com), sob a câmara de vácuo de acrílico transparente de tal forma que a visão da câmera é diretamente para cima através da câmara, através de um tubo de vidro, para a face ventral da mosca amarrados. Certifique-se que não há revestimento IR filtro na lente do sistema de vídeo.
3. Para iluminar a mosca, use um arranjo circular de LEDs infravermelhos (Small Parts-Inc) posicionado logo sob os painéis de LED. Foco cada LED no corpo da mosca individualmente para uma iluminação uniforme.
4. Para reduzir o brilho do sistema de painel e para minimizar pistas visuais observados pela mosca, é útil para revestir todas as superfícies reflexivas dentro da visão da câmera com tinta preta fosca. Luzes da sala deve ser desligado para reduzir o brilho e luminosidade modulações detectáveis ​​pelo olho da mosca.
5. Inspecionar visualmente a imagem da câmara. A mosca deve ser branco brilhante contra um fundo preto. Se a imagem é desfocada a lente pode precisar de ser focado. Se a mosca é escuro, a matriz de LEDs podem ser desfocado ou insuficientemente alimentado para uma iluminação adequada. Se o fundo contém objetos brilhantes, montar um disco de papel rebanho preto um pouco acima do fly para minimizar a reflexão de fundo.
6. Nós adquirimos vídeo com sub-rotinas personalizadas escritas em Matlab usando a caixa de ferramentas de aquisição de imagens.

Parte 2: A mosca encontrar a pluma de odor

Um experimento simples na OMT está observando uma mosca (fome) e depois com fome localizar ativamente rastreamento uma pluma de odor alimento atrativo. Manipular o ambiente visuais influencia a capacidade da mosca robusta para controlar um odor de alimentos apetitivo. Note-se que os experimentos são normalmente executados em um formato de blocos ao acaso para minimizar qualquer preconceito, a fim experimental. Todo o hardware externo (multiplexers de gás, arena LED, aquisição de vídeo) são controladas por rotinas de software personalizado escrito em Matlab (Mathworks).

1. Coloque uma mosca recém amarrado na arena usando um par de fórceps.
2. Antes de cada experimento, utilizando o display visual, gire a voar por várias revoluções ³ para assegurar um movimento suave em torno do eixo de guinada todo 360. Se a mosca não gira suavemente descartá-lo. Se o problema persistir, a causa provável é ímãs desalinhados. Nota: Se a distribuição de arena indo para várias trajetórias durante o julgamento de spin mostra picos significativos (ou seja, não é plana mais de 360 ​​graus), provavelmente há um viés de orientação devido aos ímãs desalinhados.
3. Apresentar a voar com as condições experimentais de exemplo a seguir em ordem aleatória: i) de alto contraste-padrão listrado com vapor de água que emana do porto odor; ii) de alto contraste padrão listrado com odor atraente vapor; iii) uma única faixa deslocamento vertical de 90 graus do bico de vapor d'água, e iv) a 90 graus única faixa compensada com vapor de odor. Em nossa experiência, intervalos de 30 segundos funcionam bem para os experimentos onde as moscas são desafiados a localizar a fonte do odor por conta própria. Adquirimos de vídeo de 30 Hz para a duração de cada condição experimental e analisar as imagens offline usando rotinas de software personalizado escrito em Matlab (uma das mais úteis built-in funções Matlab é regionprops.m que analisa as propriedades geométricas de uma elipse.
4. Quando se utiliza concentrações elevadas odor, odor residual pode ser liberado a partir do porto odor após o odor é desligado. Para minimizar os efeitos que isso possa ter, é útil para girar a voar por alguns segundos com um panorama de rotação para que o sistema para expulsar qualquer odor residual.
5. É também benéfico para visualmente girar a voar entre os tratamentos experimentais para (i) manter as moscas ativamente engajados no experimento e (ii) manter moscas de permanecer em um ponto. Um experimento exemplo pode ter a seguinte ordem: i) vinte rodada inicial segundo diagnóstico; ii) cinco de rotação segundo intermediários; iii) vinte par segunda condição # 1; iv) cinco girar segundo intermediários; v) vinte par segunda condição # 2.

Parte 3: A mosca permanecendo dentro da pluma de odor

Um segundo experimento básico na OMT é visualmente arrastar uma mosca em uma pluma de odor, instantaneamente mudar as condições visual, e depois medir a sua capacidade de permanecer na pluma. Novamente, note que todas as experiências são feitas em forma de blocos ao acasot para minimizar qualquer preconceito, a fim experimental.

1. Coloque uma mosca recém amarrado na arena usando um par de fórceps.
2. Visualmente girar (spin) os tempos voam várias ao redor da arena antes de cada experiência como uma verificação de diagnóstico para garantir que o animal tem a capacidade de orientar em todas as direções (ver parte 2.2).
3. Antes de cada condição, ligar o odor experimental (água ou vinagre) e visualmente "arrastar" a voar para a pluma oscilando uma pequena faixa vertical na posição da pluma. Este aproveita o comportamento poderosa faixa de fixação observada em moscas [4].
4. Agora que a mosca é orientada para a pluma, remova a faixa de oscilação e apresentar as condições visuais de exemplo a seguir: i) faixas de alto contraste panorâmico com vapor de água (Fig. 1A); ii) fundo uniforme com vapor de água (Figura 1B); iii) listras de alto contraste panorâmico com odor vapor (Fig. 1C); fundo uniforme iv) com odor de vapor (Figura 1D). Aquisição de vídeo como em 2.3. Um experimento exemplo pode ter a ordem de fluxo: i) vinte rodada inicial segundo diagnóstico; ii) cinco oscilação tarja segunda pluma; iii) vinte par segunda condição # 1; iv) cinco oscilação tarja segunda pluma; v) vinte par segunda condição # 2 .

Resultados representativos:

Figura 1

Parte 1 explica como otimizar as imagens de vídeo OMT. A imagem de vídeo deve ter uma visão clara da mosca iluminado sobre um fundo escuro preto. Excessivamente imagens brilhantes pode ser melhorada através da redução da interferência de fundo, reduzindo a intensidade dos LEDs IR, ou desligando as luzes da sala. Se a mosca é mal iluminado, ajustar o foco dos LEDs IR ou a intensidade da modulação dos LEDs IR pode corrigir o problema. Partes 2 e 3 descrevem experiências simples para realizar a fim de verificar o bom funcionamento de uma OMT. Em todos os casos, uma mosca deve ser visualmente "forçado" (via respostas optomotor) para girar várias revoluções na arena para garantir uma ampla suave e completa de movimento. Na parte 2 de uma mosca é desafiado a encontrar uma pluma de odor por conta própria. Para manter a mosca envolvidos no experimento, para reduzir o efeito da libertação odor residual, e para manter as moscas de manter um único título durante todo o experimento, é útil para visualmente girar a voar por alguns segundos entre os ensaios. Uma mosca nunca deve localizar uma pluma de vapor d'água em um grau significativo, e deve sempre localizar uma pluma de odor na presença de rica panorâmica pistas visuais. Na Parte 3, uma mosca é visualmente arrastado diretamente em uma pluma de odor e desafiados a manter o seu título dentro da pluma contra uma variedade de backgrounds estacionária visual. Se a mosca é arrastado para uma pluma de vapor d'água, deve rapidamente se transformar de distância. Se a mosca é arrastado para uma pluma de odor e não são suficientes pistas visuais para mediar rastreamento robusto, a mosca permanecerá na pluma.

Discussão

A aquisição das imagens para este sistema utiliza uma câmera barata placa firewire e software escrito em Matlab. Imagens claras são cruciais para a obtenção de traços precisos dados. As estratégias descritas acima são úteis para a limpeza de imagens neste sistema. Procedimentos outro vídeo de monitoramento para este sistema foram descritas ^1. Além disso, este sistema pode ser facilmente modificado para incluir rastreamento em tempo real de vídeo. Os protocolos experimentais exemplo aqui descrito ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Firewire camera	1394store.com	Fire-I board camera BW	4.3mm lens no IR coating
IR LEDs	Small Parts, Inc.
Black spray paint	Rustoleum		Flat black
Black flock paper	Edmund Scientific
Panel system	Caltech		3
Matlab 2006a	Mathworks		Image acquisition toolbox