Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

Riepilogo

Questo articolo descrive GFP-based fluorescenza In vivo Test che separatamente quantificare ricombinazione omologa e nonhomologous fine unirsi in cellule di mammifero.

Abstract

DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più pericolosa che può causare la perdita massiccia di informazioni genetiche e morte cellulare. DSB riparare le cellule utilizzando due percorsi principali: nonhomologous fine unirsi (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR). Perturbazioni di NHEJ e HR sono spesso associate a invecchiamento precoce e tumorigenesi, quindi è importante avere un modo quantitativo per misurare ogni percorso riparazione DSB. Il nostro laboratorio ha sviluppato costruisce giornalista fluorescenti che permettono di misurazione sensibile e quantitativa di NHEJ e HR. I costrutti si basano su un gene GFP progettato contenenti siti di riconoscimento per una rara taglio I-endonucleasi SCEI per l'induzione di DSB. I costrutti di partenza sono GFP negativi come il gene della GFP viene inattivato da un esone aggiuntivo, o da mutazioni. Riparazione di successo della I-SCEI indotta break da NHEJ o HR ripristina il gene funzionale GFP. Il numero di cellule GFP positive contati mediante citometria di flusso fornisce una misura quantitativa della NHEJ o efficienza delle risorse umane.

Protocollo

In questo protocollo viene descritto il metodo per l'analisi di riparazione del DNA con DSB giornalista cromosomicamente integrato costruisce ^1,2 DSB in cui sono indotti in vivo l'espressione transiente un'endonucleasi taglio raro SCEI ^I-3. Il test integrato offre il vantaggio di analizzare riparazione DSB nel contesto cromosomico. Tuttavia, questo protocollo richiede prolungata passaging cellula, che può essere problematico quando si lavora con le cellule primarie.

Un approccio alternativo è un test extracromosomico dove vengono digeriti costrutti reporter in vitro con I-SCEI o endonucleasi HindIII e poi trasfettate in cellule il DNA lineare. Il protocollo del saggio exctrachromosomal ⁴ è simile al test integrato descritto qui di seguito con le seguenti modifiche. Per il saggio extracromosomico omettere l'integrazione dei costrutti reporter e, invece di co-trasfezione delle cellule con 0,5 mcg di giornalista NHEJ plasmide linearizzato in vitro con I-SCEI o HindIII e 0,1 mg di pDsRed2-N1 controllo trasfezione. Per l'analisi delle risorse umane co-trasfezione due reporter di HR mcg plasmide linearizzato con I-SCEI o HindIII e 0,1 mcg pDsRed2-N1. Analizzare le cellule FACS tre giorni dopo la trasfezione. Il test permette extracromosomico per l'analisi di riparazione DSB in isolati primari, evitando cellula passaging ampia, e facilitando l'analisi di linee cellulari multiple.

1. Costrutti reporter per NHEJ e HR

La cassetta giornalista NHEJ ⁵ contiene un gene GFP con un ingegnerizzato 3 kb introne del gene Pem1 (GFP-Pem1). L'introne Pem1 contiene un esone adenovirale affiancata da sequenze di riconoscimento per la endonucleasi HindIII e I-SCEI (Figura 1a) per l'induzione di DSB. L'I-SCEI siti sono in orientamento invertito. I-SCEI ha una sequenza nonpalindromic riconoscimento, quindi due siti invertita generare estremità del DNA incompatibili (Figura 1c). DNA incompatibili finisce meglio imitare il DSB naturale. La cassetta è intatta NHEJ GFP negativo come esone adenovirale sconvolge l'ORF GFP. Al momento l'induzione di DSB da I-SCEI, il esone adenovirale viene rimosso e NHEJ ripristina la funzione del gene GFP (Figura 2). La caratteristica unica di questo reporter NHEJ è che si può rilevare un ampio spettro di eventi NHEJ dal introne può tollerare eliminazioni e inserimenti.

La cassetta giornalista HR ¹ (figura 1b) si basa anche sul GFP-Pem1. Nella cassetta delle risorse umane, il primo esone del GFP-Pem1 contiene un ragazzo di 22 bp delezione combinato con l'inserimento di tre siti di restrizione, I-SceI/HindIII/I-SceI. La cancellazione assicura che GFP non può essere ricostituito da un evento NHEJ. I due I-SCEI siti sono in orientamento invertito, in modo che io-SCEI digestione lascia finisce incompatibili (Figura 1c). La prima copia di GFP-Pem1 è seguita da un promoter-less/ATG-less primo esone e introne di GFP-Pem1. Il costrutto è intatto GFP-negativo. Su induzione di un DSB di I-SCEI digestione del gene GFP funzionale è ricostituito da conversione genica intramolecolare o intermolecolare tra le due copie mutate del primo GFP-Pem1 esone. Dal momento che la seconda copia del gene GFP che manca il primo codone ATG e il secondo esone, attraversando o single-strand annealing non ripristinerà l'attività GFP. Questo design permette la rilevazione esclusiva di conversione genica, che è la via prevalente delle risorse umane in cellule di mammifero (Figura 3).

2. Integrazione del Reporter Costruisce nel genoma

1. Fai una preparazione di alta qualità di giornalista o NHEJ HR plasmide. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare Qiagen Endo Kit gratuito. Misurare la concentrazione di plasmide e la purezza di assorbanza a 260/280 nm.
2. Linearizzare 10 mcg del reporter plasmide da digerire con 50 U di NheI in 50 microlitri (volume totale della reazione) per 6 ore a 37 ° C incubatore (non utilizzare il blocco secco, per evitare l'evaporazione). Purificare il DNA dalla soluzione digestione con Qiagen QiaexII Kit, eluire il DNA in 20 ml di 10 mM Tris-HCl pH 8.0. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA mediante assorbimento a 260/280 nm. Di solito, si perde il 20-30% di DNA durante la purificazione. Confermare la resa e la digestione eseguendo una piccola aliquota (2 mL) su un gel, insieme a un giornalista non digerito costruire. Il costrutto purificato giornalista linearizzato può essere conservato a 20 ° C.
3. In preparazione per la trasfezione, le cellule portano a migliori condizioni di crescita. Se partendo da una fiala congelata, dividere le celle due volte prima di trasfezione. Se a partire da un piatto di cellule confluenti, dividerle una volta.
4. Crescere le cellule al 70-80% confluenza (di solito due giorni, se placcato 5x10 ⁵ cells/100 piastra mm, per i normali fibroblasti umani). E 'fondamentale per la migliore efficienza di trasfezione per portare le cellule in crescita logaritmica. Cultura in crescita attiva contiene cellule in fase M (visto come le cellule arrotondate attaccati alla superficie).
5. Trasfect le cellule utilizzando le seguenti raccomandazioni Amaxa produttore di Nucleofector. Per i fibroblasti usare la soluzione NHDF e U20 programma. Per la trasfezione, raccogliere le cellule da due piastre di 100 mm (~ 2x10 ⁶ celle). E 'fondamentale non trypsinize sulle celle. Fermare tripsinizzazione appena l'80% delle cellule staccato dal piatto. Risospendere le cellule in soluzione NHDF. Le cellule sono sensibili alla soluzione NHDF, quindi, minimizzare il tempo di incubazione e mescolare delicatamente le cellule. Trasfezione delle cellule con 0,5 mcg di costruire giornalista linearizzato. Queste condizioni di trasfezione, se utilizzato con normali fibroblasti umani risultato nell'integrazione di una singola copia di un reporter costruzione per la maggior parte dei integrants.
6. Selezionare le celle con costrutti reporter di cromosomicamente integrato con l'aggiunta di 1 mg / mL geneticin (G418) 24 ore dopo la trasfezione. Continua la selezione per 7-10 giorni.
7. Scegli le colonie resistenti G418 (si può scegliere singole colonie o in piscina i cloni resistenti). Espandere la cultura a 100 piatti circa cinque millimetri. Congelare tre piatti per un uso futuro ed espandere restanti due piastre per il numero di cella desiderata (generalmente dieci piastre 100 mm sono sufficienti per cinque trasfezioni).
8. Quando le cellule raggiungono il 70-80% confluenza (due giorni dopo la placcatura 5x10 ⁵ celle per 100 mm per piastra fibroblasti), le cellule sono pronte per essere transfettate con I-SCEI esprimendo plasmide.

3. L'induzione di DSB da Espressione transitoria di I-SCEI endonucleasi

1. Trasfezione ~ 2x10 ⁶ cellule (due piatti) della cultura logaritmico in crescita con una miscela di 5 mg I-SCEI esprimendo plasmide e 0,1 mcg pDsRed2-N1 (Clontech) come controllo di efficienza di transfezione con Amaxa Nucleofector (usare soluzione NHDF e U20 programma per fibroblasti ).
2. Allo stesso tempo, preparare tre controlli di calibrazione per FACS da trasfecting ~ 2x10 ⁶ celle con (i) 5 mcg EGFP che esprimono plasmide, (ii) 5 mcg pDsRed2-N1, (iii) 5 mcg di un controllo plasmide che non esprime una proteina fluorescente (stiamo usando una codifica plasmide HPRT minigene).
3. Crescere le cellule per quattro giorni di tempo sufficiente per l'espressione di GFP e proteine ​​DsRed.
4. (Opzionale) Tre giorni dopo la transfezione verificare l'efficienza di trasfezione ed espressione di GFP e proteine ​​fluorescenti DsRed da microscopio invertito con filtri per la rilevazione di tali pratiche e DsRed.

4. Analisi della GFP + + e cellule DsRed mediante citometria di flusso

1. Quattro giorni dopo la transfezione raccolta I-SCEI cellule transfettate e le cellule di controllo. Risospendere le cellule in 500 l di PBS e cellule per il trasferimento dei tubi FACS. In questa fase è fondamentale raccogliere tutte le cellule e le cellule sono di forma rotonda. Per raggiungere questo obiettivo, si consiglia di utilizzare un tempo più lungo o un tripsinizzazione tripsina più forte. Confermano che il 99% delle cellule si staccano dalla piastra e hanno forma rotonda osservando le cellule al microscopio. Mantenere le cellule in ghiaccio al riparo dalla luce (cover secchiello del ghiaccio con un foglio). E 'possibile conservare le cellule in ghiaccio per qualche ora. Per ottenere i migliori risultati di analizzare le cellule immediatamente dopo la raccolta.
2. FACS calibrare con GFP, DsRed e controlli negativi. Regolare la tensione e la compensazione del colore al fine di includere tutte le cellule fluorescenti per l'analisi (Figura 4). Tenere presente che l'intensità fluorescente dei campioni sperimentali saranno inferiore a quello dei controlli.
3. Analizzare I-SCEI trasfettate cellule di FACS. Si contano almeno 20.000 cellule per ogni trattamento. Per evitare possibili interferenze tra GFP e DsRed fluorescenza si raccomanda di mantenere la percentuale di GFP + o + DsRed cellule inferiore al 25%. Se la percentuale di + DsRed o cellule GFP + è superiore a ridurre la quantità di pDsRed2-N1 o I-SCEI plasmide. Nei nostri esperimenti abbiamo solo bisogno di regolare la quantità di pDsRed2-N1 plasmide, ma non del I-SCEI plasmide.
4. La percentuale di cellule GFP + corrisponde alla efficienza della riparazione del DNA DSB e la percentuale di cellule + DsRed indica l'efficienza di trasfezione. Calcolare l'efficienza relativa di riparazione del DNA DSB come il rapporto tra cellule GFP + per + le cellule DsRed.
5. Le giunzioni fine riparato può essere sequenziato per testare l'accuratezza di riparazione. I costrutti giornalista contengono origine di replicazione e di E.coli geni di resistenza alla kanamicina (Figura 1). Ciò consente salvataggio i costrutti di digestione del DNA genomico con enzimi EcoRI, recircularization, e la trasformazione in cellule competenti di E.coli. I plasmidi salvati vengono poi analizzati da digestione di restrizione e sequenziamento.

5. Rappresentante Risultati

Tipico risultati FACS del trasfezioni di controllo e di NHEJ ed esperimenti HR sono mostrati nelle Figure 4 e 5. Intensità fluorescente e il numero di cellule fluorescenti sarà inferiore al I-SCEI cellule transfettate contenenti inteed NHEJ e costruisce HR (Figura 5) rispetto ai controlli (Figura 4) a causa della differenza nel numero di copie di GFP e costrutti DsRed in queste cellule. Ogni cella nell'esperimento contiene solo una copia del costrutto giornalista integrata, eventi riparare così il successo ricostituirà il gene GFP in una frazione delle cellule. Trasfezione con 0,1 mcg pDsRed2-N1 in fibroblasti umani eroga circa 1 copia plasmide per cellula.

L'efficienza di NHEJ e HR è calcolato come rapporto tra GFP + / + DsRed cellule. NHEJ è un processo più efficiente delle risorse umane nelle cellule umane ^2. In fibroblasti umani l'efficienza NHEJ è tipicamente 0,6-1,3, e l'efficienza delle risorse umane è 0,05-0,3. Poiché l'efficienza DSB è misurato come rapporto GFP + / + DsRed variazioni cellule nella miscela di I-SCEI e DsRed2-N1 plasmidi possono influire sul risultato. La qualità plasmide può anche influenzare i risultati, cambiando l'efficienza di trasfezione. Pertanto, per ottenere misure coerenti, è importante utilizzare lo stesso mix plasmide all'interno di un esperimento. Inoltre, l'efficienza riparazione DSB è influenzata dal tipo di cellula, fase del ciclo cellulare, e la localizzazione cromosomica dei costrutti integrato.

Figura 1. Reporter costruisce per l'analisi di riparazione del DNA DSB da NHEJ (A) e HR (B). (C) DNA incompatibili finisce generato dalla digestione di due invertita I-SCEI siti SD, splicing donatore; SA, splicing accettore; piazze ombreggiate, i siti di poliadenilazione, Neo / Kana, singolo ORF controllato da due promotori:. SV40 resistenza alla neomicina conferimento di mammiferi cellule, e β-lattamasi che conferisce resistenza kanamicyn in E. coli, Ori, E. Coli origine pUC di replica.

Figura 2. Reporter costruire per l'analisi di NHEJ In questo costrutto il gene GFP è inattivo;. Ma sulla induzione di una NHEJ DSB e di successo del costrutto diviene GFP +. Qui sotto è un prodotto di riparazione di questo giornalista da NHEJ.

Figura 3. Reporter costruire per l'analisi delle risorse umane mediante la conversione del gene. Dopo l'induzione del DSB di I-SCEI, HR da gene conversione (GC) ricostituisce un gene attivo GFP. Mostrati di seguito sono prodotti per la riparazione di questo giornalista attraverso le vie principali di riparazione del DNA: GC, crossing-over (X-over), singolo filamento annealing (SSA), e NHEJ. X-over riparazione del prodotto è indicato per la ricombinazione intramolecolare, ricombinazione exramolecular darà lo stesso prodotto, ma trova su un cromosoma. Geni che esprimono una proteina attiva GFP (GFP +) sono indicati con colore verde.

Figura 4. Calibrazione dei parametri per l'analisi FACS. (A) I fibroblasti transfettate con il plasmide pHPRT, utilizzato come controllo negativo per l'esclusione automatica delle cellule fluorescenti. (B) I fibroblasti transfettate con plasmide pEGFP, utilizzato per impostare il gate di cellule GFP + (area verde). (C) I fibroblasti transfettate con plasmide pDsRed2-N1, utilizzato per impostare il gate per le cellule + DsRed (area rossa).

Figura 5. Risultati tipici dell'analisi dei NHEJ (A) e HR (B) in fibroblasti umani normali con costrutti reporter di cromosomicamente integrato.

Discussione

Le fluorescenti NHEJ e saggi giornalista HR forniscono un modo quantitativo per misurare separatamente ciascun percorso riparazione DSB in vivo. I test sono molto sensibili, come FACS di rilevare in modo affidabile 10 cellule GFP + in 20.000 cellule. Il test può essere adattato per la misurazione eventi riparazione in "tempo reale", rilevando la comparsa di cellule GFP + giro di pochi minuti o ore dopo l'induzione di DSB ^2. Inoltre, l'analisi di cellule GFP + non si basa sulla prol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi kit	Qiagen	12362
Qiaex II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
Amaxa Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
pDsRed2-N1	Clontech Laboratories	632406
Round bottom tubes	BD Biosciences	352058	FACS tubes