Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

Riepilogo

Microdisegni adesivo che normalizzano architettura cellulare può essere utilizzato per aumentare la sensibilità nella rilevazione degli effetti dei farmaci, migliorare la riproducibilità e semplificare l'acquisizione automatica delle immagini e analisi. Tale tecnologia andrà a beneficio della droga / siRNA test di screening, eseguite su supporti convenzionali coltura cellulare e quindi soffrono di un eccessivo cellula-cellula variabilità.

Abstract

Fino ad oggi, la maggior parte HCA (Content Analysis Alta) studi sono effettuati con linee cellulari aderenti coltivate su un substrato omogeneo nel tessuto-coltura trattata micro-piatti. In queste condizioni, le cellule diffuse e dividere in tutte le direzioni con conseguente variabilità nella forma delle cellule, la morfologia e il comportamento. L'alta cellula-cellula varianza della popolazione complessiva impedisce il successo di HCA, soprattutto per lo sviluppo di farmaci. La capacità di microdisegni di normalizzare la forma e la polarità interno di ogni singola cella fornisce una straordinaria opportunità per la soluzione di questo collo di bottiglia critico ^1-2.

Per facilitare l'accesso e l'utilizzo della tecnologia micropatterning, CYTOO ha sviluppato una gamma di pronto all'uso microdisegni, disponibili in formati coprioggetto e pozzetti. In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati di tutte le procedure da semina cella microdisegni CYTOOchip, trattamento farmacologico, la fissazione e la colorazione di acquisizione automatica, elaborazione delle immagini automatizzata e l'analisi dei dati finali. Con questo esempio, illustrare come microdisegni può facilitare saggi cellulari. Alterazioni del citoscheletro delle cellule sono difficili da quantificare in cellule in coltura su substrati omogenei, ma le cellule in coltura risultati microdisegni a un'organizzazione riproducibile del reticolo di actina grazie al posizionamento sistematico di contatti adesione della cellula in ogni cellula. Tale normalizzazione dell'architettura intracellulare consente la quantificazione di anche piccoli effetti sul citoscheletro di actina come dimostrato in questi set di protocolli con blebbistatin, un inibitore della actina-miosina interazione.

Protocollo

1. Preparazione e Semina delle cellule su microdisegni

1. Posto 2 CYTOOchips in 2 pozzi indipendente di una piastra ben 6 assicurando che si legge "CYTOO" nell'angolo in basso a destra della CYTOOchip. Microdisegni possono essere marcate con Cy3 o Cy5 coloranti. CYTOOChips utilizzati per questo esperimento sono Cy3 fluorescente microdisegni.
   ATTENZIONE: Conservare i chip al buio.
2. Raccogliere le cellule HeLa (confluenti ~ 80%) da tripsinizzazione. Controllare al microscopio che le cellule siano dispersi dal trattamento tripsina. Raccogliere e centrifugare le cellule a 300g per 4 minuti, poi delicatamente risospendere il pellet cellulare. Contare le celle e diluire ad una concentrazione di 15.000 cellule / ml in terreni di coltura DMEM/F12 completato.
3. Dispensare 4 ml (60.000 cellule) in ciascun pozzetto contenente un CYTOOchip.
   ATTENZIONE: La piastra deve essere spostato il meno possibile per evitare di indurre i movimenti di rotazione nel mezzo come questo tenderà a concentrare le cellule al centro.
4. Lasciate che il sedimento cellule per 10 minuti sotto il cofano per poi passare alla cella incubatrice. Dopo 10-20 minuti, le cellule iniziano a aderire al microdisegni. Dopo 10 minuti, controllare regolarmente sotto il microscopio.
5. Non appena le cellule hanno attaccato, cambiare il medium delle cellule e lavare delicatamente la superficie del vetrino con la seguente procedura:
6. Mantenere la piastra piatta, leggermente aspirare il terreno con una pipetta dal lato del bene.
   ATTENZIONE: Non lasciare che il chip di fuori asciutto, questo significa che non è mai aspirare fuori tutto il liquido lasciando sufficiente a coprire il CYTOOchip in ogni momento.
7. Aggiungere 4 ml di PBS e aspirare di nuovo primo avvio al centro del chip per poi passare al lato del bene. Aspirare al largo della PBS come descritto senza esporre il chip per aria. Ripetere 3-4 volte.
8. Controllare al microscopio per le cellule galleggianti:
   • Se un gran numero di cellule galleggianti rimangono, ripetere la procedura di lavaggio.
   • Se vedete cellule molto pochi, aspirare una parte dei PBS e sostituirlo con 2 ml di mezzo fresco. Aspirare e aggiungere 4 ml di terreno fresco due volte.
9. Porre la piastra in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ per un minimo di tre ore per permettere alle cellule di raggiungere la piena diffusione.
   NOTA: L'utilizzo di questo metodo tra il 10-30% (2.000-6.500) microdisegni sarà occupata da un cellule singole o multiple.
   ATTENZIONE: Il tempo necessario per le cellule di aderire prima della fase di lavaggio e il tempo necessario per la piena diffusione delle celle microdisegni saranno specifici per ogni linea cellulare.

2. Blebbistatin Trattamento

1. Sciogliere il blebbistatin in 100% DMSO per ottenere una soluzione stock di 17 mm. Diluire la soluzione stock ulteriormente a 5 mm con 100% di DMSO. Effettuare una diluizione finale nel terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 5 micron di blebbistatin 0,1% DMSO.
2. Per le condizioni di controllo, preparare 4 mL di mezzo contenente 0,1% di DMSO solo.
3. Aspirare il multimediale su cellule e sostituirlo con il mezzo preparato per 4 mL condizioni di trattamento e di controllo.
4. Cellule incubare per 1 ora a 37 ° C.

3. Fissazione delle cellule e la colorazione di actina

1. La preparazione della soluzione per il fissaggio delle cellule
   Vedere la sezione reagente per la preparazione del citoscheletro tampone (CB) e PFA 5%. CB è particolarmente indicato per l'etichettatura di fluorescenza di filamenti di actina e microtubuli.
   • Preparare 1xCB-saccarosio: aggiungere 1 g di saccarosio a 2 ml di CB.
     L'inclusione di saccarosio aiuta a preservare le strutture cellulari interne.
   • Preparare 4% PFA-CB-saccarosio: Aggiungere 1 ml di 1xCB-saccarosio a 4 ml di caldo PFA 5%.
     ATTENZIONE: Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per pochi giorni soltanto.
2. PFA fissazione
   • Usare pinze per prendere il CYTOOchip sul logo CYTOO e metterla (senza lavatrice) in un pozzo di un 6-pozzetti contenenti 2 ml del 4% PFA-CB-soluzione di saccarosio
   • Incubare 10 min a RT
   • Rimuovere PFA-CB-saccarosio e lavare una volta con PBS
   • Fare un secondo lavaggio con 2 ml di 100 mM NH ₄ Cl per 10 minuti al fine di soddisfare la residua attività di reticolazione PFA
     NOTA: diapositive PFA fisso possono essere memorizzati in PBS per diversi giorni a 4 ° C prima della colorazione organello per l'imaging a fluorescenza.
3. Permeabilizzazione della membrana cellulare con Triton X-100
   Permeabilizzazione delle cellule con detergente permette anticorpi o altre sonde per penetrare la membrana cellulare ed elimina alcuni della piscina citosolico di proteine ​​del citoscheletro che possono comunque ridurre il contrasto dei polimeri del citoscheletro che rende difficile analizzare la loro localizzazione.
   • Rimuovere NH ₄ Cl e aggiungere 2 mL / pozzetto del 0,1% Triton X-100-CB per 3 min a RT
   • Lavare due volte con 2 ml di PBS
4. Actina colorazione
   Fluorescenti che falloidinah lega alla actina nativo viene utilizzato per colorare i filamenti di actina.
   • Aggiungere 2 ml di coniugato FITC falloidina diluito 1:2000 in PBS con 1,5% di BSA
   • Incubare 1 ora a RT
   • Lavare una volta con 2 ml di PBS
5. Nuclei colorazione
   • Aggiungere 2 mL di Hoechst (macchia con 1μg / ml in PBS)
   • Incubare 3 minuti a RT
   • Lavare per 2 volte con 2 ml di PBS
6. Montaggio di diapositive
   • Raccogliete il CYTOOchips sul logo CYTOO e CYTOOchip montare su un vetrino da microscopio standard con 25-30 ml di Mowiol o qualsiasi altra soluzione di montaggio.

4. Microscopio installazione e acquisizione automatica dell'immagine

Numerosi pacchetti software di imaging che esiste il controllo del microscopio per una rapida acquisizione delle immagini e la visualizzazione automatica. Questo esempio utilizza Metamorph software di imaging e di acquisizioni automatiche vengono eseguite su un microscopio Nikon Eclipse Ti dotato di una fotocamera CCD Hamamatsu e mercurio in fibra Intensilight illuminatore. Le immagini sono acquisite a 20x in tre lunghezze d'onda corrispondenti al DAPI (nuclei), Cy-3 (microdisegni) e FITC-falloidina (actina). Il numero di microdisegni visualizzati per ogni campo varia a seconda della fotocamera e le impostazioni obiettivo. Microdisegni CYTOO sono posizionati a intervalli definiti l'uno dall'altro (100 o 130 micron) attraverso il chip facilitando l'acquisizione.

1. Seleziona 20x
2. Acquisizione aperto (Multidimensional nella barra dei menu: Applicazioni / multidimensionali Acquisizione) e impostare i vari parametri della sperimentazione:
   • Numero di lunghezze d'onda: 3
   • Tipi di lunghezza d'onda: DAPI, FITC, Cy3
   • Impostare il tempo di esposizione per ogni lunghezza d'onda per prima concentrandosi su un campo di cellule
   • Messa a fuoco automatica può essere eseguita su ogni lunghezza d'onda
   • Scegliere dove salvare i dati
3. Seleziona Cy3 lunghezza d'onda e posizionare la fotocamera in modo che 12 microdisegni vengono visualizzati e centrato nel campo della fotocamera (4 colonne e 3 righe di modelli).
4. Creare un giornale in esecuzione di acquisizione multidimensionale. La procedura per la creazione di una rivista è descritto nella Figura 1.
5. Aprire la funzione di scansione stadio (nella barra dei menu: Dispositivi / Stage / Stage Scan). Per acquisire 24 immagini ciascuno contenente 12 microdisegni a ingrandimento 20x, immettere 6 colonne e 4 righe con -400 micron passo X dimensioni e 300 Y dimensioni micron passo. In Gazzetta SET per eseguire, caricare la MDA.JNL rivista. Poi premere Scansione per avviare l'acquisizione automatica del blocco tutto nelle tre lunghezze d'onda.
   NOTA: Le dimensioni X e Y passo qui indicati possono variare in base al numero di microdisegni presenti in un campo di macchina fotografica. A seconda del palco allestito, in direzione X e / o Y può richiedere valori negativi per il movimento nella direzione corretta.

5. Image Processing ed analisi automatizzata

Molti pacchetti software di elaborazione delle immagini e analisi di esistere. Le procedure descritte di seguito l'elaborazione delle immagini schema e fasi di analisi eseguite da 2 misura macro scritte per il programma ImageJ open source. Il CellRef prima macro crea una cella di riferimento, la seconda Ipotenusa rigidità misure / collasso della membrana cellulare. Entrambi sono disponibili su richiesta presso www.cytoo.com .

1. Creare stack di immagine per tutti e tre i canali centrata su microdisegni (macro CellRef).
   L'uso di cellule microdisegni evita di clustering e di aggregazione, semplificando notevolmente il primo passo per l'elaborazione delle immagini è automatico che la localizzazione e la segmentazione delle singole cellule. Le immagini marcate micropattern sono usati per definire e delimitare le regioni centrata sul microdisegni. Queste regioni sono poi trasposti sul immagini acquisite in altri canali e tagliate. Corrispondenti immagini ritagliate vengono poi assemblati in pile per ogni lunghezza d'onda. Un RGB-pila è anche creato dalla fusione dei tre canali (Figura 2).
2. Applicare singola cella di selezione del filtro (macro CellRef)
   Come indicato sopra, il 10-30% (2.000-6.500) del microdisegni sono occupati da una singola cellula o più celle, mentre le rimanenti microdisegni sono vuote. Per selezionare le immagini che mostrano microdisegni occupato da solo una singola cella, la macro rileva il numero di nuclei per immagine ed elimina da tutti (RGB e lunghezze d'onda diverse) stack quelli contenenti più di un nucleo o senza nuclei (Figura 3).
3. Eliminare non normalizzati e le cellule che non sono pienamente teso la micropattern utilizzando zona di cut-off cella filtrante (macro CellRef)
   Per rimuovere divisione delle cellule che sono sfuggite al filtro nuclei, un altro filtro utilizzando il canale FITC per actina viene applicata. Area di cella viene calcolato e quelli di sotto di un certo cut off (aree di cellule circa 2 volte meno di area di cella interfase) vengono rimossi da tutti gli stack. L'area busta cella è determinata dalle dimensioni del pattern.
4. Allineare le immagini delle cellule (macro CellRef)
   Dai passaggi precedenti, le immagini contenenti singole cellule micropatterned sono stati selezionati. Anche se queste immagini sono centrati su microdisegni, non sono mai tutti perfettamente allineati gli uni agli altri. Per concludere l'elaborazione delle immagini, un plugin ImageJ (MultiStackReg) viene applicata a riallineare tutte le immagini raccolte e tutti i canali in base alla posizione micropattern. Questa operazione genera pile allineate su singole immagini, che possono ora essere utilizzati per l'analisi singola cella o la creazione di una cella di riferimento (Figura 4)
5. Costruire una cella di riferimento (macro CellRef)
   Cellule in crescita su microdisegni significa che tutte le cellule hanno forme simili. Questa normalizzazione permette un preciso allineamento e sovrapposizione delle immagini delle cellule molti. Riassumendo il segnale in ogni immagine sopra l'intero stack permette di visualizzare e misurare un "effetto media della droga". L'immagine finale complessivo o cella di riferimento è uno strumento unico e utile per la rappresentazione e analisi di immagine e può essere ottenuto solo con le cellule micropatterned (Figura 4). In ImageJ, la cella di riferimento è costruito facendo una proiezione delle immagini filtrate e allineate da una pila (Immagine> Pile> Z-progetto). Diversi metodi di proiezione può essere applicato come l'intensità media o massima, ma di solito una proiezione mediana viene scelta che elimina outlier principale della serie di immagini. Per facilitare l'esame dei risultati, una LUT (Look Up Tables) convertire l'immagine in un monocolore Mappa del frequenza viene applicata.
6. Misurazione e quantificazione dei parametri di interesse (Ipotenusa macro)
   In questo articolo video, L-microdisegni vengono utilizzati perché la forma organizza il citoscheletro di actina in una singola fibra di stress maggiori. Evidenziando actina in questo modo, l'impatto blebbistatin sul citoscheletro può essere determinato in molti modi: misurando i cambiamenti nella curvatura della fibra di stress l'actina, colorazione di intensità, lunghezza o spessore delle fibre di stress, cambiamenti nelle caratteristiche morfometriche dei filamenti di actina o forma ecc cellula Questi parametri possono essere misurati sia su immagini singola cella o nella cella di riferimento finale stesso.
   Qui, l'impatto su 5 blebbistatin mM è stata caratterizzata da contando il numero di cellule crollato con un secondo ImageJ macro chiamata Ipotenusa (Figura 7). In breve, le immagini thresholded della L-micropattern sono usati per definire un ipotenusa teorico della forma triangolare cellulare. Successivamente, soglia di immagini colorate della actina viene effettuata allo scopo di approssimare la forma delle cellule reale. L'area compresa tra l'ipotenusa teorico del triangolo cellulare e la membrana cellulare reale concava viene misurata. Quando la cellula è crollato, una zona sotto l'ipotenusa teorico appare. La percentuale di cellule crollato viene utilizzato per confrontare le condizioni di controllo e trattati.

6. Rappresentante Risultati

Esempi di ciò che le cellule dovrebbe essere simile a microdisegni immediatamente e diverse ore dopo le fasi di lavaggio critici descritti in 1,6-1,8, sono mostrati in figura 5. Dopo 15 minuti a CYTOOchips, rotondo cellule HeLa sono osservati a distanze uguali indica che hanno aderito al microdisegni fibronectina (figura 5a). L'adesione è completa quando le cellule rimangono immobilizzati nonostante agitando delicatamente il recipiente di coltura. Per ridurre al minimo il numero di microdisegni occupati da più celle, i chip vengono poi lavati con PBS per rimuovere le cellule galleggianti sulle aree cytophobic. Dopo diverse ore, le cellule che sono completamente stirato sul microdisegni sarà simile a quelli mostrati nella figura 5b.

Tipico immagini singola cella ottenute dopo incubazione di cellule con blebbistatin, fissazione e colorazione di actina e dei nuclei sono presentati nella Figura 6. Dopo l'acquisizione automatica di immagini multiple ed elaborazione delle immagini utilizzando il ImageJ CellRef macro, una mappa a colori frequenza è generata che ritrae l'intensità di actina in media su tutte le immagini delle cellule (Figura 6c e 6f). Il confronto tra la cella di riferimento per le condizioni non trattati e trattati mostra il potenziale di questo approccio per l'osservazione facile del fenotipo in fase di studio ed è particolarmente utile per esplorare gli effetti della droga cellulare.

Un esempio di analisi dei possibili effetti di blebbistatin sulle cellule è presentato in figura 7. Il numero delle cellule è crollato (es. celle con un'area vuota esistente sotto l'ipotenusa teorico) rilevati in 50 cellule di controllo e 50 cellule trattate con 5 mM blebbistatin come rilevato dalla macro Ipotenusa ImageJ è mostrato. L'aumento del numero delle cellule è crollato nella popolazione trattata blebbistatin riflette il rilassamento delle fibre di stress e quindi la tensione a livello della membrana a causa dell'inibizione blebbistatin delle forze actinomyosin contrattili all'interno della cellula.

Figura 1. Procedura per creare una nuova rivista con Metamorph.

Figura 2. Diagramma di flusso della procedura automatica di elaborazione delle immagini.

Figura 3. Filtrare di singole cellule.

Figura 4. Costruire una cella di riferimento.

Figura 5. Semina cellulare. A) le cellule Hela aderito a microdisegni dopo la fase di lavaggio (ingrandimento 4x) B) le cellule HeLa dopo la piena diffusione sul microdisegni L (ingrandimento 10x).

Figura 6. Confronto delle cellule nonpatterned micropatterned e nel controllo della droga e le condizioni di trattamento. Cellule HeLa sono state seminate per 3 ore e trattati con 5 blebbistatin mM per 1 ora (pannello inferiore) oa sinistra non trattati (pannello superiore). Nel controllo delle cellule nonpatterned (a), actina assembla in fibre multiple che smontare impercettibilmente in seguito al trattamento con 5 blebbistatin mM (d). Su L-microdisegni, le cellule di controllo di adottare una forma triangolare (b) e sviluppare una fibra importante actina (fibra di stress) tra i 2 apici della L. Rispetto alle cellule nonpatterned (d), blebbistatin induce un importante cambiamento fenotipico su L-micropatterned cellule (e). Visualizzazione diretta degli effetti del farmaco e il confronto di controllo e alle condizioni trattate possono essere visualizzati rapidamente con la presentazione cella di riferimento costruito a partire da 20 celle. Simile a singole celle, una fibra di stress chiara e intensa è presente la cella di riferimento di controllo (c), mentre blebbistatin trattati collasso delle cellule e le fibre di stress principali scompare (f).

Figura 7. Esempio di un'analisi degli effetti della blebbistatin sulle cellule utilizzando l'ipotenusa macro. Mentre il 25% delle cellule di controllo erano crollati, questa aumentata di 3 volte al 75% nelle cellule mM 5 blebbistatin trattati che riflette la debole actinomyosin contrattile rete (n = 50 cellule).

Discussione

Scelta del micropattern

Mentre gli effetti su 5 blebbistatin mM sono appena rilevabili su supporti cultura standard, la quantificazione efficiente disponibile in microdisegni che concentrano la actina in una singola fibra di stress maggiori. Questo migliora la visualizzazione del citoscheletro di actina aiutare quantificazione precisa degli effetti blebbistatin sulla cellula. La scelta della forma micropattern è fondamentale nella progettazione del test ed è progettato in base alla variazione fenotipica da evidenziare in questo studio.

Conclusioni

Microdisegni facilitare la visualizzazione e la quantificazione degli effetti del farmaco, soprattutto a basse concentrazioni. La sostituzione del omogenea substrati planari con microdisegni adesivo per saggi cellulari migliora la precisione, la sensibilità e la qualità dei dati prodotti. Di conseguenza, un minor numero di celle sono necessari per l'analisi al fine di ottenere robusti risultati statistici ^3. Microdisegni adesivo offrire una reale opportunità per migliorare gli studi funzionali e ad esplorare i cambiamenti fenotipici a concentrazioni di farmaco inferiori in modo da evitare indurre effetti dei farmaci tossici o indiretta. Se le piattaforme di screening adeguati vengono utilizzati, microdisegni in grado di soddisfare le esigenze delle aziende farmaceutiche per il miglioramento genetico / farmaco applicazioni di screening. Alcuni esempi di pubblicazioni recenti che hanno sfruttato microdisegni per l'analisi e la quantificazione fenomeno cellulari sono citati sotto ^3-13.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente		Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coltura cellulare
CYTOOchips 20x20 LM-FN		CYTOO	10-114	CYTOOchips sono disponibili per l'adsorbimento della proteina di vostra scelta
PBS 1x		Gibco	14040-091
Camera di conteggio (scivolo Kova)		Prolabo	71.287,01
DMEM/F-12 + Glutamax-I		Gibco-Invitrogen	25300-054
FBS (f tal siero bovino)		PAA	31331-028
Penicillina e Streptomicina		PAA	A15-101
6 pozzi-plate		Dutscher	353046
centrifuga		Fisher Scientific	M65838
Microscopio		Nikon
Droga, fissaggio e immunostaining
Citoscheletro Buffer 1X (CB)		Sigma	MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889	MES 10 mM pH 6.1, KCl 138mm, MgCl 3mm, 2mM EGTA
Saccarosio		Sigma	S2395
PFA 32%		Electron Microscopy Sciences	15714
PFA 5%				Miscelare 10 mL di PFA 32% con 54 ml di CB 1.185X
Triton-X100		Sigma	T9284
PBS compresse		Gibco-Invitrogen	18912-014
Bovin albumina sierica (BSA)		Sigma	A7806
Phallodin-FITC		Sigma	P5282
Hoescht		Invitrogen	H3570
Blebbistatin		Euromedex	BN0640
DMSO		Sigma	D8418
NH 4 Cl 0,1 M		Sigma	M11209
Image Acquisition
Microscopio epifluorescente		Nikon	Ti Eclipse
CCD		TBC	TBC
ImageJ Software		http://rsbweb.nih.gov/ij/