Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Riepilogo

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila melanogaster È un sistema importante modello per lo studio normale funzione sinaptica e perturbazioni a funzione sinaptica si trovano in alcune malattie neurologiche. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del Drosophila Larvale motore del sistema e immunocolorazione per le proteine ​​all'interno della zona attiva NMJ.

Abstract

Le larve di Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) è un modello eccellente per lo studio della struttura e della funzione sinaptica. Drosophila è ben noto per la facilità di potenti manipolazioni genetiche e il sistema nervoso larvale è dimostrata particolarmente utile per studiare non solo la normale funzione ma anche perturbazioni che accompagnano una malattia neurologica (Lloyd e Taylor, 2010). Molte molecole chiave sinaptica si trovano in Drosophila sono presenti anche nei mammiferi e come la maggior parte delle sinapsi eccitatorie sistema nervoso centrale nei mammiferi, la NMJ Drosophila è glutammatergica e dimostra attività-dipendente rimodellamento (Koh et al., 2000). Inoltre, i neuroni Drosophila possano essere identificati individualmente, perché i loro modelli di innervazione sono stereotipati e ripetitivi che consente di studio ha identificato i terminali sinaptici, come quelle tra i neuroni motori e il corpo-muro fibre muscolari che innervano (Keshishian e Kim, 2004). L'esistenza di componenti sinapsi evolutivamente conservata insieme alla facilità di manipolazione genetica e fisica del modello Drosophila ideale per lo studio dei meccanismi alla base della funzione sinaptica (Budnik, 1996).

Le zone attive ai terminali sinaptici sono di particolare interesse perché questi sono i luoghi di rilascio dei neurotrasmettitori. NC82 è un anticorpo monoclonale che riconosce la proteina Bruchpilot Drosophila (BRP), un membro della famiglia CAST1/ERC che è una componente importante della zona attiva (Wagh et al., 2006). BRP ha dimostrato di forma direttamente la zona attiva T-bar ed è responsabile in modo efficace il clustering Ca ^{2 +} canali sotto la T-bar densità (Fouquet et al., 2009). Mutanti di BRP hanno ridotto Ca ^{2 +} densità di canali, depresso rilascio delle vescicole evocato, e modificato a breve termine plasticità (Kittel et al., 2006). Alterazioni zone attive sono state osservate in modelli di malattia Drosophila. Per esempio, immunofluorescenza utilizzando l'anticorpo NC82 ha mostrato che la densità zona attiva è stata ridotta in modelli di sclerosi laterale amiotrofica e la sindrome di Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Quindi, la valutazione delle zone attive, o altre proteine ​​sinaptiche, in modelli larve di Drosophila malattia può fornire un indizio prezioso iniziale per la presenza di un difetto sinaptica.

Preparare tutto il montaggio larve sezionato Drosophila per l'analisi di immunofluorescenza del NMJ richiede una certa abilità, ma può essere realizzato dalla maggior parte degli scienziati con un po 'di pratica. Presentato è un metodo che prevede le larve più per essere sezionati e immunostained nel piatto dissezione stessa, limitando le differenze ambientali tra ciascun genotipo e fornendo animali sufficiente per la fiducia nella riproducibilità e analisi statistiche.

Protocollo

1. Preparazione per Immunofluorescenza:

1. Per creare una superficie dissezione, versare Sylgard 184 Base elastomeri di silicone in un piatto piccolo coltura di tessuti. Fare attenzione a non riempire completamente la piastra in modo che l'area dissezione è più basso del cerchio.
2. Trim pin dissezione, per una lunghezza di circa 3,5 mm per una maggiore facilità di manipolazione, e assicuratevi di avere almeno 6 pin per ogni larva.
3. Avrete bisogno di forcipe smussato che permetterà di cogliere che i perni per la dissezione.

2. Dissezione delle larve:

1. Seleziona vagare terzo larve instar che sono strisciare intorno ai lati del flacone e non hanno cominciato a pupate.
2. Inserire una larva sulla superficie dissezione sotto uno stereomicroscopio. Stoppino via umida in eccesso con un Kimwipe.
3. Disporre ogni larva modo che il lato dorsale è rivolto verso l'alto. Sarete in grado di vedere due trachea, linee bianche lungo il lato dorsale delle larve. Prova a centro di questi nel mezzo il più possibile perché questo segna la linea mediana dorsale.
4. Porre il Pin # 1 appena sopra i ganci bocca (Figura 1).
5. Porre il Pin # 2 nella coda appena sopra la spiracoli tra le trachee.
6. Aggiungere una piccola quantità di PBS alle larve contro l'essiccamento della cuticola.
7. Ripetere i passaggi precedenti con tutte le larve, assicurandosi che i genotipi sono separati spazialmente mettendo un perno tra ciascun genotipo.
8. Svoltare a destra piccolo taglio trasversale sopra pin n ° 2 in entrambi i tracheas (Figura 1).
9. Inserisci il tuo forbici nel primo taglio e tagliare lungo la linea mediana dorsale tra il tracheas tutta la strada fino pin passato # 1.
10. Avrete bisogno di fare altri piccoli tagli al fondo superiore e di ogni lato della cuticola, in modo che i lati sinistro e destro si aprirà permettendovi di pin giù senza tirare su la cuticola.
11. Porre il Pin # 's 3, 4, 5 e 6 ad ogni angolo.
12. Fissare il campione con 4% PFA per 20-25 minuti a temperatura ambiente
13. Decantare il PFA e risciacquare con tempi di PBS 3-4, decantazione di volta in volta.

3. Rimozione del tessuto:

1. Inizia prelevare tessuti alla fine posteriore perché di solito si desidera proteggere la zona dove si trova il cervello.
2. Mentre si utilizza una steromicroscope e con le larve in una goccia di PBS, prima afferrare l'estremità posteriore di uno dei trachea e tirarlo fuori che può rimuovere alcune delle grasso corporeo con esso. Ripetere l'operazione per la trachea secondo.
3. Prendete alcuni del corpo posteriore grasso o intestino e tirare fuori dal preparazione. Una volta che la maggior parte del tessuto posteriore è stato rimosso, concentrarsi sulla rimozione dei tessuti piccolo intorno al cervello. Se siete interessati solo i muscoli, o morfologia del NMJ è possibile rimuovere il cervello pure.
4. La rimozione del cervello consente una migliore visualizzazione di Muscle 31, che è un marker utile per l'orientamento del segmento addominale.

4. Immunofluorescenza per le zone attive:

1. Aggiungi agente bloccante (5% di siero normale di capra in PBS) per la prepara sezionato nel piatto dissezione. Blocco per 1 ora a temperatura ambiente. Se volete fare una sola soluzione per bloccare e diluizioni di anticorpi, comprendono 0,1% TritonX-100 al vostro agente di blocco per permeabilizzazione del tessuto.
2. Applicare l'anticorpo primario diluito in blocco reagente con 0,1% TritonX-100. L'anticorpo zona attiva è raggiungibile attraverso il Developmental Studies Ibridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Utilizzare un anticorpo di riferimento (es. perossidasi-coniugato Cy3) per etichettare la membrana NMJ e assoni.
3. Incubare gli anticorpi primari a 4 ° C durante la notte. In modo che la secchezza del frigorifero non far evaporare la soluzione di anticorpi, creare una camera umida mettendo un pò d'acqua sul fondo di una scatola pipetta utilizzata punta. Coprire il coperchio trasparente con un foglio di alluminio per ridurre fluorescenti sbiancamento. Posizionare la diapositiva dissezione nella camera umida e mettere l'intera scatola nella 4 ° C durante la notte incubatore.
4. La mattina dopo, lavare con PBST (PBS con 0,2% Triton X-100) 5-10 volte per 5-10 minuti ciascuno.
5. Incubare con l'anticorpo secondario (ad esempio Invitrogen Alexa capra anti-topo-488) diluito in blocco reagente con 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente per 2-4 ore nella camera umida coperta. Includono una macchia nucleare (per es DAPI) nel secondario, se si vuole identificare la posizione del nucleo nei muscoli o nel cervello.
6. Lavare con PBST (PBS con 0,02% Triton-X-100) 5-10 volte per 5-10 minuti ciascuno.

5. Montaggio dei campioni larvali nelle diapositive:

1. Decantare e stoppino spento l'ultimo lavaggio PBST.
2. Pipettare 1 ml di glicerolo circa l'80% per coprire le pelli immobilizzato larvale.
3. Rimuovere 5 dei 6 pin in tutte le larve.
4. Quando si è pronti a mettere il genotipo prima su un vetrino da togliere il perno ultima per tutte le larve di quel genotype.
5. Preparare una slide "lavaggio" mettendo due gocce del vostro mezzo di montaggio su un vetrino pulito. Questo passo è importante lavare la soluzione di acqua al largo delle larve per il montaggio e più chiaro di imaging.
6. Afferrare una larva per la coda con il forcipe smussato, trascinare la larva in giro per il glicerolo e poi lungo i bordi secchi della parabola dissezione, per rimuovere la maggior parte del glicerolo. Mettere le larve alla prima prova mezzo di montaggio.
7. Ripetere il passaggio 6 per tutte le larve del genotipo stesso.
8. Una volta che tutte le larve sono in prima goccia mezzo di montaggio, afferrare la larva prima per la coda e tirarlo attraverso la goccia e poi lungo i bordi del piatto asciutto per rimuovere la maggioranza dei media. Poi posto le larve nella seconda goccia mezzo di montaggio.
9. Ripetere il punto 8 per tutte le larve con lo stesso genotipo.
10. Preparare la diapositiva finale, mediante l'etichettatura e mettendo una piccola forma di "T" di mezzo di montaggio sul vetrino.
11. Come al punto 5.8, afferrare la larva per la coda, tirare la pelle attraverso la seconda goccia mezzo di montaggio e poi lungo i lati secco delle slide "Wash". Dopo che la maggior parte del mezzo è venuto fuori, la pelle larvale posto sulla diapositiva finale nel mezzo di montaggio.
12. Ripetere l'operazione per tutte le pelli larvale.
13. Assicurarsi che tutte le pelli larvali sono organizzati come desiderato fare in modo che il lato cuticola è basso e il muscolo è esposta verso l'alto.
14. Posizionare un vetrino sul vetrino per coprire le larve sezionato, con il bordo a partire dalla linea superiore del "T."
15. Mettete un piccolo peso (per esempio batteria da 9 volt) sul vetrino, assicurandosi che il supporto di montaggio si diffonde completamente sotto il vetrino.
16. Per ridurre i possibili tempra fluorescente, posto il vetrino in un cassetto o spazio buio fino a quando il mezzo di montaggio è curato.
17. Pulizia del supporto di montaggio che straripato il taglio della ricevuta di copertura. Pulire l'eccesso di media a secco di montaggio sul vetrino o scivolare con il 70% di etanolo.
18. Per creare un sigillo finale, sigillare con smalto per unghie.

6. Rappresentante dei risultati:

Uno scivolo esempio di larve sezionato e immunostained è illustrato nella figura 2. Quando il dissezioni larve, macchie e di montaggio sono fatto correttamente, l'utente può identificare il muscolo larve di interesse (Figura 3) in segmenti A2-A6. Hoang et al. Fornisce una descrizione dettagliata della posizione muscolare così come la caratterizzazione di specifiche boutons sinaptica (Hoang e Chiba, 2001). Utilizzando un obiettivo ad alta potenza che l'utente può concentrarsi su una singola sinapsi e prendere z-serie di immagini. Un massimo un'immagine rappresentativa proiezione di una parte della sinapsi 6 / 7 è mostrato (Figura 4). Quindi, utilizzando software di imaging, le zone attivo può essere quantitativamente valutati per le caratteristiche che sono specifiche al fenotipo mutante. Esempi di caratteristiche che possono essere modificati in un particolare fenotipo mutante comprendono il numero totale, intensità fluorescenza e la spaziatura tra le zone attive.

Potenziali insidie:

Valutazione immunofluorescenza della giunzione neuromuscolare larvale è un sistema valido che può fornire informazioni preziose in biologia sinaptica, anche se ci sono potenziali insidie ​​che possono limitare l'utilità di questo sistema. Per esempio, spesso è auspicabile l'immagine del pattern di colorazione di due o più anticorpi primari nello stesso campione. La scelta di appropriati anticorpi primari, fluorofori del caso, e adeguati controlli negativi è essenziale per il successo.

Se l'imaging due antigeni nel vostro esperimento, essere certi che gli anticorpi primari sono di specie diverse in modo che ogni proteina di interesse può essere identificato in modo univoco con un anticorpo fluorescente secondario. Un metodo consigliato per ridurre il fondo è quello di utilizzare un agente di blocco contenente il siero normale della specie da cui derivano gli anticorpi secondari (ad esempio l'uso del siero normale di capra come agente di blocco quando si usa capra anti-coniglio o anti-topo anticorpi secondari).

Dopo aver pianificato gli anticorpi primari e secondari che si intende utilizzare nel vostro esperimento, è necessario considerare anche compresi i controlli nella colorazione set per garantire che il segnale fluorescente che state vedendo è reale e non solo di sfondo. Se possibile, includere campioni di controllo negativo che non contengono la proteina di interesse. Questo è fatto facilmente negli studi di sovraespressione transgene esogeni includendo un animale selvatico tipo, ma in alcuni casi può essere realizzato utilizzando un mutante omozigote della proteina di interesse. Un altro controllo negativo essenziale, utile per misurare i livelli di fondo del segnale fluorescente, è quello di utilizzare l'anticorpo secondario senza includere il primario. Quando si prepara la tua immagine risultante, è importante capire che tutti i segnali fluorescenti che si sta vedendo potrebbe non essere reale, e potrebbe essere di sfondo da anniur anticorpi secondari o di sfondo del tessuto endogeno. Potrebbe essere necessario normalizzare le immagini da considerare fluorescenza di fondo quando per saggiare le modifiche tra intensità di fluorescenza.

Scelta del fluoroforo deve essere effettuata anche con cura. Dall'esame della eccitazione e spettri di emissione per ciascun fluoroforo e la capacità di individuare in modo univoco ogni segnale è essenziale per evitare sanguinare canale attraverso. Se c'è qualche incertezza, un modo semplice per determinare se la portata di sfiato attraverso è immunostain con un unico fluorocromo-anticorpo marcato per volta e controllare l'immagine ad ogni canale che si prevede di utilizzare nel vostro esperimento finale. Questo dovrebbe rivelare se sanguinare attraverso sta avvenendo con il set microscopio filtro.

Figura 1. Diagramma di flusso del taglio cuticola e il posizionamento di pin 1-6. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita

Figura 2. Posizionamento delle larve sulla diapositiva finale. Assicurarsi che la prepara le larve sono esposti lato muscolare alto e lato basso cuticola. Lasciare almeno una larghezza larvale corpo in-tra ogni campione.

Figura 3. Quando l'imaging, individuare i muscoli e segmenti di interesse. Comune giunzioni neuromuscolari caratterizzate innervano i muscoli 6 / 7, 13 muscoli, muscoli 12, o del muscolo 4. Sul lato opposto della linea mediana ventrale, vi è una immagine speculare struttura muscolare del mostrata emi-segmento. Usa muscolare 31 come un marker per identificare quale segmento si sta imaging. L'immagine della sinapsi stessa e segmenti per il resto dei vostri campioni, raccogliendo molte immagini sinaptica per genotipo che possono essere utilizzati per la quantificazione.

Figura 4. Un rappresentante dell'immagine proiettata al massimo di una porzione del muscolo NMJ innervano 6 / 7 è mostrato. NC82 (Bruchpilot) colorazione è evidenziato in verde. HRP pre-sinaptici macchia è mostrato in rosso. Si noti la punctae attivo zona che può essere ulteriormente quantificato software di imaging.

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Discussione

Per i neuroni, la zona terminale sinaptico è di fondamentale importanza, ed è il ponte per una corretta comunicazione tra il post-e pre-sinaptici delle cellule. Un modo efficace per studiare la salute del neurone in modelli di malattia è quello di analizzare le proteine ​​del terminale sinaptico mediante immunofluorescenza. Il metodo di immunofluorescenza qui presentata consente al ricercatore di esaminare le larve di molti contemporaneamente, limitando le differenze ambientali tra i gruppi. Il sistema nervoso ce...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sylgard 184 Base in silicone elastomero	Dow Corning	68037-59-2	Dopo la miscelazione permettono di bolle a salire lentamente mettendo su dei rotatori lenti o che consentono di sedersi per 30 minuti o più.
Acciaio Minutien Pins	Strumenti Scienza multa	26002-10	Tagliare a ca. 3-4mm di lunghezza con le forbici normali
Pinze laminectomia (Blunt-Usato per afferrare pin)	Strumenti di Scienze multa	11223-20	Usa come pinze per afferrare smussato perni
Pinza dissezione	Mondo Strumenti di precisione	501985
Vännäs SuperFine Forbici, 8cm lunghi	Mondo Strumenti di precisione	501778
Topo anti-Brp anticorpi	DSHB	NC82	Usa diluizione 1:50
Cy3 Affinipure capra anti-perossidasi di rafano	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Uso a 1:200 diluizione
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG	Invitrogen	A11001	Usa ca. Diluizione 1:200