의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

요약

의 신경근육학 교차로 (NMJ) Drosophila melanogaster 정상적인 시냅스 기능뿐만 아니라, 특정 신경 질환에서 발견 시냅스 기능 perturbations 공부를위한 중요한 모델 시스템입니다. 우리의 해부를위한 프로토콜을 제시 Drosophila 애벌레 모터 시스템과 immunostaining.

초록

Drosophila 애벌레 신경근육학 교차점 (NMJ)은 시냅스 구조와 기능 연구를위한 훌륭한 모델입니다. Drosophila 잘 강력한 유전자 조작과 애벌레 신경계가 정상 기능뿐만 아니라 공부에 특히 유용합니다 입증되었습니다뿐만 아니라 perturbations의 용이성에 대한 알려져있다 그 일부 신경 질환 (로이드와 테일러, 2010)과 함께. Drosophila에서 발견된 대부분의 주요 시냅스 분자는 또한 포유류에서 발견된 대부분의 CNS는 포유류의 시냅스를 흥분성의 같은 Drosophila NMJ은 glutamatergic하고 활동을 종속적인 리모델링을 (코 외., 2000)을 보여줍니다 수 있습니다. 자신의 innervation 패턴 그것이 가능한 이러한 모터 뉴런과 신체 - 벽 근육 섬유 사이의 것과 식별 시냅스 터미널, 그들이 신경을 분포시키다 (Keshishian와 김, 2004). 공부를하고 틀에 박힌 및 반복되기 때문에 또한, Drosophila의 뉴런은 개별적으로 확인할 수 있습니다 유전과 물리적 조작의 용이성과 함께 evolutionarily 보존 버렸네 구성 요소의 존재는 시냅스 기능 (Budnik, 1996)을 기본 메커니즘을 조사하는 Drosophila 모델이 이상적입니다.

이들은 신경 전달 물질 방출의 사이트이기 때문에 시냅스 터미널에서 활성화된 영역은 특히 관심이 있습니다. NC82은 Drosophila 단백질 Bruchpilot (Brp), 활성 영역 (Wagh 외., 2006)의 중요한 구성 요소입니다 CAST1/ERC 가족 구성원을 인식 단클론 항체이다. Brp 직접 활성 영역 T - 바 형태로 표시하고 효과적으로 칼슘 ² 클러스터링에 대한 책임이 ⁺ T - 바 밀도 아래 채널 (파우켓 외., 2009).했습니다 Brp의 돌연변이 ^{칼슘이 많이} 감소 ⁺ 채널 밀도, 우울 evoked 소포 릴리스 및 변경 단기 소성 (키텔 외., 2006). 활성 영역의 변경은 Drosophila 질환 모델에서 관찰되었습니다. 예를 들어, NC82 항체를 사용하여 immunofluorescence는 활성 영역 밀도가 루게릭병과 피트 - 홉킨스 증후군 (.; Zweier 외, 2009. Ratnaparkhi 외, 2008)의 모델로 감소되었다 것으로 나타났다. 따라서 질병의 Drosophila의 애벌레 모델에 적극적으로 지역 또는 기타 시냅스 단백질의 평가는 시냅스 결함의 존재에 대한 가치있는 초기 실마리를 제공할 수 있습니다.

NMJ의 immunofluorescence 분석을 위해 전체를 마운트 해부 Drosophila의 애벌레를 준비하는 것은 몇 가지 기술이 필요하지만, 약간의 연습이 가장 과학자들에 의해 수행할 수 있습니다. 발표는 각 유전자형 사이의 환경 차이를 제한하고 재현성 및 통계 분석에 대한 자신감을위한 충분한 동물을 제공 해부와 같은 해부 접시에 immunostained하는 여러 애벌레를 위해 제공하는 방법입니다.

프로토콜

1. Immunofluorescence 준비 :

1. 해부 표면을 만들려면, 작은 조직 문화 플레이트에 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 자료를 부어. 완전히 그래서 해부 영역 림보다 낮은 것을 번호판을 작성하지 않도록합니다.
2. 조작의 용이성 증가 약 3.5mm의 길이로 절개 핀을 장식하고, 유충 당 적어도 6 핀을 가지고 있는지 확인하십시오.
3. 당신은 절개에 대한 핀을 파악하실 수 있습니다 무딘 집게가 필요합니다.

2. 애벌레의 해부 :

1. 유리병의 측면 주위에 크롤 링하고 번데기가되다하기 시작하지 않은 셋째 instar의 애벌레를 헤매고 선택합니다.
2. stereomicroscope 아래 절개 표면에 유충 놓으십시오. 멀리 Kimwipe를 사용하여 여분의 moister 윅.
3. 등의 측면가 직면되도록 각각의 유충을 마련. 당신은 애벌레의 등 부분의 측면 두명 기관, 흰색 라인을 볼 수 있습니다. 이것은 지느러미 정중선을 표시하기 때문에 중간에 중심이 최대한보십시오.
4. 그냥 입 갈고리 위에 플레이스 핀 # 1 (그림 1).
5. 그냥 tracheae 사이 spiracles 위의 꼬리에 핀 # 2를 넣으십시오.
6. 표피의 건조 방지하기 위해 애벌레로 PBS의 작은 금액을 추가합니다.
7. genotypes 각 유전자형 사이에 핀을 삽입하여 공간 구분되었는지 확인하고 모든 애벌레와 함께 위의 단계를 반복합니다.
8. tracheas (그림 1) 모두에 걸쳐 핀 # 2 위에 작은 가로 커팅 권리를합니다.
9. 과거 핀 최대 tracheas 사이 등의 정중선을 따라 처음으로 자르고 잘라 모든 방법 # 1에서 가위를 삽입합니다.
10. 당신은 왼쪽과 오른쪽 양쪽 당신이 표피에 당기는하지 않고 그들을 핀 수 있도록 최대 열 수 있도록, 표피의 양쪽 상단과 하단에 다른 작은 상처를해야합니다.
11. 플레이스 핀 # '의 3, 4, 5, 각 모서리에 6.
12. 상온에서 20-25분에 대한 4% PFA로 샘플을 수정
13. PFA를 가만히 따르다 각 시간을 decanting, PBS로 3-4 회 씻어.

3. 조직의 제거 :

1. 일반적으로 당신은 두뇌가있는 지역을 보호하기 원하기 때문에 뒷부분 끝에 조직을 제거하여 시작합니다.
2. steromicroscope을 사용하고 PBS의 드롭 아래 애벌레와 먼저 기관 중 하나의 뒷부분 끝을 잡아와 함께 지방 신체의 일부를 제거할 수있는 그것을 끄집어 동안. 두 번째 기관에 대해 반복합니다.
3. 뒷부분 지방 신체 또는 대장의 일부를 잡고 그들을 준비 밖으로 당기십시오. 뒷부분 조직의 대부분이 제거되면 뇌 주위의 작​​은 조직을 제거하는 데 중점을 둡니다. 당신이 근육 또는 NMJ의 형태에서만 관심이있다면 당신은뿐만 아니라 두뇌를 제거할 수 있습니다.
4. 두뇌의 제거 복부 세그먼트 오리 엔테이션에 도움이 표지는 근육 31의 더 나은 시각화를위한 수 있습니다.

4. 활성 영역에 대한 Immunofluorescence :

1. 해부 접시의 해부 preps을 차단 에이전트 (PBS에 5% 정상 염소 혈청)를 추가합니다. 실온에서 1 시간 차단합니다. 당신은 dilutions를 차단하고 항체 한 솔루션을 원하실 경우, 0.1 % 조직 permeabilization에 대한 차단 에이전트 TritonX - 100이 포함됩니다.
2. 0.1 % TritonX - 100와 시약을 차단에 희석 차 항체를 적용합니다. 활성 영역 항체가 발달 연구 브리 도마 은행 (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/)를 통해 실현됩니다. NMJ 막과 axons을 라벨 (예 : 와사비 퍼옥시데이즈 - Cy3 공액) 참조 항체를 사용합니다.
3. 4 ° C 하룻밤에 기본 항체를 품어. 냉장고의 건조는 항체 솔루션을 증발되지 않도록 즉, 사용하는 피펫 팁 상자의 아래쪽에 물을 넣어 습도 챔버를 만듭니다. 표백 형광을 줄이기 위해 알루미늄 호일로 투명한 뚜껑을 커버. 습도 챔버의 해부 슬라이드를 삽입하고 밤새 4 ° C 배양기에서 전체 박스를 넣어.
4. 다음날 아침, PBST (0.2 % 트리톤 - X - 100과 함께 PBS) 50~10분 각 5-10 시간을 씻으십시오.
5. 보조 항체 (예 : Invitrogen 알렉사 염소 반 마우스 - 488) 적용 습도 챔버에 2-4시간에 대해 실온에서 0.1 % TritonX - 100와 시약을 차단에서 희석과 부화. 보조에서 (예 : DAPI) 핵 얼룩을 포함, 당신은 근육이나 두뇌에있는 핵의 위치를​​ 확인하려는 경우.
6. PBST (0.02 % 트리톤 - X - 100과 함께 PBS)으로 5-10분 각 5-10 번 씻으십시오.

5. 슬라이드에 애벌레 샘플을 장착 :

1. 가만히 따르다 그리고 마지막 PBST 세척을 심지.
2. 아래 고정된 애벌레 가죽을 충당하기 위해 약 1mL 피펫 80 % 글리세롤.
3. 모든 애벌레에서 6 핀 5를 제거합니다.
4. 그 genoty의 모든 애벌레의 마지막 핀을 제거 슬라이드의 첫 번째 유전자형을 넣어 준비가되면PE.
5. 깨끗한 슬라이드에 장착 매체의 두 방울을 넣어 "세척"슬라이드를 준비합니다. 이 단계는 이미지를 마운트하고 명확한에 대한 애벌레에서 물이 솔루션을 세척하는 것이 중요합니다.
6. 글리세롤의 대부분을 제거하려면, 야기한 포셉와 꼬리 한 유충을 잡아 글리세롤에 주변의 유충을 끌어다 다음 해부 요리의 건조 가장자리를 따라. 첫 번째 설치 매체 드롭에 애벌레를 놓습니다.
7. 동일한 유전자형의 유충 모두 6 단계를 반복합니다.
8. 일단 모든 애벌레는 첫 번째 설치 매체 드롭, 꼬리에 의해 최초의 유충을 잡아서 매체의 대부분을 제거하는 음식의 건조 가장자리를 따라 다음 드롭과를 통해 당기 있습니다. 그런 다음 두 번째 설치 매체 드롭에 애벌레를 놓습니다.
9. 동일한 유전자형 모든 애벌레를위한 8 단계를 반복합니다.
10. 그것을 분류하고 슬라이드에 장착 매체의 작은 "T"형상을 배치하여 최종 슬라이드를 준비합니다.
11. 단계 5.8에서와 마찬가지로, 꼬리로 유충을 잡으면, '와시'슬라이드의 건조한 면을 따라 다음 두 번째 설치 매체와 드롭을 통해 펠트를 가져옵니다. 매체의 대부분에서 온 후, 장착 매체의 마지막 슬라이드에 애벌레 펠트를 놓습니다.
12. 모든 애벌레 가죽에 대해 반복합니다.
13. 모든 애벌레 가죽이 같은 표피 사이드가 다운되고 노출된 근육가 직면하고 있는지 확인하고 원하는 정렬되었는지 확인합니다.
14. "T"의 상위 라인의 시작 가장자리와 해부 애벌레를 충당하기 위해 슬라이드에 커버 슬립을 플레이스
15. 장착 매체 커버 슬립에 따라 완벽하게 퍼져 있는지 확인하고, 커버 슬립에 작은 무게 (예 : 9 볼트 건전지)를 넣어.
16. 장착 매체 치료까지 가능한 형광 담금질을 줄이기 위해, 서랍 또는 어두운 공간에서 슬라이드를 놓으십시오.
17. 커버 슬립의 양날을 넘쳐 장착 매체를 청소하십시오. 70 % 에탄올로 커버 슬립이나 슬라이드에 과도한 건조 장착 매체를 청소하십시오.
18. 손톱 폴란드어과 인감, 최종 도장을 만들 수 있습니다.

6. 대표 결과 :

해부 및 immunostained 애벌레의 예제 슬라이드는 그림 2에 표시됩니다. 애벌레의 해부, 얼룩 및 장착이 제대로 완료되면, 사용자는 세그먼트 A2 - A6에 대한 관심의 애벌레 근육 (그림 3)을 확인할 수 있습니다. 호앙 외가. 자세한 근육의 위치에 대한 설명뿐만 아니라 구체적인 시냅스 부튼스 (호앙와 치바, 2001)의 특성을 제공합니다. 높은 전력 사용 목적 사용자는 단일 버렸네에 집중하고 Z - 스택 이미지를 취할 수 있습니다. 버렸네 7분의 6의 부분의 대표적인 최대 프로젝션 이미지 (그림 4) 표시됩니다. 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 활성 영역이 양적 귀하의 돌연변이 표현형 특정 아르 특성을 평가할 수 있습니다. 특정 돌연변이 표현형에서 변경될 수 있습니다 기능의 예는 다음과 활성 영역 사이의 총 개수, flourescence 강도와 간격을 포함합니다.

잠재 주의할 점 :

애벌레 신경근육학 접합의 Immunofluorescence 평가는이 시스템의 유틸리티를 제한할 수 있습니다 잠재적인 함정이 있지만, 신경 생물학에 귀중한 통찰력을 제공할 수있는 가치있는 시스템입니다. 예를 들어, 자주 같은 샘플에서 둘 이상의 기본 항체의 얼룩 패턴 이미지를하는 것이 바람직하다. 적절한 기본 항체 적절한 fluorophores, 그리고 적절한 제외어 컨트롤의 선택은 성공을 위해 필수적입니다.

실험에 영상이 항원 경우, 기본 항체 관심 각각의 단백질이 고유 찬란 라벨 보조 항체와 함께 확인할 수 있도록 여러 종 것을 확신합니다. 배경을 줄이기 위해 권장되는 방법은 보조 항체가 (염소 안티 - 토끼 또는 방지 마우스 차 항체를 사용하는 경우 예 차단 요원으로 정상 염소 혈청을 사용) 파생되었다하는 종족의 정상 혈청을 포함하는 차단 에이전트를 사용하는 것입니다.

이 실험에서 사용되는 기본 및 보조 항체를 계획 후 또한 얼룩의 컨트롤을 포함하여 고려해야하는 것은 당신이보고있는 형광 신호가 실제와 단지 배경이 있는지 확인하기 위해 설정합니다. 가능하면 관심의 단백질을 포함하지 않는 대조군 샘플을 포함합니다. 이것은 쉽게 야생 유형 동물을 포함하여 외인성 transgene overexpression의 연구에서 수행하지만, 일부 경우에 대한 관심의 단백질의 homozygous 돌연변를 사용하여 수행할 수 있습니다. 당신의 형광 신호의 배경 수준을 측정하는 데 유용합니다 또 다른 중요한 부정적인 제어, 기본 포함하지 않고 보조 항체를 사용하는 것입니다. 언제 이미징 당신의 결과 preps, 그것을 당신이 보는 것을 형광 신호의 모든 현실이되지 않는 것을 이해하는 것이 중요하고, 요의 배경 수도 있습니다UR 차 항체 또는 내생 조직 배경에서. 이 형광 강도를 사이에 변경 사항을 시금 때 배경 형광을 고려하여 이미지를 정상화해야 할 수도 있습니다.

형광단의 선택도 신중하게하셔야합니다. 각 형광단 및 고유 각 신호를 감지하는 능력에 대한 여기 및 발광 스펙트럼의 고려를 통해 채널 출혈을 방지하는 것이 필수적입니다. 모든 불확실성을 통해 출혈의 정도는 한 번에 하나의 형광단 - 표시된 항체와 immunostain 및 최종 실험에서 사용하는 것으로 각 채널로 이미지를 확인 여부를 확인하는 간단한 방법이있다면. 을 통해 출혈이 현미경 필터 세트로 발생하는 경우이 공개됩니다.

그림 1. 표피 절단 및 핀을 1-6. 배치의 플로우 차트는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오

그림 2. 마지막 슬라이드에서 애벌레의 배치. 애벌레의 preps가 아래 근육 측면을 노출하고 표피 사이드되었는지 확인합니다. 각 샘플 사이에 최소한 애벌레 몸 너비를 둡니다.

그림 3.되면 이미지, 관심의 근육과 세그먼트를 찾습니다. 일반 신경근육학 분기점은 신경을 분포시키다 근육 7분의 6, 근육 13 근육 12, 또는 근육 4 특징. 배면의 정중선의 반대편에서 표시된 헤미 세그먼트의 미러 이미지 근육 구조가 있습니다. 이 이미지있는 세그먼트 식별하는 마커로 힘 31를 사용합니다. 부량 사용할 수 있습니다 유전자형마다 많은 신경 이미지를 수집하여 샘플의 나머지 부분에 대한 이미지 같은 시냅스와 세그먼트.

그림 4. NMJ innervating 근육 7분의 6의 일부의 대표 최대 투영 이미지가 표시됩니다. NC82 (Bruchpilot) 얼룩은 녹색으로 표시됩니다. 얼룩 HRP 사전 시냅스은 빨간색으로 표시됩니다. 추가 이미징 소프트웨어 계량 수있는 활성 영역 punctae를 적어 둡니다.

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토론

뉴런은 시냅스 터미널 면적은 매우 중요하며, 사후 및 사전 신경 세포들 간의 적절한 의사 소통을위한 다리입니다. 질환 모델에서 신경 세포의 건강을 조사하기 위해 강력한 방법은 immunofluorescence에 의해 시냅스 터미널의 단백질을 분석하는 것입니다. 여기에 제시 immunofluorescence 방법은 집단 간의 환경 차이를 제한하는 동안 연구자가 동시에 많은 애벌레를 검사 수 있습니다. Drosophila 타사 i...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머베이스	다우 코닝	68037-59-2	혼합 후 느린 회전에 넣어 30 분 이상 앉아 있도록하여 천천히 상승하는 기포에 대한 수 있습니다.
스테인레스 스틸 Minutien 핀	파인 과학 도구	26002-10	약을 낸다. 일반 가위로 길이 3 ~ 4mm짜리
Laminectomy의 집게 (핀 쥐고위한 블런트 - 사용)	파인 과학 도구	11223-20	핀 쥐고에 ​​대한 무딘 포셉로 사용
해부의 포셉	세계 정밀 계측기	501985
극상의의 Vannas 가위, 길이 8cm	세계 정밀 계측기	501778
마우스 방지 Brp 항체	DSHB	NC82	1시 50분 희석을 사용
Cy3 Affinipure 고앗 방지 양고추냉이 퍼옥시데이즈	잭슨 Immunoresearch	123-165-021	1:200 희석에서 사용
알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG	Invitrogen	A11001	약 사용합니다. 1:200 희석