Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

Riepilogo

In questo video ci mostrano la preparazione della E18 neuroni corticali di ratto.

Abstract

In questo video, dimostriamo la preparazione della E18 neuroni corticali di ratto. E18 neuroni corticali di ratto sono ottenuti da E18 corteccia fetale di ratto precedentemente sezionati e preparati. La corteccia è E18, dopo la dissezione, immediatamente dissociato in singoli neuroni. E 'possibile memorizzare E18 corteccia in un tampone contenente Hibernate E B27 a 4 ° C per un massimo di una settimana prima della dissociazione viene eseguita. Tuttavia, ci sarà un calo di vitalità cellulare. Tipicamente si ottiene la nostra E18 Cortex fresca. E 'trasportato al laboratorio a freddo di calcio privo di ghiaccio tampone dissezione di magnesio libero (CMFM). All'arrivo, tripsina viene aggiunto alla corteccia a una concentrazione finale di 0,125%. La corteccia viene quindi incubato a 37 ° C per 8 minuti. DMEM contenente 10% FBS viene aggiunto alla corteccia per arrestare la reazione. La corteccia viene poi centrifugato a 2500 rpm per 2 minuti. Il surnatante viene rimosso e 2 ml di Neural media basale (NBM) contenente 2% B27 (vol / vol) e lo 0,25% si aggiunge Glutamax (vol / vol) verso la corteccia che viene poi nuovamente sospeso pipettando su e giù. Successivamente, la corteccia è triturato con pipette di vetro precedentemente lucidate a fuoco, ciascuno con una successiva apertura più piccola. Dopo la triturazione, la corteccia è ancora una volta centrifugato a 2500 rpm per 2 minuti. Il surnatante viene quindi rimosso e il pellet di corteccia risospese con 2 ml di NBM contenenti B27 e Glutamax. La sospensione cellulare viene fatto passare attraverso un colino 40 um cellule nylon. Avanti le cellule sono contati. I neuroni sono ora pronti per il caricamento nel dispositivo neurone microfluidica.

Protocollo

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto fetale per compartimentazione

Prima di partire, è importante per scaldare tutti i supporti necessari e reagenti a 37 ° C.

E 'anche importante per sterilizzare tutto ciò che viene utilizzato per la preparazione delle cellule (ad esempio, le lampadine gomma, portaprovette, bottiglie media, ecc), e ciò che è posto nel cofano, con l'annientamento verso il basso con il 70% di etanolo.

1. Mettere due pezzi di corteccia di ratto E18 fetale (un cervello, precedentemente sezionato) in una provetta da 15 ml contenente 1 ml ghiacciata calcio-magnesio libero senza buffer di dissezione.
2. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla corteccia dissezione nel buffer, portando il volume finale a 2 ml e la concentrazione di tripsina finale a 0,125%.
3. Posizionare il tubo di 15 ml in un bagno d'acqua a 37 ° C per 8 minuti.
4. Durante questo periodo, il fuoco lucidare 3 pipette Pasteur di vetro, formando aperture sempre più piccoli, in un armadio di biosicurezza per aiutare a mantenere la sterilità.
5. Dopo l'incubazione 8 minuti della corteccia, aggiungere 10 ml di DMEM contenente 10% FBS alla corteccia per aiutare a fermare la reazione tripsina.
6. Centrifugare i 15 tubo ml contenente la corteccia e DMEM/10% FBS a 2500 rpm per 2 minuti.
7. Nell'armadio biosicurezza, rimuovere il sopranatante della corteccia con una pipetta Pasteur in vetro sottovuoto con aspirazione allegato. Fare attenzione a non disturbare o rimuovere il pellet.
8. Aggiungere 1 ml di NMB al pellet di corteccia e pipettare delicatamente su e giù. E 'molto importante evitare di creare bolle d'aria, mentre pipeting su e giù, come le bolle d'aria può danneggiare le cellule dall'ossidazione.
9. Usare il fuoco lucido pipetta Pasteur con la più ampia apertura verso triturare la corteccia ed accompagnato da una lampadina sterile gomma fino alla fine e pipeting su e giù per 5 volte, sempre facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Continuare questo processo con gli altri 2 pipette di vetro, ciascuna con una dimensione di apertura ridotto.
10. Dopo la triturazione, centrifuga giù le cellule di nuovo a 2500 rpm per 2 minuti.
11. Dopo la centrifugazione, ancora una volta, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di NBM.
12. Filtrare la soluzione risospeso cellula attraverso un colino 45 celle um.
13. Macchia le cellule con Blu tripan, contati, e caricati nel dispositivo. Noi di solito carico 20 ul di cellule per dispositivo.

Nota: la concentrazione finale di cellule è in genere tra 2,5 milioni di cellule / ml e 8 milioni di cellule / ml

Caricamento in corso le cellule

Dopo che le cellule sono state contate, è tempo di caricare le cellule del dispositivo:

1. Portare i dispositivi precedentemente preparato contenente NBM nel mobile biosicurezza per mantenere la sterilità.
2. Rimuovere i supporti in eccesso dai pozzi di aspirazione. Tuttavia, fare attenzione a evitare di rimuovere tutti i mezzi di comunicazione - ci deve essere qualche supporto nel canale principale.
3. Applicare 20 ul di cellule al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo (vedi schema se necessario). Il flusso di cellule nel dispositivo e attaccarsi alla superficie trattata PLL.
4. Dopo il caricamento, posizionare i dispositivi contenenti cellule indietro in un incubatore per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare.
5. Dopo 10 minuti, riempire i serbatoi con i media e dispositivi di luogo indietro nell'incubatrice.

Discussione

Densità delle cellule può essere variata a seconda dell'applicazione. Tuttavia, semina neuroni primari troppo basso di una densità di porta normalmente alla morte cellulare. A seconda della incubatrice e il livello di umidità, i media può avere bisogno di essere cambiato nei dispositivi ogni 2 o 3 giorni. Quando si cambiano i media, è importante dopo aver rimosso il supporto dal serbatoio, per rimuovere mai i media dai canali principali. Inoltre, è buona abitudine mettere mezzi freschi nei pozzetti superiore e consentire ad alcuni mezzi freschi a fluire attraverso il dispositivo e nei principali canali prima di riempire tutti i serbatoi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.