Creare fratture rigidamente stabilizzati per la Valutazione ossificazione intramembranosa, osteogenesi per distrazione, o guarigione di difetti critici Sized

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per stabilizzare fratture delle ossa lunghe che si basa sull'applicazione di modificati Ilizarov fissatori esterni ^1-3. Dopo l'applicazione dei fissatori e la creazione della lesione ossea, la guarigione può essere valutata, osteogenesi per distrazione può essere eseguita, o non-union o critici difetto dimensioni possono essere creati e utilizzati per studiare interventi terapeutici.

Abstract

Valutare le modalità di riparazione scheletrica è essenziale per sviluppare terapie per essere usato in clinica per il trattamento di fratture. Stabilità meccanica svolge un ruolo importante nella guarigione delle lesioni ossee. Nel peggiore dei casi instabilità meccanica può portare a ritardi o gli esseri umani non-union in. Tuttavia, il movimento può anche stimolare il processo di guarigione. Nelle fratture che hanno forme di movimento della cartilagine per stabilizzare le estremità della frattura delle ossa, cartilagine e questo viene gradualmente sostituito da tessuto osseo attraverso ricapitolazione del processo di sviluppo di ossificazione endocondrale. Al contrario, se una frattura ossea è rigidamente stabilizzata osso costituisce direttamente tramite ossificazione intramembranosa. Clinicamente, sia encondrale e intramembranosa si verificano simultaneamente. Per replicare efficacemente questo processo investigatori inserire un perno nel canale midollare dell'osso fratturato come descritto da Bonnarens ^4. Questo metodo sperimentale fornisce eccellente stabilità laterale consentendo rotazionaleinstabilità NAL a persistere. Tuttavia, la nostra comprensione dei meccanismi che regolano questi due processi distinti può anche essere arricchita da sperimentalmente isolare ognuno di questi processi. Abbiamo sviluppato un protocollo di stabilizzazione che fornisce stabilità rotazionale e laterale. In questo modello, l'ossificazione intramembranosa è l'unica modalità di guarigione che si osserva, ei parametri di guarigione possono essere confrontati tra i diversi ceppi di topi geneticamente modificati ^5-7, dopo l'applicazione di molecole bioattive ^8,9, dopo alterazione dei parametri fisiologici di guarigione ^10, dopo aver modificato la quantità o il tempo di stabilizzazione ^11, dopo la distrazione osteogenesi ^12, dopo la creazione di un non-union ^13, o dopo la creazione di un difetto critico dimensioni. Qui illustriamo come applicare il fissatore Ilizarov modificati per studiare la guarigione della frattura tibiale e la distrazione osteogenesi nei topi.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Institutional Animal Care UCSF e sull'uso Comitato e sono conformi alle linee guida nazionali.

1. Preparazione dei fissatori Prima di Chirurgia

1. Prima di creare fratture stabilizzate, bisogna montare il custom-design del dispositivo di fissazione esterna. Le custom-designed telai esterni di fissaggio costituito da due anelli di alluminio stabilizzata da tre in acciaio inox # 0/56 barre filettate, 8 # 2/56 dadi esagonali e 17 bulloni corrispondenza (Small Part Inc., Miami Lakes, FL ^3).
2. Due anelli di alluminio sono necessari per frattura. Per assemblare un anello 4 # 2/56 dadi esagonali (piccola parte Inc., Miami Lakes, FL) e bulloni corrispondenti negli appositi fori, questi deve rimanere libera. Questo sarà l'anello prossimale. Per montare l'anello distale 3 dadi e bulloni, ancora una volta non serrare a fondo.

2. Anestesia, Creazione Fracture, e fissatore Application

1. Mice (età, sesso, e il corpopeso sono determinati dall'utente) vengono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 50mg/ml chetamina, 0,5 mg / ml medetomidina (0,03 ml / topo).
2. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dei topi e mettere un pezzo di nastro in tutta la loro testa per proteggere i loro occhi durante la procedura.
3. L'animale viene posto su una piastra elettrica per il resto della procedura.
4. Trafiggere il metafisi prossimale e distale della tibia sinistra con quattro perni di 0,25 mm di insetti sterili (Anticorro: Strumento Science Fine, Foster City, CA) collegando i pin di uno strumento di Dremel e la perforazione attraverso l'osso.
5. Perni sono orientate perpendicolarmente all'asse longitudinale della tibia, e 90 ° fra loro. Almeno 10 mm tra i perni prossimale e distale.
6. Posizionare il primo anello sopra i perni prossimali con i dadi rivolti verso l'interno, verso i birilli. Fissare i perni sul ring mantenendo la tibia in posizione centrale all'interno dell'anello di alluminio.
7. Posizionare il secondo anello di sotto delperni Stal e fissare i perni per l'anello con i dadi esagonali come prima. Aggiungere il quarto dado-bullone combinazione della distale fissatore.
8. Creare la frattura trasversale da tre punti di piegatura con un dispositivo appropriato. Usiamo il sistema di gravità della Bonnarens Einhorn e ^4. Appoggiare la superficie postero-laterale della tibia attraverso i blocchi, sollevare il peso ad un'altezza predeterminata lungo il braccio goccia e perdere peso in modo che viene a contatto con l'aspetto antero-laterale della tibia per produrre la frattura smussata. L'altezza del peso viene fatto cadere da deve essere determinato per ogni ceppo di topo per garantire una frattura singola esclusivamente della tibia.
9. Fracture è confermata da X-ray.
10. Dopo la conferma della frattura, tre acciaio inossidabile # 0/56 aste filettate sono attaccati agli anelli. A partire dall'estremità distale inserire l'asta e infilare un dado sull'anello distale per bloccare l'asta. Poi mettere un altro dado sullo stelo, l'anello prossimale siederà in cima a questo nut. Assicurarsi che i due anelli si terrà a distanze uguali e non sforzare le spine. Fissare l'anello prossimale alle aste con una terza noce.
11. Iniezioni sottocutanee di buprenorfina (1,0 mg / kg) per l'analgesia viene dato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e gli animali vengono monitorati per dolore e buprenorfina dato quando necessario.
12. L'anestesia è invertita con la somministrazione di atipamezolo, e gli animali vengono monitorati fino a quando non sono reattivi e deambulazione.

3. Osteogenesi per distrazione (vedi anche: ^12,13)

Per modificare questa procedura per accogliere distrazione osteogenesi è semplice. Gli anelli sono tenuti in posizione da barre filettate, e ruotando i dadi di fissaggio delle aste in posizione gli anelli possono essere allontanate.

1. Latenza: Per distrazione osteogenesi standard utilizzando questo modello i fissatori sono posti sul tibia e lasciato solo per un periodo di latenza di 5 giorni.
2. Distrazione: osteog Distractionenesis può essere effettuata agendo sui dadi sulle barre stabilizzatrici ¼ di giro (0,25 mm) ogni giorno 7 giorni.
3. Maturazione: Bony ponte è osservata da 10 giorni e il consolidamento completo è osservata da 27 giorni dopo il completamento di distrazione.

4. Creazione di un difetto critico Sized

Per creare un difetto critico dimensioni dei fissatori esterni vengono applicate come precedentemente descritto con le seguenti modifiche.

1. Prima di iniziare la procedura, la pelle viene pulita con il 70% di etanolo.
2. I fissatori sono applicati completamente prima di creare il difetto.
3. Il mouse viene quindi posto sotto il microscopio di dissezione per visualizzare la tibia mediale, e una incisione (mm 5-7) è realizzato con una lama # 10 su un bisturi.
4. Il muscolo viene delicatamente recisi e separato per esporre la metà diafisi della tibia.
5. A 3 mm del segmento osseo viene quindi rimosso dalle forbici utilizzando metà diafisi. Uso tegli punto delle forbici, l'osso è stato tagliato via lentamente e frammenti ossei vengono rimossi con pinze se necessario. Bisogna fare attenzione con le punte delle forbici per evitare di sostituirsi alla tibia con una grande forza meccanica.
6. Esaminare il sito chirurgico per garantire che non vi siano frammenti ossei, in quanto potrebbero promuovere la guarigione.
7. Sostituire il muscolo intorno alle estremità smussate della tibia.
8. Chiudere l'incisione sulla pelle con 2-3 punti di sutura monofilamento 6-0 di poliammine.
9. L'anestesia è invertito e gli animali vengono monitorati per dolore e dato analgesici come precedentemente descritto.

5. Risultati rappresentativi

Quando correttamente applicato, i fissatori esterni fornire più rigida stabilità della frattura chiusa tibiale con una eccellente riduzione (Figg. 1, 2). Tuttavia, in alcuni casi insufficiente riduzione (una lacuna evidente e grande tra le estremità ossee o fratture multiple verificarsi (Fig. 3 ), E questi topi sono esclusi dalla analisi. Fratture stabilizzato con questo metodo guarire principalmente attraverso ossificazione intramembranosa (Fig. 4). Al contrario, se la frattura non è stabilizzato un callo cartilagine grande è formata nella gap frattura (Fig. 5), e questo è sostituito da osso attraverso il processo di ossificazione intramembranosa.

Figura 1. Radiografie illustrano un dispositivo esterno di fissaggio utilizzato per stabilizzare frattura tibiale. Radiografia dopo la frattura che mostra alcuni segmenti ossei ben allineati (punta di freccia).

Figura 2. Immagine di un topo dopo che il fissatore è stato applicato.

Figura 3. Radiografia presa dopo fracture mostra segmenti ossei non allineate e frammentato (punta di freccia).

Figura 4. Frattura stabilizzata guarisce via ossificazione intramembranosa. Colorazione tricromica di frattura stabilizzata mostra qualche nuovo osso (b) al sito di frattura. Scala bar = 500 micron.

Figura 5. Non stabilizzato frattura guarisce via encondrale. Colorazione tricromica di frattura non-stabilizzato mostra cartilagine (c) e osso (b) al sito di frattura. Scala bar = 500 micron.

Discussione

Ossa guarire da due diverse modalità a seconda della stabilità meccanica (recensione in: ^14). Se lasciato instabili a grandi forme modello cartilagine nel gap frattura che è sostituito da osso per colmare le due estremità della frattura. Prossimale e distale alla rottura, l'osso si forma direttamente da ossificazione intramembranosa all'interno del periostio e endosteum. Al contrario, in stabile guarigione delle fratture avviene esclusivamente via ossificazione intramembranosa ^3. Tuttav...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Insetto pin 0,25 millimetri	Science ottimo strumento	26000-25	Oscurati in acciaio anodizzato, asta di 0,25 millimetri di diametro, quattro centimetri di lunghezza
Dado esagonale in acciaio inossidabile	Parti piccole	# 2-56	1/8 "di lunghezza, 56 filetti per pollice
Dado esagonale in acciaio inossidabile	Parti piccole	# 0-80	1/8 "di lunghezza, 80 filetti per pollice
Vite in acciaio inox della macchina	Parti piccole	# 0-80	1/8 "di lunghezza, 80 filetti per pollice
Macchina in acciaio inox Taglio Rod filettato	Parti piccole	# 0-80	6 "lunghezza, 80 filetti per pollice
18-8 in acciaio inossidabile Machine Head ScREW	McMaster-Carr		2-56 Threads ", lunghezza 3/6
Fissazione dispositivo esterno	Officine meccaniche	Custom-designed