Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

Riepilogo

L'approccio qui presentato PCR diretta facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di piante non purificato e tessuto animale.

Abstract

L'approccio diretto PCR facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, ed è dimostrata qui per i diversi impianti e tessuti animali (Figura 1). Diretto PCR si basa sulla appositamente progettato Thermo Scientific Phusion e DNA polimerasi Phire, che includono un doppio filamento dominio di legame del DNA che conferisce loro proprietà uniche come alta tolleranza di inibitori.

PCR-based rilevazione del DNA di destinazione dispone di numerose applicazioni nella ricerca sulle piante, tra cui l'analisi e la verifica dell'impianto genotipo dei transgeni. PCR dai tessuti vegetali comporta tradizionalmente una prima fase di isolamento del DNA, che può richiedere reagenti costosi o tossici. Il processo richiede tempo e aumenta il rischio di contaminazione incrociata ^{1, 2.} Al contrario, utilizzando Thermo Scientific Phire Pianta diretto PCR Kit DNA bersaglio può essere facilmente rilevato, senza previa estrazione del DNA. Nel modello mostrato qui, unesempio di derivato spaccati analisi di sequenza polimorfico amplificato (dCAPS) ^3,4 è effettuata direttamente da foglie delle piante di Arabidopsis. dCAPS saggi di genotipizzazione può essere utilizzato per identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) da SNP allele-specifica digestione con endonucleasi di restrizione ^3.

Alcuni campioni vegetali tendono ad essere più difficile quando si utilizzano metodi diretti PCR quanto contengono componenti che interferiscono con PCR, come composti fenolici. In questi casi, un ulteriore passaggio per rimuovere i composti è sempre richiesto ^2,5. Qui, questo problema viene superato usando un protocollo di diluizione semplice e veloce seguita da Direct amplificazione PCR (Figura 1). Quindici anni foglie di quercia sono utilizzati come modello per le piante impegnative come il campione contiene elevate quantità di composti fenolici tra cui tannini.

Trasferimento genico in topi è ampiamente utilizzato per studiare il ruolo dei geni in development, fisiologia e patologia umana. L'uso di questi animali richiede screening per la presenza del transgene, di solito con PCR. Tradizionalmente, questo comporta un dispendio di tempo passo isolamento del DNA, in cui il DNA per l'analisi PCR è purificata da tessuti orecchio, coda o punta ^6,7. Tuttavia, con il Thermo Scientific Tissue Phire animali diretti PCR Kit topi transgenici possono essere genotipizzati senza previa purificazione del DNA. In questo protocollo topo transgenico genotipizzazione è ottenuta direttamente da tessuti dell'orecchio topo, come dimostrato qui per un esempio impegnativo dove viene utilizzato un solo set di primer per l'amplificazione di due frammenti di dimensioni notevolmente differenti.

Protocollo

1. Genotipizzazione delle persone pianta di Arabidopsis con protocollo diretto

1. Per iniziare la genotipizzazione dCAPS dosaggio direttamente sulla foglia pianta Arabidopsis, prima formulare 20 o 50 ul reazioni PCR utilizzando l'impianto Phire diretto PCR Kit come descritto in Tabella 1.
2. Quindi, tagliare da 0,50 mm da un pugno foglia della pianta Arabidopsis con il Harris Uni-Core e Tappetino da taglio Harris. Tenendo il nemico con forza, premere il all'avanguardia nel tessuto e ruotare il nemico avanti e indietro.
3. Premere lo stantuffo per espellere il disco pugno in una miscela di reazione PCR. Assicurarsi che il campione cade nella soluzione di PCR e non aderisce alle pareti del tubo.
4. Pulire il bordo tagliente del perforatore tra ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata immergendolo in soluzione al 2% NaClO. Premere lo stantuffo su e giù un paio di volte e pulire il bordo di taglio con un tovagliolo di carta pulito. Il tappeto di taglio dovrebbe esseresciacquati tra i campioni.
5. Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici.
6. Dopo la PCR, centrifugare il materiale vegetale. Trasferire 5 ml di surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 4 ml di acqua e 1 ml di enzima di restrizione, SspI. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Incubare la miscela di reazione per un'ora a 37 ° C. Inattivare l'enzima di restrizione incubando a 65 ° C per 20 min.
7. Quando amplificazione del DNA direttamente dai tessuti vegetali, i prodotti di PCR sono componenti di impianti e PCR-derivata che possono interferire con la digestione con enzimi di restrizione. Pertanto, potrebbe essere necessario diluire o (ad esempio 1:2 o 1:3 in acqua) o purificare il prodotto PCR prima tegli digestione successiva, ad esempio utilizzando un apposito kit commerciale come Thermo Scientific Purification Kit GeneJET PCR.
8. Seguendo enzimi di restrizione, analizzare i frammenti risultanti su un gel di agarosio. Aggiungere 2,5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 10 microlitri della miscela risultante.

2. Amplificare frammenti specifici di DNA da Oak 15 anni, lascia utilizzando il protocollo di diluizione

1. Per cominciare, tagliare un pugno 2 mm di foglia di quercia.
2. Mettere il campione in 20 ml di tampone di diluizione fornito con il kit di Phire impianto diretto PCR. Pulire la punta di diamante del perforatore e taglio tappetino come prima.
3. Macinare il campione in foglia con una punta di 100 microlitri pipetta premendo brevemente contro la parete del tubo. A seconda del materiale vegetale, il protocollo di diluizione volte funziona meglio senza schiacciare il campione.
4. Spin i campioni brevemente in una microcentrifuga fino a tegli reazioni sono in fondo dei tubi.
5. Il supernatante può essere utilizzato direttamente nel PCR, oppure può essere diluito 1:10 o 1:100 in acqua sterile a seconda del tipo di campione. Usare 0,5 microlitri a 1 microlitri di supernatante o diluizione come modello per una reazione di 20 microlitri PCR. Preparare la reazione, come descritto in Tabella 1.
6. Una volta che le reazioni sono preparati, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici.
7. Dopo la PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 15 microlitri della miscela risultante.

3. Genotipizzazione di topi transgenici che utilizzano il protocollo di diluizione

1. Iniziare il protocollo di diluizione su topi transgenici ponendo un punzone 2 mm del morecchio Ouse in 20 ml di tampone di diluizione contenente 0,5 ml di additivo DNARelease fornito con il tessuto degli animali diretta Kit PCR Phire.
2. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2 min, seguito da 2 minuti di incubazione a 98 ° C.
3. Centrifugare i campioni brevemente in una microcentrifuga finché le reazioni sono in fondo dei tubi.
4. Usare 1 ml di surnatante come modello per una reazione di 20 microlitri PCR, preparato come descritto in Tabella 3. Qualsiasi supernatante che non deve essere utilizzato subito può essere trasferito in una nuova provetta e conservati a -20 ° C.
5. Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte in Tabella 4. Ancora una volta, le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR.
6. Seguendo PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio with 15 microlitri della miscela risultante.

4. Risultati rappresentativi

Nella tecnica dCAPS il sito di restrizione all'interno del SNP di interesse o è introdotto o distrutto usando un primer PCR con uno o più mismatch al DNA bersaglio. Genotipizzazione di individui pianta di Arabidopsis è stata effettuata con la tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. I prodotti amplificati sono stati digeriti ed i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel (Figura 2).

In questo esempio, i prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP di interesse (G o A allele) nel genoma Arabidopsis sono stati amplificati dai punzoni pianta a foglia con il Kit Phire impianto diretto PCR. Il primer forward conteneva Uno alla estremità 3 ', creando un SspI specifico sito di restrizione del DNA bersaglio, che comprendeva l'SNP di interesse (allele A) ma nonin altri allele del SNP (Figura 2B).

Protocolli di diluizione sono necessari per il materiale vegetale impegnativi, come la foglia di quercia, grazie alla sua elevata concentrazione di composti fenolici. Utilizzando il protocollo di diluizione qui descritto, il frammento di 297 bp di DNA è stato amplificato utilizzando cloroplastica il 3-step protocollo. Campioni foglia di quercia con diluizioni diverse sono mostrati in figura 3, in aggiunta ai controlli positivi e negativi.

L'animale Phire Tissue diretto PCR Kit è stato impiegato con un protocollo impegnativo dove è stato usato un solo set di primer per l'amplificazione di due frammenti con una differenza di grandi dimensioni, con conseguente raccolti abbondanti di entrambi i prodotti correttamente dimensionati di 1500 bp per topi transgenici e 200 bp per sorci di tipo selvatico (Figura 4). La fascia più debole superiore con topi eterozigoti è a causa della concorrenza di entrambi i modelli (alleli) per la coppia di primer stesso, tuttavia, la Genotypzione i risultati sono inequivocabili.

La stabilità dei campioni preparati utilizzando il protocollo di diluizione è stato anche testato. I risultati mostrano che i campioni di diluizione possono essere conservati a -20 ° C per almeno un anno. Inoltre, i ripetuti cicli gelo / disgelo non ha influenzato significativamente la reazione (Figura 5). È anche illustrato l'amplificazione robusta da campioni di tessuto dell'orecchio di topo usando DNA polimerasi Phire e il metodo diretto PCR rispetto a Taq polimerasi hot start e DNA purificato (Figura 6).

Componenti	Reazione di 20 microlitri	Reazione di 50 microlitri	Conc. finale.
H 2 O	Aggiungi a 20 pl	aggiungere a 50 microlitri
2x Phire Impianto PCR Buffer	10 pl	25 pl	1x
Primer A	X pl	X pl	0,5 micron
Primer B	X pl	X pl	0,5 micron
Phire Hot Start II DNA polimerasi	0,4 pl	1 ml
Campione / Direct Protocol		0,50 millimetri pugno
Campione / diluizione protocollo	0,5-1 pl

Tabella 1. Le condizioni di reazione per PCR pianta utilizzata in questo protocollo.

Fase del ciclo di	Temp.	Tempo	Cicli
Denaturazione iniziale	98 ° C	5 min	1
Denaturazione Ricottura * Estensione	98 ° C X ° C 72 ° C	5 sec 5 sec 20 sec	40
Estensione finale	72 ° C 4 ° C	1 min tenere	1

Tabella 2. Condizioni bicicletta relativi alle centrali di PCR utilizzato in questo protocollo.

* Il calcolatore di Tmoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari a inferiore alla Tm proposta dal WebTool. Per primer> 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool.

Componenti	Reazione di 20 microlitri	Conc. finale.
H 2 O	Aggiungi a 20 pl
2x Phire Animal Tissue PCR Buffer	10 pl	1x
Primer A	X pl	0,5 micron
Primer B	X pl	0,5 micron
Phire Hot Start II DNA polimerasi	0,4 pl
Campione / diluizione protocollo	1 ml

Tabella 3. Condizioni di reazione per PCR tessuti animali utilizzati in questo protocollo.

Fase del ciclo di	Temp.	Tempo	Cicli
Denaturazione iniziale	98 ° C	5 min	1
Denaturazione Ricottura * Estensione	98 ° C X ° C 72 ° C	5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb> 1 kb	40
Estensione finale	72 ° C 4 ° C	1 min Tenere	1

Tabella 4. Condizioni in bicicletta per il tessuto PCR animale utilizzati in questo protocollo.

* Il calcolatore Tm a www.thermoscientific.com / pcrwebtools è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari alla minore Tm in WebTool. Per primer> 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool.

Figura 1. PCR diretta workflow. Diretto PCR può essere effettuata utilizzando due protocolli alternativi. Nel protocollo diretto una piccola quantità di campione viene aggiunto direttamente al PCR reazione. Il protocollo di diluizione impiega una breve fase di pre-incubazione prima della PCR per rilasciare DNA dal materiale campione.

Figura 2. Genotipizzazione di individui di piante di Arabidopsis con tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. A) La figura 2A mostra il principio del dosaggio dCAPS eseguita. Il sito di restrizione all'interno del SNP di interesse o è introdotto o rimosso mediante PCR usando un primer con uno o più mismatch al DNA bersaglio. I prodotti di PCR vengono digeriti e i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo se analizzato mediante elettroforesi. B) 0.50 punzoni mm a partire da foglie delle piante sono state poste direttamente in 50 pl reazioni PCR. I prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP (G o A allele) sono state amplificate con primer introdurre un sito unico SspI A-allele. I prodotti PCR erano purificati digestioneta con l'enzima di restrizione SspI. Frammenti risultanti sono stati analizzati su un gel di agarosio al 3%. Corsia M è il marcatore di formato; corsie A e G corrispondono alle alleli SNP di ciascun campione. I risultati ottenuti sono stati confermati mediante analisi convenzionale di estrazione di DNA seguita da PCR e digestione di restrizione (dati non mostrati). Le reazioni di controllo negativo senza DNA stampo sono stati inclusi nella prova impostare ed eseguire su un gel di agarosio separata in parallelo con le reazioni reali PCR prima di eseguire le digestioni (dati non mostrati).

Figura 3. Protocollo di diluizione usando campioni di foglie di quercia. Il protocollo di diluizione è stato usato per amplificare il frammento di 297 bp di DNA cloroplastica in campioni di foglie di quercia (3-step protocollo, annealing a 62 ° C) a varie diluizioni (1:100, 1:10, 1 : 1 e 2:1) e con positivo e negativotrolli [C +: controllo positivo da DNA purificato (Arabidopsis),-C: controllo negativo senza DNA template]. La nomenclatura campione rappresenta il sito di raccolta del campione (città in Finlandia) e il campione di numerazione.

Figura 4. Genotipizzazione di topi transgenici con una coppia di primer utilizzando il protocollo di diluizione. Tessuti dell'orecchio di nove singoli topi (corsie 1-9) sono stati posti in 20 ml di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease. Dopo incubazione a temperatura ambiente e 98 ° C, 1 ml di surnatante è stato utilizzato come stampo nella reazione di 20 microlitri PCR. Frammento dimensioni: 1,500 bp (transgenici) e 200 bp (tipo selvatico).

Figura 5. Campioni preparati secondo il protocollo di diluizione sono stabili allo stoccaggio a lungo termine. Campioni di tessuti dell'orecchio topo erano inc ubated in 20 pl di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease e sottoposto a ripetuti di congelamento / scongelamento (corsia 1), conservato a -20 ° C per un anno (corsia 2), o usato immediatamente per PCR (corsia 3). Le dimensioni dei frammenti amplificati sono stati 900 bp, 1500 bp e 3200 bp.

Figura 6. Phire Animal Tissue PCR diretta Kit supera un sistema commerciale di purificazione del DNA combinato con un caldo inizio Taq DNA polimerasi. Quattro ampliconi (0,5-1,5 kb) sono stati amplificati da tessuti dell'orecchio del mouse utilizzando il protocollo di diluizione di Animal Tissue Phire Kit Direct PCR. Per confronto, il DNA è stato purificato usando un kit commerciale di estrazione del DNA e gli stessi frammenti sono stati amplificati usando un hot start Taq DNA polimerasi secondo le raccomandazioni del produttore. Solo con l'animale Phire Tissue diretto PCR Kit sono stati tutti e quattro gli ampliconi con successo amplificati.

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Figura 7. Confronto universale del flusso di lavoro con stima dei tempi / reagenti consumati. Thermo Scientific diretto approccio PCR è rispetto all'approccio isolamento del DNA, l'approccio tampone di estrazione, e l'approccio tampone PCR. Il tempo previsto per ogni approccio prima della fase di PCR è elencato in rosso. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR richiede solo 0-4 min per la preparazione del campione prima della PCR. Sotto ogni metodo, i reagenti consumati sono elencati. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR utilizza la minor quantità di reagenti rispetto agli altri metodi. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussione

L'approccio diretto PCR ha dimostrato qui permette l'amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, riducendo il tempo necessario e la semplificazione del flusso di lavoro per piante e animali genotipizzazione (Figura 7). Dimostrato anche qui è l'uso del protocollo di diluizione in combinazione con l'approccio diretto PCR (Figura 3). Il protocollo di diluizione è raccomandato con campioni difficili (ad esempio foglie delle piante di età, specie di piante che contengono composti interferenti) o lunghi (o GC-ricchi) ampliconi. Questo protocollo è particolarmente utile quando si inizia un nuovo esperimento diretto PCR, consentendo l'ottimizzazione della reazione. Il protocollo può servire come strumento per risolvere le difficoltà occasionali come basse rese di prodotto a causa di differenze di materiale tissutale e / o primer utilizzati. Inoltre, durante l'esecuzione di reazioni multiple dallo stesso campione, l'utilizzo del protocollo di diluizione assicura l'intero campione non è consumata in unoreazione.

Per purificare il DNA dalle piante per PCR, la convenzione era effettuare la lisi cellulare seguito da isolamento del DNA utilizzando vari componenti che potrebbero interferire con l'analisi PCR ^8. Per impianti particolarmente impegnative, con elevato contenuto fenolico, aggiunta di polivinilpirrolidone è stata tradizionalmente utilizzata per rimuovere i composti che si legano al DNA dopo lisi cellulare ^2,5. Come evidente qui, questi complicati e intensità passi possono essere evitati mediante utilizzo dell'impianto Phire diretto PCR Kit per rilevare il DNA bersaglio. Lisi cellulare e la procedura di isolamento del DNA può essere omesso utilizzando le tecniche dCAPS sensibili direttamente da foglie di piante di Arabidopsis (Figura 2). Come dimostrato qui, il protocollo di diluizione gestisce efficacemente la presenza di componenti problematici che possono interferire con PCR (Figura 3).

Tradizionalmente, un prerequisito per gli animali genotipizzazione era isolatisu di DNA genomico da tessuti animali attraverso un tossico, lungo processo caratterizzato da una lunga incubazione con proteinasi K per digerire tessuto cutaneo e connettivo, seguita da estrazione con solvente organico, precipitazione alcol, e le fasi di centrifugazione ^6,9,10. Come dimostrato qui, la semplificazione di questo processo è realizzato attraverso l'uso del Animal Phire Tissue diretto PCR Kit, permettendo topi transgenici da genotipizzare senza purificazione DNA prima (Figura 4). L'esempio illustrato in questo articolo è particolarmente importante in quanto solo una serie di primer è stata usata per l'amplificazione dei due frammenti con una differenza di grandi dimensioni. Nonostante difficoltà innata del protocollo, l'uso del metodo diretto PCR in combinazione con il protocollo semplice diluizione provocato alte rese dei due prodotti di PCR (Figura 4).

PCR-based rilevazione del DNA bersaglio ha molte applicazioni nel campo della ricerca, tra cui analisi del genotipo per identificareil ruolo dei geni nello sviluppo, fisiologia e patologia. A causa della tolleranza inibitore delle DNA polimerasi specializzate, i protocolli possono essere completata in un tempo minimo senza purificazione DNA prima.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Phire Pianta diretto PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F-130	200 reazioni (50 microlitri ciascuna)
Phire Animal Tissue PCR diretta Kit	Thermo Fisher Scientific	F-140	200 reations (50 microlitri ciascuno)
Harris Uni-Core 0,35 mm (rosa)	Thermo Fisher Scientific	F-180S / L	Qtà: 5/25
Harris Uni-Core 0.50 mm (blu)	Thermo Fisher Scientific	F-185S / L	Qtà: 5/25
Harris taglio Mat 6,4 × 7,6 centimetri	Thermo Fisher Scientific	F-190	Qtà: 5
SspI	Thermo Fisher Scientific	ER0771	100 pl (100 reazioni)
Piko 24 Well termociclatore	Thermo Fisher Scientific	TCP0024
24 pozzetti Piko Piastre PCR	Thermo Fisher Scientific	SLP0241
GeneJET PCR Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	K0701 K0702	50 prep 250 prep