Esecuzione Lavage vaginale, di colorazione viola di cristallo, e la valutazione citologica vaginale per l'identificazione ciclo estrale Staging mouse

Riepilogo

Qui, descriviamo come identificare lo stadio della murino riproduttiva (proestro, estro, metestrus o diestro) per semplice, non invasivo raccolta e la valutazione citologica di campioni di striscio vaginale. Abbiamo inoltre descritto come citologia vaginale riflette livelli circolanti ormonali alla base di transizione attraverso il ciclo riproduttivo murino.

Abstract

Un mezzo rapido di valutare lo stato riproduttivo nei roditori è utile non solo nello studio della disfunzione riproduttiva, ma è necessario anche per la produzione di nuovi modelli murini di malattia e indagini nella regolazione ormonale della degenerazione del tessuto (o rigenerazione) dopo sfida patologica. Il murino riproduttiva (o estro) ciclo è diviso in 4 fasi: proestro, estro, metestrus e diestro. Fluttuazioni definiti dei livelli circolanti degli steroidi ovarici 17-β-estradiolo e progesterone, le gonadotropine luteinizzante e follicolo ormoni stimolanti, e la transizione di ormone prolattina luteotropic segnale attraverso queste fasi riproduttive. Variazioni tipologia delle cellule all'interno del canale vaginale murino riflettere questi eventi endocrini sottostanti. Valutazione giornaliera del rapporto relativo nucleate cellule epiteliali, cellule epiteliali squamose cornified, e leucociti presenti negli strisci vaginali può essere utilizzato per identificare estrale murinefasi. Il grado di invasività, però, impiegato nella raccolta di questi campioni possono alterare lo stato riproduttivo e provocare una risposta infiammatoria che può confondere la valutazione citologica di strisci. Qui, descriviamo un semplice, non invasivo protocollo che può essere utilizzato per determinare la fase del ciclo estrale di un topo femmina senza alterare il suo ciclo riproduttivo. Ci dettaglio come distinguere tra le quattro fasi del ciclo estrale di raccolta e l'analisi della tipologia cellula predominante negli strisci vaginali e si mostra come questi cambiamenti possono essere interpretati in relazione allo stato endocrino.

Protocollo

1. Reagenti Preparazione

1. Per sterile lavanda vaginale, autoclave acqua bidistillata (DDH ₂ O) e conservare in un contenitore ermeticamente chiuso a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
2. Per la valutazione citologica, aggiungere 0,1 g di polvere cristalvioletto a 100 ml di DDH ₂ O. Mescolare bene. Cristalvioletto macchia (0,1%) può essere conservato in un contenitore ermeticamente sigillato a temperatura ambiente fino a quando necessario.

2. Raccolta di cellule vaginali (Lavage vaginale)

1. Posizionare una lampadina lattice sulla fine di una sterile 200 microlitri punta e di elaborare circa 100 ml di sterile DDH ₂ O utilizzando le gradazioni sulla punta come linea guida del volume.
2. Sollevare il mouse fuori dalla sua gabbia e metterla sulla tramoggia gabbia (coperchio) con la sua estremità posteriore / posteriore verso di voi.
3. Afferrare saldamente la coda e sollevare la parte posteriore. Il mouse avrà ora solo le zampe anteriori afferrare la tramoggia. A questo punto il mouse può urinare. Se è così, Attendere fino a quando si ferma minzione. In caso di urina a sinistra all'ingresso del canale vaginale, si consiglia di sciacquare l'apertura con eccesso di DDH ₂ O con una punta separato (cioè, non la punta del prelievo del campione).
4. Posizionare l'estremità del ₂ DDH O pieno di punta all'apertura del canale vaginale, avendo cura di non penetrare l'orifizio vaginale come (e cervicale), la stimolazione può indurre pseudogravidanza nei ratti ^1,2. Rapporti recenti suggeriscono i topi sono meno sensibili a questo effetto comunque si dovrebbe aver cura di ridurre al minimo il grado di invasività in analisi ripetute ^3.
5. Delicatamente premere lo stantuffo per espellere un quarto alla metà del volume di acqua (~ 25-50 microlitri) in apertura del canale vaginale. Il liquido spontaneamente aspirare nel canale di inserimento senza punta. Rilasciare lentamente la pressione esercitata sul bulbo. Il fluido si ritirerà nuovamente dentro la punta. Evitare pressione rilasciando troppo velocemente per evitare l'aspirazione di liquidonel bulbo. Una punta filtrata può essere utile a questo scopo.
6. Ripetere i tempi delle fasi precedenti 4-5 usando la punta stessa, bulbo, e fluido per ottenere un numero sufficiente di cellule in un singolo campione.
7. Posizionare il fluido sul vetrino, e consentire l'striscio asciugare completamente a temperatura ambiente. Una volta asciutto, questi strisci estro può essere colorato immediatamente o conservate e colorate in un secondo momento.

3. Colorazione citologica utilizzando Crystal Violet * ⁴

1. Posizionare il vetrino a secco in una vaschetta Coplin (o da altro vaso colorazione simile) contenente il cristalvioletto colorare per 1 min.
2. Rimuovi per un barattolo secondo Coplin contenente DDH ₂ O. Lavare il vetrino con DDH ₂ O per 1 min. Ripeti.
3. Rimuovere l'eccesso DDH ₂ O dai bordi del vetrino con leggeri tergicristallo tessuto, evitando il contatto con lo striscio colorato.
4. Pipettare circa 15 ml di glicerolo in cima al coperchio e striscioscivolare. In alternativa, altri reagenti istologici di montaggio può essere utilizzata per ottenere un più permanente, non-diffondente macchia.

* Il metodo di colorazione qui descritto è il più semplice procedura che può essere eseguita in qualsiasi laboratorio. Altri metodi in grado di fornire ulteriori dettagli. Ad esempio, utilizzando la colorazione Papanicolaou, la maturità di nucleate cellule epiteliali possono essere distinti con le cellule meno mature le cellule colorate con turchese e più maturi rosa o arancione-macchiati. Queste differenze possono essere utilizzati per organizzare proestrus presto o tardi. ⁴

4. Citologia Vaginale

1. Esaminare lo striscio al microscopio ottico per determinare i tipi di cellule presenti. Esame microscopico dovrebbe essere fatto immediatamente dopo colorazione come cristalvioletto diffonderà dalle cellule nel tempo quando si utilizza glicerolo per coprioggetto. Microfotografie deve essere assunto al momento di analisi per documentare citologia.
2. Iniziamo ad esaminare la entirstriscio e con un ingrandimento inferiore. Selezionare un'area rappresentativa e passare a un ingrandimento maggiore. Vedrete cornified squamose cellule epiteliali, leucociti, e / o nucleate cellule epiteliali (risultati rappresentativi, Figura 1A-C). Il rapporto tra presente cellule vi permetterà di determinare la fase estrale del mouse al momento del prelievo del campione (risultati rappresentativi, figura 1D-G) e il suo stato ormonale immediata (discussione, Figura 2).

5. Risultati rappresentativi

Citologia: Tre tipi cellulari primarie può essere rilevato in campioni di striscio vaginale: (1) nucleate cellule epiteliali (Figura 1A), (2) cornified cellule epiteliali squamose (Figura 1B), e (3) leucociti (Figura 1C). Nucleate cellule epiteliali hanno un citoplasma poco sporca, più scuro macchiato membrana plasmatica, e un nucleo ovale ( Figura 1A). Cornified cellule epiteliali squamose sono uniformemente macchiato, più poligonale loro predecessori nucleate epiteliali, e mancanza di un nucleo (Figura 1B). Leucociti polimorfonucleati può essere distinto da cellule epiteliali dalla loro forma irregolare, scuro macchiato nuclei polimorfi, e le piccole dimensioni (Figura 1C, frecce nere). Contaminazione dovrebbe essere presente nelle urine striscio, cristalli di acido urico sono prontamente rilevato dalle loro strutture cristalline dissimili a qualsiasi tipo di cella attesi (Figura 3). In questo caso, e la rilevazione oscura di tipo cellulare predominante, lo striscio deve essere eliminato e non utilizzati a scopo di stadiazione.

Staging: Il rapporto relativo di tipi di cellule osservate negli strisci può essere utilizzato per identificare la fase del ciclo estrale del mouse, il giorno della raccolta del campione (Figura 1D-G). Durante proestro, le cellule sono quasi esclusivamentegruppi di rotondo, ben formato nucleate cellule epiteliali (Figura 1D, cellula rappresentante indicato dalla freccia bianca). Durante l'estro, le cellule sono prevalentemente cornified cellule epiteliali squamose, presenti in gruppi densamente (Figura 1E, cellula rappresentante indicato dalla freccia). Durante metestrus, piccoli leucociti scuro macchiato predominano (Figura 1F, cella rappresentante indicato dalla freccia nera). Corneo cellule epiteliali squamose possono essere osservati, spesso in frammenti, (Figura 1F, cellula rappresentante indicato dalla freccia nera). Durante il diestro, cornified rare cellule epiteliali squamose possono essere ancora presenti (Figura 1G, cella rappresentante indicato dalla freccia nera), ma ancora predominano leucociti (Figura 1G, cella rappresentante indicato dalla freccia nera). Metestrus può essere distinto da diestro dalla comparsa di cellule nucleate epiteliali in diestro ( g> Figura 1G, cellula rappresentante indicato dalla freccia bianca).

Figura 1. Valutazione citologica di strisci vaginali può essere utilizzato per identificare fase estrale tre tipi principali di cellule vengono rilevati in campioni di striscio vaginale:. (A) nucleate cellule epiteliali, (B) cornified cellule epiteliali squamose, e (C) leucociti. Il rapporto di questi tipi di cellule presenti nel striscio può essere utilizzato per identificare in topi (D) proestrus, (E) estro, (F) metestrus, o (G) come descritto in diestro risultati rappresentativi. Punte di freccia nere in E, F e del punto G alla rappresentanza cornified cellule epiteliali squamose. Frecce nere in C, F e del punto G alla leykocytes rappresentativi. Frecce bianche in D e rappresentante evidenziare G nucleate cellule epiteliali.

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Figura 2. Citologia striscio vaginale riflette eventi endocrini sottostanti. Dettagli sono forniti anche in discussione. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Cristalli di acido urico possono essere presenti di colorazione viola cristallo di urina-campioni contaminati. (A) I cristalli sono trasparenti e possono essere di varie dimensioni (frecce e regione scatola ingrandite in (B)). Nessun cellule sono presenti in questo campo. Dovrebbe contaminazione cristallo acido urico entro campi usati per la colorazione citologica essere presente, può essere difficile identificare con precisione tipi di cellule presenti e lo striscio deve essere scartato. Barre di scala = 50 micron.

Discussione

Questi cambiamenti nella tipologia cellule sono indicativi di eventi endocrini sottostanti. La fase proestro del ciclo estrale corrisponde alla fase follicolare umano del ciclo mestruale e ⁵ è definito da un pre-ovulatoria aumento circolanti 17-β-estradiolo livelli ^6, nonché un aumento piccolo prolattina ⁷ (figura 2, proestro, pannello di sinistra). L'incremento 17-β-estradiolo stimola indirettamente gonadotropina-releasing ormone neuroni dell'ipotalamo e setto che, a loro volta, attivano cellule responsive nella pituitaria anteriore per rilasciare l'ormone luteinizzante e ormone follicolo-stimolante nella circolazione ^8,9 (figura 2 , proestro, pannello di sinistra). In strisci vaginali prelevati da animali in proestro, le cellule sono cellule nucleate quasi esclusivamente ovali epiteliali (Figura 1D, Figura 2, proestro, pannello di destra). Il picco nel follicolo-stimolante HORMuno dei livelli dei segnali l'ovulazione e l'entrata in estro ^10,11. Durante l'estro, 17-β-estradiolo livelli di livelli di prolattina e declino di picco ^6,7 (Figura 2, Estrus, pannello di sinistra). Strisci vaginali sono caratterizzati da rilevamento quasi esclusivo di forma irregolare cornified cellule epiteliali squamose spesso in ciuffi (Figura 1E, Figura 2, Estrus, pannello di destra). Entrata in metestrus coincide con un continuo aumento dei livelli dell'ormone progesterone ⁶ e corrisponde all'inizio della fase luteale umano ¹² (Figura 2, Metestrus, pannello di sinistra). Come i livelli di progesterone inizia a salire e c'è un piccolo aumento in 17-β-estradiolo livelli in risposta all'attivazione del corpo luteo ^6,13,14 (Figura 2, Metestrus, pannello di sinistra). I tipi di cellule presenti in strisci vaginali durante questa fase sono frammentate, le cellule epiteliali e leucociti cornified più scure più piccoli colorati (Figure 1F, Figura 2, Metestrus, pannello di destra). Infine, entrata in diestro in topi verifica e livelli circolanti progesterone picco ^6, corrispondente alla fase tardiva umana luteale ^12. Regressione del corpo luteo porta ad una conseguente diminuzione forte livelli di progesterone ^15,16 (Figura 2, diestro, pannello di sinistra). Leucociti predominano negli strisci durante diestro. La frequenza di cornified cellule epiteliali è ridotto e nucleate cellule epiteliali iniziano a essere rilevato appena prima transizione proestrus (Figura 1G, Figura 2, diestro, pannello di destra).

In sintesi, questo semplice protocollo di routine può essere utilizzato per stimare quotidiane fluttuazioni ormonali e stabilire fase estrale nei topi sperimentali, senza alterare lo stato riproduttivo se le seguenti precauzioni vengono prese. Il campionamento deve essere effettuato non più di una volta al giorno utilizzando il protocollo non invasivo described qui rispetto alla penetrazione ripetuta del canale vaginale, l'aspirazione, e agitazione. Questo può causare irritazione vaginale, un ¹⁷ risposta infiammatoria conseguente leucociti e altri tipi di cellule di essere presente in strisci che possono confondere valutazione citologica. Inoltre, anche in colonie alloggiati femmine, è normale vedere diestro estesi e le fasi di estro nei topi diversi, come pure l'induzione di anestrous ¹⁸ e questa identificazione è utile per l 'interpretazione di impatto ormonale riproduttiva, il sesso e gli studi sulle malattie. La variabilità della durata del ciclo viene introdotto anche con l'età e con le differenze degli alloggi nelle colonie (individuale o di gruppo-housing) di femmine ^7,19-21. Le femmine alloggiati nelle donne solo colonie può cessare in bicicletta e in uno stato di prolungato diestro ^18,22,23, anche se il ciclismo può essere ripristinato in caso di esposizione a gabbie pretrattati con urina maschile per suscitare ciclismo ^24,25. Pertanto, per stabilire individuadurata del ciclo l per un mouse dato, si raccomanda che le valutazioni non invasive descritte qui effettuata giornalmente, con cura, fino a due cicli completi si osservano.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Catalogo #
Sterili 200 puntali pl	DiaMed	E340901
Lattice lampadina (1 ml)	Pescatore	03-488-21
Vetro microscopio diapositive	Pescatore	12-550-15
Crystal Violet macchia (25 g)	Pescatore	C581-25
Leggeri tessuti Panni	VWR	82003-820
Glicerina	Pescatore	BP229-1
Microscopio di vetro di copertura (22x30)	Pescatore	12-544A