Выполнение промывание влагалища, кристаллический фиолетовый окрашивания и вагинальные цитологические Оценка для мыши эстрального идентификации Постановка цикла

Резюме

Здесь мы расскажем, как определить стадию мышиный репродуктивного (проэструса, течки, metestrus, или диэструса) простой, неинвазивный сбор и оценка цитологических образцов вагинального мазка. Кроме того, мы опишем, как вагинальной цитологии отражает гормональные уровни циркулирующих лежащие в основе перехода через мышиный репродуктивного цикла.

Аннотация

Быстрое средство оценки состояния репродуктивного у грызунов полезен не только в изучении репродуктивной дисфункции, но также необходим для производства новой модели мыши болезни и исследования в гормональной регуляции тканей дегенерации (или регенерации) после патологические проблемы. Мышиный репродуктивного (или течки) цикл делится на 4 этапа: проэструса, течки, metestrus, и диэструса. Определенные колебания уровня циркулирующих стероидов яичников 17-β-эстрадиола и прогестерона, гонадотропина лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, и luteotropic гормона пролактина сигнала перехода через эти репродуктивного этапа. Изменения в клетку типологии в мышиной вагинального канала отражают эти основные события внутренней секреции. Ежедневная оценка относительного соотношения ядерных эпителиальных клеток, ороговевших клеток плоского эпителия и лейкоцитов присутствует в вагинальных мазках могут быть использованы для выявления мышиных эстральногоэтапов. Степень инвазивности, однако, занятых в сборе этих образцов может изменить репродуктивный статус и вызывают воспалительную реакцию, которая может посрамить цитологической оценке мазков. Здесь мы рассмотрим простой, неинвазивный протокол, который может быть использован для определения стадии эстрального цикла женщины мыши без изменения ее репродуктивного цикла. Мы подробно, как различать четыре стадии эстрального цикла сбора и анализа преобладающей типологии ячейки в влагалищные мазки и мы покажем, как эти изменения могут быть интерпретированы по отношению к эндокринным статусом.

протокол

1. Подготовка реагентов

1. Для стерильной промывание влагалища, автоклав дважды дистиллированной воде (DDH ₂ O) и хранить в плотно закрытой посуде при комнатной температуре, пока это необходимо.
2. Для цитологической оценки, добавляют 0,1 г порошка кристаллического фиолетового до 100 мл DDH ₂ O. Все хорошо перемешать. Кристаллический фиолетовый пятно (0,1%) могут быть сохранены в плотно закрытой посуде при комнатной температуре, пока это необходимо.

2. Сбор вагинальные клетки (промывание влагалища)

1. Поместите латекса лампочка на конце стерильный 200 мкл наконечник и составляет примерно 100 мкл стерильной DDH ₂ O помощью градации на кончике как объем руководства.
2. Поднимите мышь из своей клетки и поместить ее в бункер клетки (крышки) с ее задние / задней по отношению к вам.
3. Крепко возьмитесь за хвост и поднять заднюю часть. Мыши теперь будет только ее передние лапы захвата бункера. В этот момент мышь может помочиться. Раз так, Подождите, пока мочеиспускание прекращается. Должны ли быть моча оставили у входа в вагинальный канал, вы можете промыть открытия с избыточным DDH ₂ O помощью отдельного наконечник (т. е. не ваши пробы совет).
4. Поместите конец DDH ₂ O заполненные чаевых на открытие влагалища заботясь, чтобы не проникают в отверстия, как вагинальный (и шейки) стимуляция может вызвать ложная беременность у крыс ^1,2. Последние сообщения свидетельствуют о мышах менее подвержены этот эффект тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы минимизировать степень инвазии при повторных анализах ^3.
5. Слегка нажмите на лампу, чтобы изгнать четверти до половины объема воды (~ 25-50 мкл) на открытии вагинальный канал. Жидкость самопроизвольно аспирации в канал без наконечника вставки. Медленно отпустите давление на лампочку. Жидкость уйдет обратно в чаевых. Избегайте выпуская давление слишком быстро для предотвращения аспирации жидкостив луковицу. Фильтруют чаевые могут быть полезны для этой цели.
6. Повторите предыдущий шаг в 4-5 раз, используя тот же совет, лампы, жидкости и получить достаточное количество клеток в одном образце.
7. Поместите жидкости на стекло, и позволяют мазка, чтобы полностью высохнуть при комнатной температуре. После высыхания, эти эстрального мазков могут быть окрашены сразу или хранить и окрашивают в более поздние сроки.

3. Цитологическое окрашивание использованием Crystal Violet * ⁴

1. Поместите сухой слайд в банке Коплин (или других аналогичных судна окрашивание), содержащих кристаллический фиолетовый пятном в течение 1 мин.
2. Удалить ко второму банку Коплин содержащие DDH ₂ O. Вымойте слайды с DDH ₂ O в течение 1 мин. Повторить.
3. Удалите излишки DDH ₂ O от края слайда с легких тканей стеклоочистителя, избегая контакта с окрашенного мазка.
4. Внесите примерно 15 мкл глицерина в верхней части мазка и крышкискользить. Кроме того, другие гистологические монтажа реагенты могут быть использованы для получения более постоянного, не диффундирующего пятно.

* Окрашивания методом, описанным здесь является простейшей процедурой, которая может быть выполнена в любой лаборатории. Другие методы могут дать дополнительную информацию. Например, с помощью окрашивания по Папаниколау, зрелость ядерные эпителиальные клетки могут быть выделены с менее зрелых клеток, окрашенных бирюзовых и более зрелые клетки розового или оранжево-окрашенные. Эти различия могут быть использованы на сцену рано или поздно проэструса ^4.

4. Вагинальные цитологии

1. Изучите мазок под световым микроскопом, чтобы определить типы клеток присутствуют. Микроскопическое исследование должно быть сделано сразу после окрашивания, как кристаллический фиолетовый будет диффундировать из клеток с течением времени при использовании глицерина для coverslipping. Микрофотографии должны быть приняты во время анализа к документу цитологии.
2. Начните с изучения entirэлектронной мазок на более низком увеличении. Выберите представитель площадь и перейти на более высокий увеличения. Вы увидите рогового эпителиальных клеток, лейкоцитов, и / или ядерные эпителиальные клетки (представительных результатов рис. 1А-C). Отношение настоящее клеток позволит вам определить эстрального этап вашей мыши в момент взятия пробы (представительных результатов, Рис. 1D-G) и ее ближайших гормонального статуса (обсуждение, рисунок 2).

5. Представитель Результаты

Цитология: Три основных типа клеток могут быть обнаружены в образцах мазков вагинального: (1) ядерные эпителиальные клетки (рис. 1а), (2) рогового клеток плоского эпителия (рис. 1б), и (3) лейкоциты (рис. 1С). Ядросодержащих эпителиальные клетки имеют слегка окрашенные цитоплазмы, темнее окрашенный плазматической мембраны, и овальные ядра ( рис. 1А). Ороговевших клеток плоского эпителия равномерно окрашенные, более полигональной формы, чем их ядерные эпителиальные предшественников, и не имеют ядра (рис. 1б). Полиморфноядерных лейкоцитов можно отличить от эпителиальных клеток, их неправильной формы, темно окрашенные полиморфными ядрами, и небольшого размера (рис. 1С, черные стрелки). Если моча загрязнения присутствовать в мазке, кристаллы мочевой кислоты легко обнаружить их кристаллической структуры отличаются от любых ожидаемых типов клеток (рис. 3). Если это произойдет, и неясно выявление преобладающего типа клеток, мазок должен быть отброшен и не используется для постановки целей.

Постановка: относительное соотношение типов клеток наблюдается в мазках могут быть использованы для определения стадии эстрального цикла мышь в день взятия пробы (рис. 1D-G). Во время проэструса, клетки почти исключительнокластеров круглые, хорошо сформированные зарождаются эпителиальные клетки (рис. 1D, представитель ячейки указывает белая стрелка). Во время течки, клетки рогового преимущественно эпителиальных клеток, присутствующих в плотно упакованных кластеров (рис. 1E, представитель ячейки указано стрелкой). Во время metestrus, небольшие темно окрашенных лейкоцитов преобладают (рис. 1F, представитель ячейки указывает черная стрелка). Ороговевших клеток плоского эпителия может наблюдаться, часто фрагментов (рис. 1F, представитель ячейки обозначены черными стрелка). Во время диэструса, редкие ороговевших клеток плоского эпителия могут все еще ​​присутствовать (рис. 1G, представитель ячейки обозначены черными стрелки), однако по-прежнему преобладают лейкоциты (рис. 1G, представитель ячейки указывает черная стрелка). Metestrus можно отличить от диэструса появление ядерных эпителиальных клеток в диэструса ( г> Рисунок 1G, представитель ячейки указывает белая стрелка).

Рисунок 1. Цитологическое оценки влагалищных мазков может быть использована для идентификации эстрального этапе три основных типа клеток обнаружены в вагинальных образцах мазков.: (A) ядерные эпителиальные клетки, (B) ороговевших клеток плоского эпителия, и (C) лейкоцитов. Соотношение этих типов клеток, присутствующих в мазке может быть использована для идентификации мышей (D) проэструса, (E) течки, (F) metestrus, или (G) диэструса, как описано в представительные результаты. Черные стрелки в E, F и G указывают на представителя ороговевших клеток плоского эпителия. Черные стрелки на C, F и G указывают на представителя leykocytes. Белые стрелки D и G выделить представителя зарождаются эпителиальных клеток.

. JPG "ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Вагинальная цитология мазков отражает основные события внутренней секреции. Подробная информация также предоставляется в дискуссии. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Кристаллов мочевой кислоты может присутствовать следующие окрашивания кристаллическим фиолетовым мочи загрязненные образцы. (A) Кристаллы прозрачны и могут быть различных размеров (стрелки и коробку регионе увеличиваются в (B)). Нет клетки присутствуют в этой области. Если мочевой кислоты кристаллов загрязнение в пределах полей, используемых для окрашивания цитологических присутствовать, это может быть трудно точно идентифицировать типы клеток, настоящее и мазок должен быть уничтожен. Шкала баров = 50 мкм.

Обсуждение

Эти изменения в клетке типологии свидетельствует о лежащих в основе событий эндокринной системы. Проэструса фазы эстрального цикла соответствует человеческой фолликулярной фазе менструального цикла ⁵ и определяется предовуляционного увеличение циркулирующих 17-β-эстрадиола уровнях ^6, а также небольшой всплеск в пролактина ⁷ (рис. 2, Проэструс, левая панель). Увеличение в 17-β-эстрадиола косвенно стимулирует гонадотропин-рилизинг гормона нейронов в гипоталамусе и перегородки, что, в свою очередь, активируют реактивных клеток в передней доле гипофиза, чтобы выпустить лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона в обращение ^8,9 (рис. 2 , Проэструс, левая панель). В влагалищных мазков, взятых у животных в проэструсе, клетки почти исключительно овальной ядерные эпителиальные клетки (рис. 1D, на рисунке 2, Проэструс, правая панель). Пик фолликулостимулирующего Hormодна уровни сигналов овуляции и вступления в эструс ^10,11. Во время течки, 17-β-эстрадиола и снижение уровня пролактина пика ^6,7 (рис. 2, течки, левая панель). Вагинальные мазки характеризуются почти исключительно обнаружения неправильной формы ороговевших клеток плоского эпителия, часто в сгустки (рис. 1E, на рисунке 2, течки, правая панель). Вступление в metestrus совпадает с непрерывным ростом уровня гормона прогестерона ⁶ и соответствует началу человеческой лютеиновой фазы ¹² (рис. 2, Metestrus, левая панель). Как уровень прогестерона начинает расти, и есть небольшой всплеск в 17-β-эстрадиола уровнях в ответ на желтое тело активации ^6,13,14 (рис. 2, Metestrus, левая панель). Типов клеток, присутствующих в влагалищные мазки на этом этапе носят фрагментарный характер, ороговевших клеток эпителия и меньше темных окрашенных лейкоцитов (Figurэлектронной 1F, на рисунке 2, Metestrus, правая панель). Наконец, вступление в диэструса у мышей происходит и оборотных уровень прогестерона пик ^6, что соответствует человеческой поздней лютеиновой фазе ^12. Регрессии желтого тела приводит к последующим резким снижением уровня прогестерона ^15,16 (рис. 2, диэструса, левая панель). Лейкоциты преобладают в мазках в течение диэструса. Частота ороговевших эпителиальных клеток уменьшается, и зарождаются эпителиальные клетки начинают быть обнаружены непосредственно перед переходом к проэструса (рис. 1G, на рисунке 2, диэструса, правая панель).

Таким образом, эта простая, рутинная протокол может быть использован для оценки ежедневно гормональные колебания и установить эстрального этапе в экспериментальных мышей без изменения репродуктивного статуса, если выполнены следующие меры предосторожности. Отбор проб должен проводиться не более чем один раз в день помощью неинвазивных протокол по убываниюribed здесь по сравнению с повторял проникновение влагалища, стремление и агитации. Это может вызвать вагинальное раздражение в результате воспалительных ¹⁷ ответов в результате лейкоциты и другие типы клеток, присутствуют в мазках, которые могут посрамить цитологической оценки. Более того, даже в колонии-размещался женщин, это нормально, чтобы увидеть расширенную диэструса и течки этапах в разных мышей, а индукция anestrous ^18, и эта идентификация является полезной в интерпретации гормонального влияния на репродуктивную, пол, и болезнь исследования. Изменчивость длины цикла вводится также с возрастом и жилье различия внутри колонии (индивидуальные или групповые жилья) самок ^7,19-21. Женщины размещаются в женских колониях только может прекратить езда на велосипеде и войти в состояние длительной диэструса ^18,22,23, хотя езда на велосипеде может быть восстановлено путем воздействия на клетки предварительно с мужской мочи, чтобы выявить велосипедных ^24,25. Таким образом, чтобы установить индивидовл длины циклов для данной мыши, рекомендуется неинвазивной оценки, описанные здесь, выполняемые ежедневно, с осторожностью, до двух полных циклов не наблюдается.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Catalogue #
Стерильные 200 мкл наконечники	Диамед	E340901
Латекс лампа (1 мл)	Рыбак	03-488-21
Предметные стекла микроскопа	Рыбак	12-550-15
Crystal Violet пятно (25 г)	Рыбак	C581-25
Легкие ткани стеклоочистители	VWR	82003-820
Глицерин	Рыбак	BP229-1
Микроскоп покровного стекла (22x30)	Рыбак	12-544A